酸橙內生菌Bacillus thuringiensisBt028 幾丁質酶的分離純化及其酶學性質

徐勤茜，朱國威，趙梓伶，陶雪婷，李子院,2，郝再彬,2，李海云,2,

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林 541004；2.廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，廣西桂林 541004）

幾丁質是由N-乙酰-D-葡萄糖胺組成的直鏈多聚物[1?3]，在自然界中含量僅次于纖維素[4?5]。由于幾丁質與天然物機體細胞有良好的生物兼容性[6?8]，因此廣泛應用在食品、醫藥、生物工程、農業等方面[9?11]，但由于自然狀態下幾丁質多以晶體狀態存在，不溶于水且不易降解，這極大地限制了幾丁質的應用。目前降解幾丁質的方法主要有化學法、物理法和酶解法[12]。然而化學法反應條件比較嚴苛，且反應產物不均一，對環境污染嚴重；物理法由于生產成本比較高，不適用于工業化生產；酶解法與物理法和化學法相比，有降解反應專一性強，不產生環境污染，可控制聚合度而且副反應少等優點，是目前最環保高效的降解幾丁質方法[13?15]。幾丁質酶（EC3.2.1.14）可以特異性催化幾丁質降解，得到N-乙酰氨基葡萄糖和聚合度為2~10 的幾丁寡糖，研究表明這些產物對人體的生態調節功能具有較好的改善提高作用[16?18]。

近年來，幾丁質酶由于在制備幾丁寡糖、食品保鮮等方面具有巨大的應用潛力而備受關注[19]。微生物來源的幾丁質酶由于生產速度快、產量高且性能穩定，目前已成為幾丁質酶的主要來源[20?21]。幾丁質酶的酶學特性是其應用的基礎，國內外研究者對微生物來源幾丁質酶的酶學特性進行了大量研究，如Du 等[22]從一株分離自土壤樣品的細菌Paenibacillussp 發酵液中純化得到一種分子量為30 kDa 的幾丁質酶，其最佳pH 為4.5，最佳溫度為50 ℃；Guo 等[23]對Paenibacillus pasadenensisCS0611 胞外幾丁質酶進行純化，測定幾丁質酶分子量為69 kDa，最適pH 和最適溫度分別為5.0 和50 ℃；蘇明慧等[24]從安徽西瓜種植地根際土壤分離所到一株短短芽孢桿菌FM4B，對其發酵液中的幾丁質酶進行分離純化，獲得分子質量為66 kDa 幾丁質酶純品，且酶活力在pH5.0~9.0 穩定；劉蒲臨等[25]將土壤中分離出的側孢短芽孢桿菌CDY64 幾丁質酶基因表達于大腸桿菌BL21 中，純化后的幾丁質酶最適反應溫度為60 ℃，在pH6.0~8.0 范圍內均表現出良好的活性。可見，不同微生物來源的幾丁質酶的性質可能不同。目前尚未見有酸橙內生菌產幾丁質酶的酶學性質研究。

本研究以前期篩選獲得的一株產幾丁質酶活性較高的酸橙內生菌Bacillus thuringiensisBt028 為研究對象，對其發酵液中的幾丁質酶進行分離純化，并對該幾丁質酶的酶學性質進行研究，為該酶的應用奠定基礎，同時也為不同生物來源的幾丁質酶系的性質和功能的比較研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸橙 采自桂林永福蘇橋鎮，新鮮酸橙果實；酸橙內生菌Bacillus thuringiensisBt028 分離自酸橙果實，保存于桂林理工大學生物工程實驗室；幾丁質、3，5-二硝基水楊酸、β-D-N-乙酰氨基葡萄糖 分析純，購于上海易恩化學技術有限公司；硫酸鎂、硫酸亞鐵 分析純，購于天津市大茂化學試劑廠；蛋白胨、酵母粉、瓊脂磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、Tris 分析純，購于西隴化工股份有限公司；低分子量蛋白質Marker PR1400、葡聚糖凝膠G-100 北京索萊寶科技有限公司；活化培養基 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L；幾丁質酶發酵培養基 膠體幾丁質10 g/L、酵母粉10 g/L、K2HPO40.7 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L，pH7.0。

LRH-150-Z 振蕩培養箱 珠江留關市泰宏醫療器械有限公司；BX30R 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司；CJ-ISFS 醫療設備超工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司；VIS-7220N 可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；HH-S2 數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；ZXRD-B5110 鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司；Bio-Rad電泳儀、小型垂直電泳槽 上海孚約商貿有限公司；BSZ-160 自動部分收集器、HL-2B 恒流泵 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 幾丁質酶的分離純化

1.2.1.1 幾丁質酶粗酶液的制備 參考文獻[24]的方法并加以改進，將斜面保存的Bacillus thuringiensisBt028 經平板培養活化24 h 后，挑取一環接入100 mL幾丁質酶發酵培養基中（250 mL 三角瓶），在溫度為30 ℃，轉速為180 r/min 的搖床上振蕩培養24 h，即為種子液。將種子液按照3%的接種量接入到裝有100 mL pH7.0 的幾丁質酶發酵培養基的250 mL 三角瓶中，在溫度為30 ℃、轉速為180 r/min 的搖床上振蕩培養48 h。發酵液在4 ℃、12000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液即為粗酶液，4 ℃冰箱儲存。

1.2.1.2 硫酸銨鹽析 參考劉美艷等[26]的方法并略作修改：分別取10 mL 粗酶液8 份置于燒杯中，加入固體（NH4）2SO4調節使各燒杯中酶液的（NH4）2SO4飽和度分別為0%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4 ℃下靜置過夜后，10000 r/min 離心，測定上清液中總蛋白含量及幾丁質酶活力，并繪制（NH4）2SO4鹽析曲線。根據（NH4）2SO4鹽析曲線確定菌株Bt028 幾丁質酶的分級沉淀條件后，對菌株Bt028 發酵液進行（NH4）2SO4鹽析。鹽析后的沉淀加入適量50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液溶解后裝入透析袋內，4 ℃下用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液透析除鹽。

1.2.1.3 葡聚糖凝膠Sephadex G-100 層析 在室溫下，將葡聚糖凝膠干粉浸泡于蒸餾水中充分溶脹后裝柱（1 cm×70 cm），并用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5，含有0.2 mol/L NaCl）緩沖液平衡后，取1.0 mL 經透析除鹽的酶液，上樣于層析柱，用相同的緩沖液洗脫，流速為8 mL/h，分管收集洗脫液，每管收集3.5 mL，檢測并收集有酶活性的洗脫峰。

1.2.1.4 幾丁質酶純度和分子量測定 參考陳茜文等[11]方法用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純化前后幾丁質酶純度及相對分子質量。

1.2.2 菌株Bt028 幾丁質酶的酶學性質

1.2.2.1 最適反應溫度及熱穩定性 分別選取30、40、50、60、70、80 ℃作為酶催化反應溫度，測其酶活，以確定菌株Bt028 幾丁質酶的最適反應溫度。將菌株Bt028 幾丁質酶酶液置于35、40、45、50、55、60、65、70 ℃水浴中保溫不同時間后，取樣測定酶液的剩余酶活力，考察酶的熱穩定性。

1.2.2.2 最適pH 及pH 穩定性 在最適反應溫度條件下測定幾丁質酶pH 為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 時酶活力，確定菌株Bt028 幾丁質酶的最適反應pH。將幾丁質酶液pH 調為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在30 ℃下放置0、1、2、3、4、5、6 h，測定酶液的剩余酶活力，考察pH 對菌株Bt028 幾丁質酶穩定性的影響。

1.2.2.3 金屬離子的影響 在30 ℃條件下，向底物膠體幾丁質溶液中分別加入1 mmol/mL 不同的金屬離子如Mg2+（MgSO4·7H2O）、Fe3+（FeCl3·6H2O）、Cu2+（CuSO4·5H2O）等，與酶液混合后反應測定幾丁質酶酶活力，以不加金屬離子為對照，考察不同金屬離子對幾丁質酶酶活力的影響。

1.2.2.4 有機溶劑對幾丁質酶活的影響 選擇甲醇、乙醇、正丙醇、甲醛、丙酮、二甲亞砜為效應物，在底物膠體幾丁質溶液中加入0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%的效應物，調pH 為6.5，在60 ℃條件下測定酶的相對活力，分析研究效應物對Bt028 幾丁質酶活力的影響。

1.2.2.5 酶催化反應動力學常數測定 分別取含0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%膠體幾丁質的磷酸緩沖液與pH 為6.5 幾丁質酶液在60 ℃條件下反應，根據底物濃度對酶催化反應速率的影響，采用Lineweaver-Burk 雙倒數法構建動力學模型，計算菌株Bt028 幾丁質酶催化膠體幾丁質水解的米氏常數Km、最大速度Vmax 以及轉換數Kcat。

1.2.3 幾丁質酶酶活的測定 參考戴德慧等方法[27]略作修改：取0.5 mL 粗酶液與0.5 mL 含1.0%膠體幾丁質的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）混合，50 ℃保溫20 min 后，沸水浴10 min，流水冷卻。加入1.0 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，流水冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL，12000 r/min 離心5 min，取上清液測定波長540 nm 處吸光度（以不含膠體幾丁質的磷酸緩沖液為參照）。根據A540nm在β-D-N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線上查得還原糖的釋放量并計算酶活力。以每分鐘催化幾丁質生成相當于l μmolβ-D-N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位。相對酶活（%）=（實驗組酶活/空白組酶活）×100。

1.2.4 蛋白質含量的測定 參考聶昌宏[28]方法，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。相對蛋白質含量（%）=（實驗組蛋白質含量/空白組蛋白質含量）×100。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次，采用SPSS 軟件分析數據的顯著性，利用Origin 以及Excel 對實驗數據處理分析并進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 幾丁質酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨鹽析 蘇云金芽孢桿菌Bt028 發酵液經過離心后，取上清液進行（NH4）2SO4分級鹽析，鹽析后的上清液中蛋白質濃度和幾丁質酶活隨（NH4）2SO4飽和度的變化情況如圖1 所示。由圖1可見，上清液中的幾丁質酶活力和總蛋白含量均隨（NH4）2SO4飽和度的增加而降低；當（NH4）2SO4飽和度低于20%時，總蛋白含量下降的趨勢快于幾丁質酶活力下降趨勢，表明雜蛋白鹽析的速度比幾丁質酶快；當（NH4）2SO4飽和度大于20%后，上清液中酶活迅速降低，說明此時幾丁質酶不斷被沉淀出來；當（NH4）2SO4飽和度達到70%時，上清液中幾乎檢測不到幾丁質酶活，說明（NH4）2SO4飽和度達到70%時幾丁質酶已基本沉淀完全。據上綜合考慮，確定硫酸銨鹽析方案為：20%飽和度的（NH4）2SO4鹽析除雜、70%飽和度的（NH4）2SO4沉淀幾丁質酶。當鹽濃度增高到一定數值時，會導致水活度降低，進而使蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，使蛋白質相互結合聚集形成沉淀析出[29]。本研究所確定的沉淀區間獲得的酶回收率為61.24%，比郭金玲等[30]以35%~80%硫酸銨飽和區段對黑曲霉Aspergillus niger粗酶液進行沉淀，酶的回收率為47.26%更高。

圖1 硫酸銨鹽析曲線Fig.1 Salting out curve of ammonium sulfate

2.1.2 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠層析 經硫酸銨沉淀后的酶液采用Sephadex G-100 凝膠層析，洗脫曲線見圖2。

圖2 Sephadex G-100 葡聚糖凝膠層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sephadex G-100 Dextran gel chromatography

圖2 顯示，樣品通過凝膠層析，共獲得4 個蛋白峰，其中峰I 具有最高的幾丁質酶活力，收集該峰濃縮濃縮后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2.1.3 幾丁質酶純化結果分析和純度鑒定 Bt028所產幾丁質酶的純化結果總結于表1。從表1 可以看出，蘇云金芽孢桿菌Bt028 發酵液中幾丁質酶經硫酸銨鹽析和葡聚糖G-100 凝膠層析后，所獲幾丁質酶的比活力達681.78 U/mg，純化倍數3.21 倍，酶回收率為15.52%。目前已有諸多關于不同來源幾丁質酶的分離純化報道，如高兆建等[31]通過硫酸銨沉淀、DEAE-Cellulose A52 離子交換層析和Sephadex G-100 凝膠過濾層析純化得到均一的Chi-Pc76，最終純化倍數為17.1 倍，回收率21.6%；Farag 等[32]對海洋來源土曲霉培養液中的幾丁質酶通過硫酸銨沉淀、Sephadex G-100 凝膠過濾層析以及離子交換色譜進行分離純化，純化倍數5.16，回收率為12%。本文通過硫酸銨鹽析及Sephadex G-100 凝膠層析即可獲得純度較高的幾丁質酶，說明本文所采用的Bt028菌株產生的雜蛋白較少，在幾丁質酶合成中具有較好的應用潛力。

表1 蘇云金芽孢桿菌Bt028 幾丁質酶的純化結果Table 1 Purification results of chitinase produced byBacillusthuringiensisBt028

幾丁質酶純化樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜圖見圖3。由條帶3 可以看出純化后得到單一蛋白條帶，其相對分子質量約為65 kDa。不同微生物來源的幾丁質酶的分子量差異較大，一般在10~110 kDa之間，如大部分細菌所產幾丁質酶的分子量在60~110 kDa 之間，放線菌的一般不高于30 kDa，而真菌所產幾丁質酶的則高于30 kDa[33]。不同來源的蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶相對分子量之間也存在較大差異，如劉佳等[34]從Bt HD-73 菌株中克隆、重組的幾丁質酶Chi73 分子量為77 kDa。

圖3 菌株Bt028 產幾丁質酶的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE of chitinase fromBacillus thuringiensisBt028注：Marker：標準蛋白；1：粗酶液；2：20%~70%硫酸銨鹽析酶液；3：葡聚糖凝膠G100 層析酶液。

2.2 幾丁質酶的酶學性質

2.2.1 幾丁質酶的最適反應溫度和熱穩定性 在不同溫度下測定菌株Bt028 幾丁質酶的酶活，結果如圖4 所示。結果表明：在60 ℃時酶活顯著提高（P＜0.05），故該幾丁質酶的最適反應溫度為60 ℃，比丁志雯等[35]從Dyadobactersp. CZW019 中得到的幾丁質酶反應最佳溫度（35 ℃）高。幾丁質酶的熱穩定性結果如圖5 所示，在溫度低于60 ℃范圍內酶的熱穩定性良好，超過60 ℃后隨著保溫時間的增加，酶活力迅速下降，熱穩定性變差。

圖4 幾丁質酶的最適反應溫度Fig.4 Optimum reaction temperature of chitinase注：不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；圖6、圖8 同。

圖5 幾丁質酶的熱穩定性Fig.5 Thermal stability of chitinase

2.2.2 幾丁質酶的最適反應pH 和pH 穩定性 pH能顯著影響酶反應速率，由圖6 可以看出，當pH 為6.5 時酶活顯著提高（P＜0.05），說明蘇云金芽孢桿菌Bt028 最適反應pH 為6.5。當pH 高于或者低于6.5時，酶活迅速降低。pH 對酶活性的影響并不是因為作用于整個酶分子，從而影響酶分子的解離狀態，而是由于酶的活性中心或與之有關的基團的解離狀態被改變，從而使酶的活性狀態發生改變，因此過酸和過堿都會大大降低酶的活性。菌株Bt028 幾丁質酶的最適pH 與來源于其它芽孢桿菌的幾丁質酶最適pH 高，如來源于短短芽孢桿菌的幾丁質酶最適pH為6.0[24]，但明顯比蘇云金芽孢桿菌來源的幾丁質酶的最適pH 為7.0 低[34]，說明兩者性質存在差別，并不是同一種幾丁質酶。幾丁質酶的pH 穩定性結果如圖7 所示，在pH 5.5~7.5 范圍內，該幾丁質酶穩定性較好，當pH 低于5.5 或高于7.5 后，隨著時間的延長，相對酶活逐漸降低；當pH 為6.5 時其穩定性最好，處理6 h 后相對酶活力仍在90%以上。

圖6 幾丁質酶的最適反應pH Fig.6 Optimum reaction pH of chitinase

圖7 幾丁質酶的pH 穩定性Fig.7 pH stability of chitinase

2.2.3 金屬離子對幾丁質酶活性的影響 從圖8 可以看出，與空白相比，Co2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+這四種金屬離子對幾丁質酶有一定程度的抑制作用，但酶仍具有一定的活性，其中Mg2+的抑制作用最為明顯；Fe3+和Cu2+使酶活力顯著提升（P＜0.05）。金屬離子能夠與酶形成絡合物，從而維持或破壞其三維結構和構型，在生物催化中起重要作用[31]。張瑤心等[36]對無色桿菌ZWW8 產幾丁質酶的酶學性質進行研究，發現Cu2+和Zn2+對酶活有抑制作用，Hg2+可導致幾丁質酶完全失活，說明不同來源幾丁質酶性質不一定相同。

圖8 金屬離子對幾丁質酶活的影響Fig.8 Effect of metal ions on chitinase activity

2.2.4 有機溶劑對幾丁質酶活的影響 不同有機溶劑對幾丁質酶活的影響如圖9 所示，甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亞砜對幾丁質酶的作用效果為先激活后抑制，當甲醇、乙醇和正丙醇的濃度為5.0%，二甲亞砜濃度為2.5%時，酶活力達到最高，隨著這幾種有機物含量的繼續提高，酶活力下降。當正丙醇濃度為25.0%時，可以使酶活力降低23.9%。故正丙醇對酶的失活作用比甲醇和乙醇強。而丙酮濃度越高，對幾丁質酶活力的激活作用越強，在丙酮濃度為0%~10.0%之間，酶活力持續上升，當濃度超過10.0%，酶活力趨于穩定25.0%。隨著甲醛濃度的增大，酶的活力呈直線下降，25.0%的甲醛抑制酶活力58.2%。

圖9 有機溶劑對幾丁質酶活力的影響Fig.9 Effect of different organic solvents on the activity of chitinase

2.2.5 幾丁質酶反應動力學常數測定 菌株Bt028幾丁質酶催化膠體幾丁質水解反應的Lineweaver-Burk 雙倒數圖如圖10 所示，得到的直線回歸方程為：y=0.271x+0.009（R2=0.99807），根據該直線在x 軸和y 軸上的截距計算出在pH 為6.5、60 ℃的酶活測定體系中，菌株Bt028 幾丁質酶對膠體幾丁質的米氏常數Km 為29.533 mg/mL，最大反應速率Vmax=108.696 μmol/（L·min），酶的轉換數Kcat=0.527/min。

圖10 幾丁質酶催化動力學Lineweaver-Burk 雙倒數圖Fig.10 Lineweaver-Burk double reciprocal diagram of chitinase catalytic kinetics

3 結論

當前主要通過微生物發酵來生產酶制劑，這種方式生產周期短、且不易受外部因素的影響，但由于粗酶活力不高，導致大批工業用酶制劑的規模化應用受到限制。因此，通過對粗酶液純化可以提升酶制劑產品質量。本文對蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensisBt028 所產幾丁質粗酶液采用20%~70%硫酸銨分段鹽析，純化倍數為1.16，回收率為61.24%；經Sephadex G-150 葡聚糖凝膠柱層析后，得到了4 個洗脫峰，其中組分峰Ⅰ具有最高的幾丁質酶酶活力，比活力可達681.78 U/mg，純化倍數達3.21 倍。通過SDS-PAGE 電泳測定純品酶分子質量為65 kDa，與Azizoglu 等[37]已報道純化的蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶產生的條帶分別為39.71、41.39、91.66 和110~113 kDa 相比較差異較大。此外，本文對Bacillus thuringiensisBt028 所產幾丁質酶的酶學性質也進行了分析，結果顯示該酶最適反應溫度為60 ℃，在65 ℃以下保溫6 h 后酶活力剩余84.37%，在70 ℃保溫6 h 是酶活力剩余67.40%，表明該酶的熱穩定性較好。該幾丁質酶的最適pH 為6.5，Co2+、Mg2+、Ca2+、Hg2+等金屬離子對幾丁質酶有一定程度的抑制作用，Fe3+和Cu2+對酶有促進作用。低濃度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亞砜使酶的活性增加，當有機溶劑濃度提升到一定程度時，酶的活性受到抑制，與邱君志[38]對幾丁質酶的研究結果相似。丙酮對幾丁質酶有激活作用，而甲醛對幾丁質酶有抑制作用。通過酶動力學分析可知，以膠體幾丁質為底物時，該酶催化反應的米氏常數Km 為29.533 mg/mL，最大反應速率Vmax=108.696 μmoL/（L·min），酶的轉換數Kcat = 0.527/min。穩定性實驗研究表明幾丁質酶具有較好的熱穩定性和酸堿穩定性。由此可見對粗酶液進行純化可大幅提高幾丁質酶穩定性，這對于提高工業生產中幾丁質酶的作用效率具有非常積極的意義，本研究采用的均為傳統的純化方法，但純化后總酶活損失較大，這不利于提高幾丁質酶制劑生產的經濟效益，因此后續研究中有必要改進純化方法，以提升酶的回收率。