益生菌發酵刺麒麟菜制備硫酸多糖工藝優化及性質分析

張 軍，谷福蝶，劉 艷，周 鈺，劉慶梅,2，劉光明,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建廈門 361021；2.中國醫學科學院北京協和醫院，疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100005）

近年來，海洋藻類作為豐富且重要的海洋生物資源，因含有糖類、多酚、蛋白質等豐富的天然活性物質，被廣泛報道[1?2]。據《2021 中國漁業統計年鑒》統計，2020 年我國麒麟菜養殖產量高達3856 噸，同比2019 年增長818%。刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）屬于紅藻綱，紅翎菜科，是生產卡拉膠的主要原材料，其富含的硫酸多糖在卡拉膠加工過程中一直被當作廢棄物處理[3]。但硫酸基團被認為是酸性多糖主要的活性基團，硫酸多糖也被證實具有更高的生物活性[4]，因此富含硫酸基團的刺麒麟菜硫酸多糖在食品工業與醫藥領域具有極大的發展潛力。

刺麒麟菜硫酸多糖的物理制備方式以熱水浸提和低溫凍融為主，常輔以超聲破碎處理以提高得率，低溫凍融刺麒麟菜硫酸多糖（Low temperature freeze-thawEucheuma spinosumsulfate polysaccharide，L-ESP）對比熱提多糖粘度降低，溶解性提高，硫酸基團保護較好，但依舊存在著分子量大、生物利用度低等問題，往往給進一步加工利用帶來困難。因此，刺麒麟菜硫酸多糖制備方式的開發備受關注。

益生菌不僅可以生產健康的發酵食品[5]，益生菌與膳食互作更是被定為2020 年益生菌科學研究十大熱點之一[6]。有研究報道，采用益生菌發酵得到的多糖，生物活性物質溶出率顯著提升，分子量降低，更易被腸道吸收[7?8]，其生物活性也優于未發酵多糖[9?11]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是一種益生菌菌株，常作為乳品[12]、飲料[13]、保健食品或飼料的原料或發酵劑被廣泛使用。Wu 等[14]利用鼠李糖乳桿菌發酵四種海藻，發現得到的海藻低聚糖（SwOSLAFP）顯示出更大的還原能力和亞鐵離子螯合能力以及對過氧化氫的清除能力，抗氧化活性顯著提高。綜上所述，益生菌發酵已經應用于天然多糖的制備，但刺麒麟菜多糖的發酵制備工藝、性質特征、抗過敏活性以及相關的構效關系尚不明確。

因此本文利用鼠李糖乳桿菌發酵刺麒麟菜制備發酵刺麒麟菜硫酸多糖（FermentedEucheuma spinosum、 sulfate polysaccharide，F-ESP），借助Box-Behnken 響應面法進一步優化制備條件，并對其化學成分、物理性質和官能團結構進行進一步解析，通過大鼠嗜堿性粒細胞（Rat Basophilic Leukemia-2H3，RBL-2H3）經典脫顆粒模型初步評價其抗過敏活性，旨在為刺麒麟菜多糖工業化生產和功能食品的開發提供理論基礎，為刺麒麟菜的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺麒麟菜 綠新（福建）食品有限公司；鼠李糖乳桿菌（BNCC185356） 北京北納創聯生物技術研究院；RBL-2H3 細胞 上海復祥生物技術有限公司；MEM 液體培養基 美國HyClone 公司；胎牛血清 美國Gemini 生物科技公司；臺氏緩沖液（PB180338） 武漢普諾賽生命科技有限公司；MRS培養基、DEAE-52 纖維素 北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；內毒素檢測鱟試劑盒 廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；MTT、β-氨基己糖苷酶底物、抗二硝基苯單克隆抗體小鼠抗 美國sigma 公司；DNPBSA 基因生物技術國際貿易（上海）有限公司；其他試劑為國產分析純。

InfiniteM200PRO 酶標儀 德國Tecan 公司；NP80 紫外分光光度計 德國IMPLEN 公司；內徑0.7~0.8 mm 烏氏粘度計 上海寶山啟航玻璃儀器廠；Waters 2695 型高效液相色譜 美國Waters 公司；Forma3111 水套式CO2細胞培養箱 美國Thermo公司；SG-403 生物安全柜 美國Baker 公司；Nunc細胞培養板 美國Thermo 公司；PhenomPro 臺式掃描電鏡 美國Phenomworld 公司；ALPHA 傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵刺麒麟菜粗多糖的制備 刺麒麟菜淘洗去除泥沙后于50 ℃烘箱烘干，將干燥后的刺麒麟菜剪碎放入破壁機粉碎過100 目篩，置于保鮮盒存放于陰涼干燥處待用。參考Zhang 等[15]的方法稍作修改，將刺麒麟菜菜粉按照一定料液比與超純水混合后，加入2.5%（w/w）的果葡糖漿，然后121 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫后加入適量已活化的鼠李糖乳桿菌，于37 ℃厭氧發酵，然后100 ℃滅活10 min，于室溫下8000 r/min 離心10 min，收集上清。加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，8000 r/min 離心10 min 得到沉淀，將沉淀復溶于超純水，冷凍干燥后，即得到發酵刺麒麟菜粗多糖。參考陳玉芳等[16]的方法，將刺麒麟菜粉和超純水按照料液比1:90 混合，?18 ℃冷凍2 h，解凍溫度55 ℃，反復凍融三次，制備冷凍刺麒麟菜多糖作為后續樣品對照。

1.2.2 單因素實驗設計 取刺麒麟菜10 g，固定接菌量為4%（v/v），發酵時間為24 h，探究料液比（w/v）為1:40、1:50、1:60、1:70，1∶80 時對粗多糖得率的影響；固定料液比1:70、發酵時間為24 h，探究接菌量為0.5%、1%、2%、4%、8%時對粗多糖得率的影響；固定料液比1:70、接菌量4%，探究發酵6、12、18、24、30 h 時對粗多糖得率的影響。粗多糖得率以凍干粗多糖質量與菜粉質量之比計算。

1.2.3 響應面法優化發酵刺麒麟菜粗多糖制備工藝

根據單因素實驗結果，選取料液比、接菌量、發酵時間為自變量，以發酵刺麒麟菜粗多糖得率為響應值，以Box-Benhnken 設計原理進行響應面試驗設計（見表1），用Design Expert 12 軟件擬合因素與響應值之間的函數關系，分析回歸方程從而預測最優工藝參數。

表1 響應面試驗設計的因素及水平Table 1 Factors and level of response surface test design

1.2.4 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的分離純化 按照最佳工藝發酵得到發酵刺麒麟菜粗多糖后，取1 g 按10 mg/mL 復溶于超純水，上樣于預裝20 g 的DEAE Cellulose-52 的直徑2.5 cm 的層析柱，恒流泵流速設置為2 mL/min，依次用0、0.5、1、2 mol/L 的氯化鈉溶液階段洗脫，每管收集5 mL。蒽酮硫酸比色法測定每管洗脫液在630 nm 處的吸光度，并做出洗脫曲線，收集糖含量較高的部分，3 kDa 透析膜透析72 h，冷凍干燥機凍干，即得到發酵刺麒麟菜硫酸多糖F-ESP；低溫凍融刺麒麟菜硫酸多糖L-ESP 純化方式同上。

1.2.5 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的化學組成分析 按照Zhang 等[17]的方法進行單糖組成分析；以半乳糖為標準品，利用蒽酮硫酸顯色法[18]對純化后的發酵刺麒麟菜硫酸多糖和低溫凍融刺麒麟菜多糖的總糖含量進行測定；參考趙凱等[19]的方法，利用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量；硫酸根含量參考Yu 等[20]以K2SO4為標準品，利用Dodgson-Price 法[21]進行測定；蛋白質含量參考Tang 等[22]采用碧云天BCA 蛋白檢測試劑盒進行測定；利用鱟試劑內毒素檢測試劑盒檢測內毒素含量。

1.2.6 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的物理性質分析

1.2.6.1 平均分子量的測定 參照Gong 等[23]的方法利用高效凝膠滲透法（HPGPC），采用示差檢測器，配制pH 為6 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液為流動相，將標準品和樣品按照2%（w/v）的濃度溶于磷酸鹽緩沖液，分別進樣于TSK-GELG4000 SWXL 色譜柱，流速為0.4 mL/min，進樣體積20 μL，對兩種多糖樣品的純化產物的平均分子量進行測定。

1.2.6.2 溶解度的測定 稱取純化后的凍干樣品200 mg 置于烘干至恒重的15 mL 離心管中，加入10 mL 超純水混合，室溫下振蕩30 min，使多糖樣品充分溶解，將樣液全部轉移至50 mL 容量瓶中，定容至刻度線后混勻。吸取10 mL 于8000 r/min 離心10 min，將上清液完全轉入稱量瓶中烘干，恢復至室溫后稱重。按照式（1）計算：

式中：DSI 溶解度（%）；m0樣品質量（g）；m1稱量瓶質量（g）；m2烘干樣品+瓶質量（g）。

1.2.6.3 比濃粘度的測定 在25 ℃恒溫條件下，使用內徑為0.7~0.8 mm 的烏氏粘度計測定濃度為0.5 g/dL 的L-ESP 和F-ESP 的比濃粘度（ηre），參照Liu 等[24]的方法進行，每個樣品獨立測定5 次，分別記錄樣液通過毛細管的時間，按照式（2）計算：

式中：t0純水流經毛細管的時間（s）；t 樣品流經毛細管的時間（s）；η0純水的粘度；ηr相對粘度；ηsp特性粘度；ηre比濃粘度（dL/g）；C 樣品濃度（g/dL）。

1.2.6.4 掃描電鏡分析 將多糖樣品固定在載物臺導電膠表面，將載物臺轉移至蒸金室，打開真空泵，達到真空度后，濺射儀噴金90 s，然后在放大倍數為500×、1000×、3000×條件下進行拍照，觀察多糖樣品的微觀形貌。

1.2.7 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜分析 將樣品與干燥的溴化鉀以1:100 比例混合后研磨，經手動壓片后利用傅里葉紅外光譜儀在400~4000 cm?1進行掃描[25]。

1.2.8 發酵刺麒麟菜硫酸多糖抗過敏活性評價RBL-2H3 細胞使用10% FBS-MEM 在5% CO2，37 ℃下培養，并采用MTT 試劑按照說明書檢測不同濃度樣品對細胞活力的影響；RBL-2H3 細胞脫顆粒參考Zhang 等[26]的方法，將RBL-2H3 細胞計數后用10%的FBS-MEM 稀釋，按照5×104個/孔鋪至96 孔培養板，用終濃度0.1 μg/mL 的anti-DNP-IgE 敏化過夜，然后PBS 洗滌一次，樣品組加入不同濃度樣品（10、25、50、100 μg/mL）的臺氏緩沖液100 μL 孵育1 h，然后向陽性組和樣品組加入終濃度為0.5 μg/mL的DNP-BSA 激發，陰性孔加入同體積的PBS 緩沖液，1 h 后收集上清，向板底加入含有0.1% TritionX-100 的臺氏緩沖液100 μL，裂解5 min，吹打均勻后吸取上清和裂解液各25 μL，置于黑色熒光板，加入100 μL 1.2 mmol/mL 的β-氨基己糖苷酶底物，混勻后37 ℃孵育30 min，檢測激發波長360 nm，發射波長450 nm 條件下的吸光度值。β-氨基己糖苷酶抑制率按照式（3）、（4）計算：

1.3 數據處理

實驗結果均重復三次以上，數據以平均值±標準差（Mean±SD）表示。采用SPSS 20.0 軟件中的圖基檢驗（Tukeytest）進行差異顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖1A 所示，料液比不斷增大，粗多糖得率呈現先快速增長后平緩的趨勢，分析是因為料液比增大導致內外滲透壓以及溶液飽和度的變化，當料液比為1:40 時溶液極易達到飽和，且粘稠度高，不易于多糖的進一步析出，當液體體積不斷增大至1:80，刺麒麟菜粉末與發酵液接觸面積增大，多糖溶出率也隨之上升，到達工藝上限。但料液比為1:70 和1:80 時，多糖得率差異不顯著（P>0.05），因此選擇1:70 作為后續試驗條件。

圖1B 所示，得率隨著接菌量的增大逐漸升高，接菌量為4%時達到峰值，當擴大至8%時，得率明顯下降，分析是因為鼠李糖乳桿菌能夠以刺麒麟菜中某些糖類為碳源，利用了一部分可代謝的糖，從而導致最終得率的下降，這也印證了刺麒麟菜可能具有益生元特性，也有大量文獻對此進行了報道[27?29]。

圖1 料液比（A）、接菌量（B）、發酵時間（C）對發酵刺麒麟菜粗多糖得率的影響Fig.1 Effects of material-liquid ratio(A), inoculation amount(B) and fermentation time(C) on the yield of F-ESP

刺麒麟菜皮層最外2~3 層多為小型薄壁細胞，內容物較少，向內逐漸增大[30]，而發酵前期主要分解了外側小型薄壁細胞的初生壁，隨著發酵時間增長，內層較大的薄壁細胞被分解，大量內容物析出，得率顯著提高，如圖1C 所示，當發酵時間不斷增長至30 h時得率達到峰值，但與24 h 差異不顯著（P>0.05）。

2.2 響應面法優化發酵刺麒麟菜粗多糖制備工藝

響應面試驗根據 Box-Benhnken 原理利用DesignExpert 12 軟件進行試驗設計，稱量凍干后的所有固形物并計算多糖得率，結果如表2 所示。

采用Design-Expert 12 軟件對表2 結果進行多元回歸擬合，得到多糖得率對料液比（A）、接菌量（B）、發酵時間（C）的二次多項式回歸模型：

表2 發酵制備刺麒麟菜硫酸多糖響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface for preparation of F-ESP

Y= 40.00+2A+2.03B+0.6038C?1.75AB?1.87AC?0.0475BC?3.49A2?4.71B2?2.04C2

如表3 所示，相關系數R2為模型與總和的比值=272.80/281.95=0.9675，表示模型擬合性能良好，且失擬檢驗P值大于0.05，表明模型未失擬，模型P值遠遠小于0.05，說明各因素與響應值的線性關系十分顯著，模型F值為23.20，說明該模型有意義，上述結果表明回歸二次模型建立成功，可用于評價發酵刺麒麟菜硫酸多糖的工藝條件。根據ANOVA 分析數據差異項，接菌量和液料比的變化對多糖得率的影響顯著差異（P＜0.01），根據各因素的F值判斷主次因素并進行排序：接菌量>液料比>發酵時間。綜合上述數據和分析，擬合出發酵刺麒麟菜硫酸多糖最佳工藝條件為料液比1:72.3、接菌量5.5%、發酵時間24.2 h，預測值為40.41%。為便于操作，條件參數設置為料液比1:70，接菌量5%，發酵時間24 h，按照該條件獨立重復制備三次的粗多糖得率均值為41.70%±2.0%，與預測值相符合，且顯著大于凍融法的得率（33.52%±2.71%）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

如圖2 所示，響應曲面映射在等高線上的圖形越接近橢圓表明差異越顯著，越接近圓越不顯著。

圖2 各因素對發酵刺麒麟菜粗多糖得率交互影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors on the yield of F-ESP注：A 為料液比-發酵時間，B 為接菌量-料液比，C 為發酵時間-接菌量。

根據表3 和圖2A 結合判斷，料液比和發酵時間相互作用顯著（P＜0.05），分析可能是因為料液比一定時，發酵時間的增加導致多糖的逐漸溶出，使得多糖得率先增加再平緩，當發酵時間一定時，料液比同樣決定了多糖的溶出量以及刺麒麟菜纖維內部和溶液的濃度差；圖2B 可以看出料液比與接菌量的響應曲面較陡峭，結合表3 中可知AB 交互項對多糖得率的影響顯著（P＜0.05），說明料液比與接菌量的交互作用對多糖得率影響較大；接菌量和發酵時間的等高線圖曲面比較平緩（圖2C），交互作用不顯著（P>0.05）。

2.3 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的分離純化

如圖3 所示，圖3A 為凍融法制備的L-ESP 洗脫曲線，圖3B 為鼠李糖乳桿菌發酵制備的F-ESP 洗脫曲線，將兩種粗多糖上樣于DEAE-52 層析柱，經過0、0.5、1、2 mol/L 的NaCl 溶液階段洗脫，測定總糖含量繪制洗脫曲線，各得到3 個組分，命名為LESP-1、L-ESP-2、L-ESP-3，F-ESP-1、F-ESP-2、FESP-3。據報道硫酸根的存在能夠顯著提高植物多糖的生物活性[31]，因此對三個組分的硫酸根含量進行測定，并結合得率選取L-ESP-3 和F-ESP-3 作為后續實驗的樣品。

圖3 L-ESP（A）和F-ESP（B）的DEAE-52 洗脫曲線Fig.3 DEAE-52 elution curves of L-ESP (A) and F-ESP(B)

2.4 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的化學成分分析

將L-ESP-3 與F-ESP-3 經三氟乙酸水解后還原乙酰化得到用于檢測的糖醇乙酰酯衍生物，利用氣相色譜法進行單糖組成的檢測。取九個單糖標準品混合處理后測得標品的氣相色譜圖，如圖4 所示，與標準品的保留時間對比發現：L-ESP-3 主要成分為半乳糖（91.14%）、含少量木糖（1.53%）與葡萄糖（7.33%），F-ESP-3 在儀器精度范圍內只檢出半乳糖，未檢出其他單糖。說明鼠李糖乳桿菌發酵消耗了葡萄糖并進一步轉化為半乳糖，改變了F-ESP-3 的單糖組成。Gao 等[32]同樣發現，植物乳桿菌發酵使苦瓜中葡萄糖含量降低，半乳糖含量升高。

圖4 L-ESP-3 及F-ESP-3 單糖組成的氣相色譜圖Fig.4 GC of monosaccharide composition of L-ESP-3 and F-ESP-3注：標準品：1.鼠李糖，2.巖藻糖，3.阿拉伯糖，4.木糖，5.甘露糖，6.葡萄糖，7.半乳糖，8.葡萄糖醛酸，9.半乳糖醛酸。

如表4 所示，L-ESP-3 與F-ESP-3 的總糖含量均達到98%左右，證明兩種方法均得到了純度較高的刺麒麟菜硫酸多糖，F-ESP-3 的還原糖含量為7.87%±0.09%較L-ESP-3（1.45%±0.10%）極顯著提升（P＜0.01）；二者硫酸根含量分別為28.76%±2.23%和28.40%±1.40%，硫酸根結構均未被破壞，說明這兩種方法均能夠保護多糖的硫酸根。同時發酵法還提高了刺麒麟菜硫酸多糖中還原糖的比例，乳酸菌發酵的酸性環境有效去除一部分蛋白質，且內毒素含量小于0.03 EU/mg，符合中華人民共和國藥典標準[33]。

表4 刺麒麟菜硫酸多糖化學組成成分表Table 4 Chemical composition ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides

2.5 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的物理性質分析

分子量測定結果如圖5 所示，L-ESP-3 分子量大于670 kD，與陳玉芳等[16]得到的刺麒麟菜多糖分子量相似（690.12 kD）；F-ESP-3 的分子量為33.58 kD明顯降低，分析可能是因為鼠李糖乳桿菌屬于乳酸菌，乳酸菌在代謝過程中可以產生大量胞外酶系，如纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等，這些非特異性酶能夠隨機降解多糖糖苷鍵[34]。同時也有相關報道認為發酵的酸性環境能夠使復雜多聚糖水解為低聚糖，導致分子量進一步降低[35]。孫菁雯[36]利用發酵復合酶解法制備的銅藻和龍須菜多糖＜3 kD 的組分含量上升，表明多糖被降解，本研究獲得了相似的結果。

圖5 刺麒麟菜硫酸多糖的分子量分布圖Fig.5 Molecular weight distribution of sulfated polysaccharides fromEucheuma spinosum

經計算，L-ESP-3 溶解度為56.51%±3.8%，F-ESP-3 的溶解度為89.33%±3.1%；L-ESP-3 和F-ESP-3 的比濃粘度分別為3.85±0.25 dL/g 和0.01±0.002 dL/g（P＜0.01），由此可知，益生菌發酵法制備的刺麒麟菜多糖黏度極顯著降低，溶解度極顯著提高。有研究表明聚合物溶液的粘度較高的原因在于當分子鏈長度遠大于溶劑分子，加上溶劑化作用，使其在流動時受到較大的內摩擦阻力，分子量大，分子鏈纏結越嚴重，使流動阻力變大，粘度升高[37]。所以分子量的降低可能是F-ESP 黏度降低的主要影響因素。

如圖6 所示，L-ESP-3 的微觀結構整體呈片狀，3000 倍放大后，可以看到結構非常完整且表面光滑致密，而F-ESP-3 微觀結構截然不同，呈現不規則顆粒狀，3000 倍放大后，發現表面粗糙有裂紋，內部結構具有大量孔隙。刺麒麟菜多糖作為卡拉膠多糖的一種，屬于天然高分子凝膠，有研究報道，天然高分子凝膠的表面粗糙度增加可能是因為糖鏈間一般通過氫鍵連接，當糖苷鍵斷裂后，導致糖鏈間氫鍵交聯密度變小，疇結構變大[38]。

圖6 刺麒麟菜硫酸多糖的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope picture ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharide

2.6 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜分析

如圖7 所示，在特征譜帶區3450 cm?1為O-H的伸縮振動，2923 cm?1為C-H 的伸縮振動[39]，這部分為多糖類的特征吸收，1641 cm?1為C=O 的特征吸收[40]，在指紋區1249 cm?1為O=S=O 的伸縮振動，說明該多糖含有硫酸酯基[41]，在1071cm?1處的特征吸收說明在主鏈中存在吡喃半乳糖，929 cm?1為C-O 上的3,6 內醚半乳糖殘基的特征吸收[42]；846 cm?1為吡喃糖環C4 上的C-O-SO3的特征吸收[43]，成苷的半縮醛羥基為α構型[44]，804 cm?1為吡喃糖環C2 上的C-O-SO3的特征吸收[43]，這與ι-卡拉膠的特征光譜相似[45]。綜上所述，兩種方式制備的多糖結構相似，發酵并未改變多糖的糖鏈結構，FESP-3 是一種含3,6 內醚半乳糖殘基的α硫酸吡喃糖。

圖7 刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides

2.7 發酵刺麒麟菜硫酸多糖的抗過敏活性評價

如圖8 所示，在10~400 μg/mL 濃度范圍內，LESP-3 和F-ESP-3 均無明顯細胞毒性，且RBL-2H3細胞活力均在90%以上，說明對細胞活力無顯著影響（P>0.05）。

圖8 刺麒麟菜硫酸多糖對RBL-2H3 細胞活力的影響Fig.8 Effect of polysaccharide sulfate fromEucheumaspinosumon the viability of RBL-2H3 cells

肥大細胞在效應階段受到致敏原刺激后脫顆粒，β-氨基己糖苷酶的大量釋放是肥大細胞脫顆粒的經典標志，可以引發體內炎癥風暴，導致嚴重的過敏反應，而抑制β-氨基己糖苷酶釋放可以有效緩解過敏癥狀[46]。大鼠嗜堿性粒細胞與肥大細胞相似，受抗原刺激同樣釋放β-氨基己糖苷酶，并被廣泛用作在細胞水平上研究過敏反應的替代和可靠模型[47]。如表5 所示，L-ESP-3 和F-ESP-3 兩個樣品組均可以抑制β-氨基己糖苷酶的釋放，抑制率均大于30%，呈濃度依賴，但F-ESP-3 較L-ESP-3 展現出更好的抑制活性，說明發酵刺麒麟菜硫酸多糖通過抑制β-氨基己糖苷酶的釋放進一步發揮抗過敏活性。

表5 刺麒麟菜硫酸多糖抑制β-氨基己糖苷酶釋放的活性評價Table 5 The activity ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides in inhibiting the release ofβ-hexosaminidase

3 結論與討論

通過單因素實驗和Box-Behnken 響應面優化，鼠李糖乳桿菌發酵制備刺麒麟菜粗多糖最佳條件為：料液比1:70，接菌量5%，發酵時間24 h，主次因素排序為接菌量>液料比>發酵時間，最佳條件下粗多糖得率為41.70%±2.00%；純化后的F-ESP-3 總糖含量為97.77%±1.1%，主要單糖成分為半乳糖，硫酸根含量為28.40%±1.40%，F-ESP-3 還原糖含量（7.87%±0.09%）對比L-ESP-3 的還原糖含量（1.45%±0.10%）極顯著提高（P＜0.01）；F-ESP-3 分子量（33.58 kD）較L-ESP-3（>670 kD）極顯著降低（P＜0.01），溶解度為（89.33%±3.1%）對比L-ESP-3 的溶解度（56.51%±3.8%）極顯著提高（P＜0.01），在相同濃度下，F-ESP-3 的比濃粘度為（0.01±0.002 dL/g）對比L-ESP-3 的比濃粘度（3.85±0.25 dL/g）極顯著降低（P＜0.01）；二者在微觀形態上，L-ESP-3 呈現均勻片狀結構，表面光滑結構致密，而F-ESP-3 呈現不規則顆粒狀，表面粗糙且內部具有孔隙結構；紅外結構上二者較為相似，均含有硫酸酯基和3,6 內醚半乳糖殘基，成環方式為α構型吡喃糖環，指紋區呈現ι-卡拉膠型多糖的特征吸收。同時F-ESP-3 的β-氨基己糖苷酶抑制活性高于L-ESP-3，呈濃度依賴。

綜上所述，鼠李糖乳桿菌發酵的方式并沒有破壞多糖的鏈環結構和硫酸基團，因為多糖的分子量和微觀結構的疏松多孔化，導致多糖骨架鏈間的氫鍵相互作用改變，親水基團外露，分散性能提高，從而提高溶解度，降低粘度。同時，分子量的降低進一步提高了F-ESP-3 透過細胞膜的能力，提高了生物利用度，從而更好地抑制RBL-2H3 細胞釋放β-氨基己糖苷酶，展現出良好的抗過敏活性。由于發酵多糖的糖苷鍵連接方式、空間構象、取代基團之間的非共價相互作用及抗過敏具體作用機理尚不清楚，因此對于發酵多糖高級結構和抗過敏活性之間的關系以及抗過敏作用靶點還需要進一步深入研究。