人參提取物脅迫培養對副干酪乳桿菌JLUs66 菌株生長特性及耐受性的影響

董舒月，朱梓燚，楊 濤，冀瑤瑤，刁夢雪，葉海青，張鐵華

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春 130062）

乳酸菌在提升發酵食品的風味、改善機體胃腸道生態環境、提高宿主免疫力等方面具有顯著的功效[1?3]，現已廣泛應用于食品、藥品、飼料等領域[4?5]。人參作為百草之王，其抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用已被充分挖掘，尤其在提高人體抗應激能力方面具有重要的調節作用[6?9]。乳酸菌存在著保藏周期短、環境耐受性不強等缺點，限制了應用效果和應用范圍，因此，提高乳酸菌環境耐受性成為了當下的研究熱點，特別是低溫、高溫、低pH、高膽鹽及高鹽條件對乳酸菌存活率的影響。前期研究表明，人參提取物在酸奶發酵過程中對乳酸菌的發酵特性存在一定的影響[10]，但人參提取物對乳酸菌的生存能力及抗應激性的影響并未有研究報道。

乳酸菌在其生長環境發生改變時，細胞本身會通過多種適應機制對脅迫信號做出反應，如胞外多糖合成量的改變、多種脅迫相關基因的表達[11]，從而發生一定的應激能力，保護細胞免受外界環境的刺激[12]，而產生的這種應激能力又影響著乳酸菌對其他不良環境的抵抗能力，出現交叉保護的現象[13]。通過利用乳酸菌的交叉保護現象，可以影響其菌株生長特性及環境耐受性等生存能力。

副干酪乳桿菌JLUs66 具有顯著的降膽固醇功能[14]，良好的菌株特性及環境耐受性是其發揮活性的重要前提。本研究以副干酪乳桿菌JLUs66 為研究對象，考察了在培養基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的生長曲線、活菌數、產酸能力、產胞外多糖能力及其低溫耐受性、高溫耐受性、低pH 耐受性、膽鹽耐受性和NaCl 耐受性，探究了在培養基中添加不同濃度的人參提取物對脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的菌株生長特性及耐受性的影響。本研究闡述了人參提取物對乳酸菌環境適應性的變化規律，為提高乳酸菌菌株耐受性提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌JLUs66 吉林大學食品科學與工程學院實驗室保藏；人參提取物（人參多糖含量51%，人參皂苷含量40%） 人參研究院；MRS 肉湯培養基、瓊脂 青島海博生物技術有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然乳業集團；胃蛋白酶（豬胃黏膜）3000 U/g，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸、牛膽鹽、氯化鈉 分析純，南京建成科技有限公司。

BSD-25 恒溫培養箱 常州杰博森儀器公司；MDF-382E（N）超低溫冰箱 日本三洋公司；BSC-1000IIA2 生物安全柜 蘇凈科學器材公司；AvantiJE 離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；Bio-Rad Universal Hood II 凝膠成像儀 美國Bio-Rad 公司；SlgP033RB 0.22 μm/0.45 μm 過濾器 美國Millipore公司；pHS-3C pH 計 上海精密科學儀器公司；BioTek Synergy HT 多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 添加人參提取物培養基的制備 將人參提取物按2%（w/v）的比例溶于水，用0.45 μm 濾膜過濾，得到人參提取物母液。將母液按一定比例添加到脫脂乳培養基中，配制得到終濃度（w/v）分別為0‰、1‰、3‰、5‰、8‰和10‰的脫脂乳-人參提取物培養基。

1.2.2 菌株的處理 用脫脂乳培養基活化副干酪乳桿菌JLUs66，以2%的接種量在37 ℃下培養12 h，活化3 次以備實驗使用。將活化好的副干酪乳桿菌JLUs66 以2%的接種量分別接種于不同濃度的脫脂乳-人參提取物培養基中，37 ℃連續培養3 代，每次培養12 h，得到處理后的副干酪乳桿菌菌株，分別記為JLUs66-0、JLUs66-1、JLUs66-3、JLUs66-5、JLUs66-8 和JLUs66-10。將處理后的菌株在4 ℃，8000×g 的條件下離心10 min，棄上清，用0.9%的生理鹽水洗滌沉淀，離心后得到菌泥。

1.2.3 菌株生長特性

1.2.3.1 菌株的生長曲線 將1.2.2 中得到的菌泥重懸于0.9%的生理鹽水中，并將菌體濃度調整為109CFU/mL。以2%的接種量接入到脫脂乳培養基中，37 ℃下連續培養24 h，每隔2 h 取樣，測定OD600值，繪制生長曲線。

1.2.3.2 菌株的活菌數 采用稀釋涂布平板法計數，對1.2.3.1 中培養24 h 后的副干酪乳桿菌菌株進行活菌計數，并使用凝膠成像儀對平板進行拍照。

1.2.3.3 菌株的產酸能力 方法同1.2.3.1，每隔2 h取樣，測定發酵液的pH。

1.2.3.4 菌株代謝過程中胞外多糖產量的測定 胞外多糖粗品的提取制備根據前人的方法略做調整[15]。將1.2.2 中得到的菌泥重懸于0.9%的生理鹽水中，并將菌體濃度調整為109CFU/mL。以2%的接種量接入到脫脂乳培養基中，37 ℃下連續培養24 h，將待測菌液在90 ℃下水浴加熱15 min，4 ℃下10000 r/min 離心20 min 去除細胞。在上清液中添加4%（w/v）的三氯乙酸，4 ℃下放置12 h 沉淀蛋白質，離心后取上清液，添加3 倍體積的冷乙醇，4 ℃下放置過夜。離心后取下層沉淀，即為胞外多糖粗品。將粗品溶解在去離子水中，10000 Da 膜透析。通過苯酚-硫酸法，依據葡萄糖濃度與吸光度的線性關系（y=1.3478x+0.0486，R2=0.9998），計算得出胞外多糖含量。

1.2.4 乳酸菌耐受性測定

1.2.4.1 耐低溫能力的測定 將1.2.2 中得到的菌泥分別重懸于脫脂乳培養基中，并將菌體濃度調整為109CFU/mL。將其分裝后置于4 ℃冷藏，?18 ℃緩凍，?80 ℃超低溫環境下儲存，在第0.5、1、2、7、15、30 d 分別取出，測定低溫處理前后的活菌數，計算存活率。

式（1）中：N1為低溫培養后的活菌數，CFU/mL；N0為低溫培養前的活菌數，CFU/mL。

1.2.4.2 耐熱能力的測定 菌株的耐受性評價溫度及其耐熱性實驗方法根據安璟[13]的方法調整，副干酪乳桿菌JLUs66 的耐熱性評價溫度為55 ℃。將1.2.2 中得到的菌泥分別重懸于脫脂乳培養基中，并將菌體濃度調整為109CFU/mL。將其分裝后置于耐受性評價溫度下水浴處理10 min，測定耐熱性評價溫度下處理前后的活菌數，計算存活率。

式（2）中：N2為耐熱性評價溫度下培養后的活菌數，CFU/mL；N0為耐熱性評價溫度下培養前的活菌數，CFU/mL。

1.2.4.3 耐低pH 能力的測定 菌株的低pH 耐受性是通過菌株在人工胃液環境下的存活率所測得的[16]。人工胃液的配置：氯化鈉0.2%，胃蛋白酶0.3%，用1 mol/L 鹽酸調整pH 至2.5 后，過0.22 μm 濾器后除菌備用。將1.2.2 中得到的菌泥重懸于0.9%的生理鹽水中，并將菌體濃度調整為109CFU/mL。將其分裝后置于人工胃液中37 ℃孵育。測定人工胃液環境下1 h 的活菌數，計算存活率。

式（3）中：N3為人工胃液孵育后的活菌數，CFU/mL；N0為人工胃液孵育前的活菌數，CFU/mL。

1.2.4.4 耐膽鹽能力的測定 菌株的膽鹽耐受性根據Argyri[17]和Wang[18]的試驗方法測得。將1.2.2中得到的菌泥分別重懸于含有0.3%、0.5%（w/v）膽鹽的脫脂乳培養基中，測定其在0、4 h 的活菌數，計算存活率。

式（4）中：N4為含膽鹽培養基培養4 h 后的活菌數，CFU/mL；N0為含膽鹽培養基培養0 h 時的活菌數，CFU/mL。

1.2.4.5 耐NaCl 能力的測定 菌株的耐NaCl 能力的測定參考了熊蝶等[19]的方法。將1.2.2 中得到的菌泥分別重懸于含有20、40、60、80 g/L NaCl 的MRS肉湯培養基中，在37 ℃下培養24 h，測定其在24 h的OD600值。

1.3 數據處理

實驗數據以3 次重復的平均值±標準差表示，采用SPSS 21.0 進行統計分析，應用單因素ANOVA方差分析進行組間比較，使用GraphPad prism 8.0 軟件及Origin 8.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 人參提取物對菌株生長特性的影響

2.1.1 人參提取物對菌株生長曲線的影響 如圖1所示，由人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的生長曲線可知，菌株經人參提取物脅迫培養對其進入不同的生長階段的時間造成無顯著性影響（P>0.05）。經不同濃度人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 均在2 h 進入對數期，12 h 進入穩定期。JLUs66-0 的OD600值在進入穩定期后一直保持最高的趨勢，而高濃度人參提取物脅迫培養的菌株JLUs66-8 及JLUs66-10 在穩定期的OD600值顯著低于其他組別（P＜0.05）。16 h 后，JLUs66-8 及JLUs66-10 的OD600值出現了更為明顯的下降的趨勢，這可能是因為JLUs66-8 及JLUs66-10 中出現了菌體自溶的現象[20]。

圖1 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66的生長曲線Fig.1 Growth curves ofLactobacillus paracaseiJLUs66cultured under stress by ginseng extract

2.1.2 人參提取物對菌株活菌數的影響 如表1、圖2 所示，添加不同濃度的人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 在24 h 后的生長會受到顯著的抑制（P＜0.05），人參提取物的濃度越高，抑制程度越大，菌株的活菌數越少。

表1 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66的活菌數Table 1 Viable counts ofLactobacillus paracaseiJLUs66cultured under stress by ginseng extract

圖2 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 平板圖Fig.2 Plate ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

2.1.3 人參提取物對菌株產酸能力的影響 在培養基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的發酵液pH 變化曲線見圖3，隨著培養時間的增加，發酵液pH 不斷降低。其中，JLUs66-3 的pH 與JLUs66-0 的無顯著差異（P>0.05），其余組別pH 下降的幅度小于JLUs66-3 和JLUs66-0 組。且呈現出隨著培養基中人參提取物濃度的增加，菌株產酸越慢，菌液的pH 越高的規律。培養24 h時，JLUs66-0 菌液的pH 最低，降至4.91±0.06，而JLUs66-10 的pH 僅降至5.29±0.07。

圖3 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的發酵液pH 變化曲線Fig.3 pH change curves of fermentation broth ofLactobacillusparacaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

2.1.4 人參提取物對菌株產胞外多糖能力的影響經不同濃度的人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 在培養24 h 后胞外多糖的含量如圖4 所示。副干酪乳桿菌JLUs66 在經較低濃度的人參提取物脅迫培養后，其胞外多糖的合成量也顯著增加（P＜0.05），這可能是因為在菌株處理過程中，人參提取物中含有的某些營養物質能夠提高乳酸菌菌株合成多糖類物質的能力[21]。但是菌株的利用能力有限，故而當人參提取物脅迫培養的濃度高于一定值時，菌株的胞外多糖合成量不再發生顯著的變化（P>0.05）。其中，當人參提取物脅迫培養的濃度為5‰時，JLUs66-5 的胞外多糖的合成能力達到拐點，其胞外多糖的含量為0.80±0.04 mg/mL。

圖4 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的胞外多糖含量Fig.4 Extracellular polysaccharide content ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract注：不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），圖6~圖8 同。

2.2 人參提取物對菌株耐受性的影響

2.2.1 人參提取物對菌株耐低溫能力的影響 本試驗測試了在培養基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 在4 ℃冷藏、?18 ℃緩凍、?80 ℃超低溫的環境下的耐低溫能力。

如圖5a 所示，在4 ℃的儲存條件下，副干酪乳桿菌JLUs66 的存活率呈現先上升后下降的趨勢，并在儲存2 d 時出現最大值。當儲存時間較短時，添加人參提取物脅迫培養在不同程度上可以抑制菌株的耐低溫能力。隨著儲存時間延長，JLUs66-1 和JLUs66-3 的存活率略高于JLUs66-0，但在儲存30 d時，菌株的存活率均降低至11%左右。

圖5 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 在不同低溫條件下存活率的變化Fig.5 Changes in the survival rate ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract at low temperatures注：a 為4 ℃冷藏；b 為?18 ℃緩凍；c 為?80 ℃超低溫環境下儲存。

如圖5b，未經脅迫培養的JLUs66-0 在儲存時間較短時，存活率高于其他菌株，經脅迫培養的菌株則隨著脅迫培養濃度的不同呈現不同程度的差異。但從2 d 開始，隨著儲存時間的延長，JLUs66-0 的存活率逐漸低于經脅迫培養的菌株。當儲存時間在7 d及更久時，菌株存活率呈現出和脅迫培養的濃度成正相關的趨勢。添加人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的耐低溫能力在不同程度上有所提高。

菌株儲存于-80 ℃條件下時，由于速凍，細胞膜損失較小，故在同樣儲存時間下的存活率高于?18 ℃。如圖5c，當儲存時間為24 h 時，副干酪乳桿菌JLUs66 的存活率均在50%以上，隨著儲存時間的延長，存活率整體呈現出先上升后下降的趨勢。其中，高濃度人參提取物的脅迫培養使其低溫存活率升高，JLUs66-10 在30 d 時的存活率比未經脅迫的JLUs66-0高26%。

低溫條件下，菌體細胞可能同時面臨著低溫所形成的冰晶及細胞內部高滲透壓改變所帶來的危害[22]。菌體的低溫條件下的存活率的變化可能與人參提取物脅迫培養下菌體的胞外多糖合成量有一定的關系，在代謝過程中胞外多糖合成量增多，分泌到細胞壁外的胞外多糖對菌體形成包裹，防止低溫條件下細胞膜的破裂造成的存活率降低。

2.2.2 人參提取物對菌株耐高溫能力的影響 在培養基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養的乳酸菌耐熱性存活率如表2。55 ℃水浴加熱10 min 后，副干酪乳桿菌JLUs66 的存活率均下降至40%以下，隨著人參提取物濃度的增加，菌株的存活率呈現下降的趨勢，且整體都處于未經脅迫培養的JLUs66-0 以下。培養受到高濃度人參提取物的脅迫后，JLUs66-10 的高溫存活率僅為未經脅迫的JLUs66-0 的存活率的43.93%。

表2 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 的耐高溫能力的變化Table 2 Changes in the heat tolerance ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

乳酸菌的耐熱性主要由其細胞熱休克蛋白的水平、蛋白質的穩定性及生物膜的流動性決定[23]。培養基中添加不同濃度的人參提取物脅迫培養的乳酸菌耐熱性存活率發生變化可能是由于脅迫培養時，菌株產生了DnaK、DnaJ 等熱應激蛋白和蛋白酶[24]。也有研究將植物乳桿菌分為高產胞外多糖組和中產胞外多糖組進行耐熱性試驗，結果表明菌株的胞外多糖產生量越高，其耐熱能力越低[15]，這與本研究的胞外多糖含量的結果有一定的相似性，故脅迫培養后的乳酸菌的耐熱性的改變也有可能與胞外多糖的含量有關。

2.2.3 人參提取物對菌株耐低pH 能力的影響 乳酸菌在抵達人體消化道發揮益生功能之前，需要通過胃部的低pH 環境，對低pH 條件的耐受性是衡量益生菌的重要指標[25]。

將處理后的菌株在pH2.5 的環境下37 ℃培養1 h，菌株的存活率如圖6 所示。在培養基中添加人參提取物脅迫培養對JLUs66 的耐低pH 能力有一定的影響，整體呈現出低濃度人參提取物脅迫培養提高其低pH 耐受性，高濃度人參提取物脅迫培養降低其低pH 耐受性。其中，未經脅迫培養的JLUs66-0 的存活率為6.47%±0.30%，而經3‰濃度人參提取物脅迫培養的JLUs66-3 的存活率為25.67%±0.82%，高于高濃度人參提取物脅迫培養的JLUs66-10，約21.32 倍。

圖6 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 在低pH 條件下存活率的變化Fig.6 Variation in the survival rate ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract at low pH conditions

Nguyen 等[26]認為，乳酸菌可以產生特定的胞外多糖來抵抗外界的酸脅迫。本研究中的較低濃度人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 存活率隨著人參提取物脅迫培養的濃度的上升有著不同程度的上升，推測可能是因為脅迫培養后的菌株胞外多糖含量上升，其生成的特定種類的胞外多糖，在細胞表面產生了負電荷，防止了低pH 環境下質子擴散到細胞中對菌體造成危害。但當人參提取物脅迫培養濃度超過一定值時，耐酸性結果與已有研究并未表現出完全的一致性，這需要進一步的試驗探究。

2.2.4 人參提取物對菌株耐膽鹽能力的影響 腸道是乳酸菌在機體內定殖的最終部位，而腸道內的膽鹽殘留量約為0.05%~2.0%[27]，膽鹽條件下的高存活率是乳酸菌發揮益生功能的重要前提[28]。如圖7 所示，在0.3%和0.5%的膽鹽環境下，不同濃度的人參提取物脅迫培養的JLUs66 的存活率呈現出隨人參提取物濃度的增高而升高，最終趨于穩定的趨勢。其中，JLUs66-10 在0.3%膽鹽環境下表現出最優的存活率，為62.68%±0.67%，而在0.5%膽鹽環境下，JLUs66-8 存活率最高，為18.43%。菌株的膽鹽耐受性規律與其產胞外多糖能力變化趨勢相似，推測其膽鹽耐受能力受胞外多糖含量的影響。

圖7 人參提取物脅迫的副干酪乳桿菌JLUs66 的膽鹽耐受性變化Fig.7 Changes of bile salt tolerance ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract

2.2.5 人參提取物對菌株耐NaCl 能力的影響 乳酸菌時常應用于高鹽環境中，如發酵泡菜等，因此其具有一定的耐NaCl 能力也至關重要[29]。

由圖8 可知，在20~80 g/L NaCl 培養基中，副干酪乳桿菌JLUs66 均可以生長。在含有20 g/L NaCl的培養基中，菌株的OD600值均能達到1.4 以上，但經人參提取物脅迫培養的菌株的OD600值顯著低于未經脅迫培養的JLUs66-0 的OD600值（P＜0.05）。培養基中NaCl 濃度升高至40 g/L 時，菌株的OD600值降低，且部分經人參提取物脅迫培養的菌株耐NaCl 能力有所提高，其中，JLUs66-3 的OD600值最高，為1.06，顯著高于該濃度下未經脅迫的JLUs66-0的OD600值（P＜0.05）。培養基中NaCl 濃度升高至60 g/L 時，菌株的OD600值降低，且部分經人參提取物脅迫培養的菌株耐NaCl 能力均有所提高，其OD600值顯著高于該濃度下未經脅迫的JLUs66-0（P＜0.05），且整體呈現出人參提取物脅迫培養的濃度越高，菌株的耐NaCl 能力越強的趨勢。當培養基中NaCl 濃度升高至80 g/L 時，副干酪乳桿菌的OD600值均在0.13 左右，無顯著差異（P>0.05）。

圖8 人參提取物脅迫培養的副干酪乳桿菌JLUs66 在不同質量濃度NaCl 中的生長Fig.8 Growth ofLactobacillus paracaseiJLUs66 cultured under stress by ginseng extract in different mass concentrations of NaCl

乳酸菌的耐NaCl 能力主要受其高滲環境的影響，目前的研究表明，乳酸菌調節胞內滲透壓機制主要與相容性溶質調控系統、熱休克蛋白調控系統相關[30?31]。本研究中人參提取物脅迫培養的菌株的耐NaCl 能力整體處于增強的趨勢，這可能與在脅迫過程中，LuxS/AI-2等基因的轉錄水平隨著人參提取物的濃度的提高而上升，從而其耐NaCl 能力得以提高[32]。

3 結論

研究可知，人參提取物脅迫處理對副干酪乳桿菌JLUs66 的生長速率、活菌數、產酸速率及耐熱性的影響是負向的，人參提取物的濃度越低，乳酸菌的生長特性及耐受性越好；人參提取物的脅迫培養對菌株的胞外多糖產量、低溫耐受性及膽鹽耐受性的影響是正向的，但是，當人參提取物濃度超過5‰時，這些變化并不明顯；菌株的耐低pH 能力隨人參提取物濃度的升高呈現先上升后下降的變化，尤其在3‰濃度時，耐低pH 能力最高；菌株的耐鹽能力與耐低pH 能力的趨勢有相似性，而當NaCl 濃度足夠高時，菌株的耐鹽能力差別不大。綜合比較，人參提取物脅迫培養濃度為3‰時，副干酪乳桿菌JLUs66 的菌株特性及其耐受性最優。本研究為人參提取物對乳酸菌菌株生長特性的改變及菌株耐受性的提高提供科學依據，在實際生產過程中，可根據工業應用的需要，在培養基中添加不同濃度的人參提取物脅迫處理乳酸菌，有選擇性地改變其菌株生長特性及耐受性，從而提高乳酸菌的環境適應性。