知母多糖復合酶提取工藝優化及其免疫活性

王歆彤，李朋月，吳蘭芳，武英杰，鄭玉光,3，劉叢穎，嚴玉平, ，景松松,

（1.河北中醫學院藥學院，河北石家莊 050200；2.河北中醫學院河北省中藥炮制技術創新中心，河北石家莊 050200；3.河北化工醫藥職業技術學院，河北石家莊 050026）

知母為百合科知母（Anemarrhena asphodeloidesBunge）的干燥根莖，為藥食兩用的藥材，具有清熱瀉火，滋陰潤燥的功效[1]。研究表明其主要含有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、木脂素類、黃酮類、多糖類等有效成分，多糖為主要有效成分之一[2?3]。藥理實驗表明，知母多糖具有明顯的降血糖、抗炎和抗氧化等活性[4?7]。尤其是，知母多糖還具有良好的免疫活性，實驗表明熱水提取知母多糖可以促進小鼠巨噬細胞RAW264.7 釋放NO，促進分泌因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-1β和COX-2 的表達，進而增強巨噬細胞的免疫活性[8?9]。

知母多糖提取主要方法包括熱水提取、超聲波提取[10?11]。熱水提取需要高溫、提取時間長，可能導致非活性成分的共提取，并對活性成分產生不利影響[12]；超聲波提取方法要求設備復雜，較難實現工業化。酶輔助提取具有操作簡單、高效、環境友好、易于保持多糖結構的優點，酶輔助提取多糖已經成為研究熱點[13]。由于植物細胞壁組成結構復雜，單一酶破解細胞壁及細胞膜結構較難，易導致成分溶出不完全。復合酶解法可針對植物細胞壁組成和結構，充分破壞植物細胞結構，條件溫和，在多糖提取率提高的同時，可有效保護多糖的結構和活性[14]。其中，纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶為常用酶類[15?17]。目前，對知母多糖成分的研究，主要集中在熱水提取知母多糖的結構研究及其藥理活性方面，而針對復合酶提取知母多糖未見報道，知母多糖的復合酶提取工藝有待研究。

本研究采用正交試驗確定復合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）配比，通過單因素實驗和響應面法優化建立一種新的復合酶法提取知母多糖的工藝，同時采用小鼠巨噬細胞RAW264.7 對復合酶提取知母多糖進行初步的免疫活性評價，以期為知母多糖的進一步研究開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

知母 采自河北張家口市尚義縣；經嚴玉平教授鑒定為百合科知母Anemarrhena asphodeloidesBunge 的干燥根莖；果膠酶（40 U/mg）、纖維素酶（3 U/mg）、木瓜蛋白酶（80×104U/g）、DEAE-52 纖維素、脂多糖 北京索萊寶科技有限公司。

VICTOR NivoTM酶標儀 珀金埃爾默有限公司；EYELA 旋轉蒸發儀、EYELA 水浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5804 R 冷凍型多動能臺式離心機 德國艾本德股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合酶提取知母粗多糖工藝 知母根莖去除雜質，切厚片（0.4 cm），置于50 ℃烘箱烘干，粉碎過40 目篩。預處理方法：取干燥的知母粉末500.00 g，加10 倍體積80%乙醇進行脫脂，干燥濾渣得脫脂知母殘渣，備用。參考復合酶提取多糖工藝[17?18]，稱取一定量的復合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶），加入pH 為5.5 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖鹽，在一定的溫度下恒溫酶解一定的時間，沸水浴滅酶10 min。酶提液過濾，濃縮，放置室溫。加入4 倍無水乙醇，在4 ℃冰箱放置24 h，4200 r/min 離心10 min，將沉淀用80%的乙醇洗滌3 次，去離子水復溶，采用3500 Da 透析袋透析，凍干后即得知母粗多糖（APSE）。多糖得率計算公式：多糖得率（%）=（提取得到的知母多糖質量/脫脂原料質量）×100

1.2.2 復合酶添加量的優化

1.2.2.1 單因素實驗 a.木瓜蛋白酶輔助提?。喝?.00 g 預處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，以木瓜蛋白酶的添加量（4000、8000、12000、16000、20000 U/g）為自變量，按照 1.2.1 的實驗步驟進行操作，測定多糖得率。

b.纖維素酶輔助提取：取5.00 g 預處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，以纖維素酶的添加量（750、900、1050、1200、1350 U/g）為自變量，按照 1.2.1 的實驗步驟進行操作，測定多糖得率。

c.果膠酶輔助提取：取5.00 g 預處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，以果膠酶的添加量（400、800、1200、1600、2000 U/g）為自變量，按照 1.2.1 的實驗步驟進行操作，測定多糖得率。

d.復合酶輔助提取及單酶對比：取5.00 g 預處理的知母粉末，保持液料比15:1（mL/g）、溫度55 ℃和酶解時間1.5 h 不變，添加木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶（根據1.2.2.1 中a、b、c 的試驗結果確定添加量），按照 1.2.1 的實驗步驟進行操作，測定多糖得率。對比分析各單酶以及復合酶對知母多糖的影響。

1.2.2.2 正交試驗設計復合酶濃度 在單因素實驗的基礎上，以木瓜蛋白酶（A）、纖維素酶（B）和果膠酶（C）添加量為自變量，以知母多糖得率為因變量，進行三因素三水平正交試驗，確定最佳復合酶配比，試驗設計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

1.2.3 復合酶提取條件的優化

1.2.3.1 單因素實驗 a.酶解溫度：取5 g 經預處理的知母粉末，固定上述最佳酶配比，液料比為15:1（mL/g），提取時間為2 h。考察酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）對多糖得率的影響。

b.酶解時間：取5 g 經預處理的知母粉末，固定上述最佳酶配比，酶解溫度55 ℃，液料比為15:1（mL/g）?？疾烀柑崛r間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對多糖得率的影響。

c.液料比：取5 g 經預處理的知母粉末，固定上述最佳酶配比，酶解溫度55 ℃，提取時間2 h?？疾煲毫媳龋?0:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）對多糖得率的影響。

1.2.3.2 Box-Behnken 響應面優化試驗設計 在單因素優化實驗基礎上，選取液料比（A）、酶解時間（B）和酶解溫度（C）作為Box-Behnken 響應面試驗設計的3 個自變量，通過響應面試驗設計建立知母多糖得率（Y）與自變量之間的函數關系[19]。響應面試驗因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計因素水平表Table 2 Factor and level table of Box-Behnken experimental design

1.2.4 知母多糖的分離純化 采用DEAE-52 纖維素陰離子交換層析柱對知母粗多糖進行初步分離[20]。配制質量濃度為20.0 mg/mL 溶液，分別以蒸餾水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 和0.8 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，設置流速為1 mL/min，每管收集10 mL。根據苯酚-硫酸法[21]檢測總糖含量。

1.2.5 知母多糖對RAW 264.7 巨噬細胞的免疫活性

1.2.5.1 細胞復蘇和培養 將液氮中凍存的RAW264.7巨噬細胞，迅速解凍，37 ℃水浴1~2 min 使其融化。細胞解凍后，用75%酒精擦拭外壁，轉移無菌操作臺。將細胞轉移至離心管中，加入DMEM 完全培養基（含10%胎牛血清，1%青-鏈霉素），1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入完全培養基重懸細胞，轉移至培養瓶，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.5.2 細胞增殖實驗 采用MTT 法[22]檢測APSE-0、APSE-1、APSE-2 和APSE-3 的細胞存活率。細胞以2×105個/mL 接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于培養箱中培養24 h 后，棄去上清液。設置對照組（DMEM 培養基）、脂多糖組（Lipopolysaccharide，LPS，1 μg/mL）和試驗組（APSE-0、APSE-1、APSE-2、APSE-3：1、10、50、100、250、500 μg/mL），每組設置3 個重復孔，繼續培養24 h。吸取上清液，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的噻唑藍試劑（MTT），在培養箱中繼續孵育4 h。去除上清液后，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），充分振蕩3 min，在490 nm波長處測定吸光度。細胞增殖率（%）=（試驗組OD 值/細胞對照組OD 值）×100

1.2.5.3 NO 釋放量檢測 采用Griess 法[23]測定上清液中NO 的含量。將RAW264.7 細胞（5×105個/mL）接種在96 孔板，每孔100 μL，培養24 h。設置對照組、LPS 組（1 μg/mL）和 試 驗 組（APSE-0、APSE-1、APSE-2、APSE-3：1、10、50、100、250、500 μg/mL），每組設置3 個復孔，繼續培養24 h。收集上清液與Griess Ⅰ（5%磷酸中含1%磺胺嘧啶）和GriessⅡ（蒸餾水中含0.1% 1-萘二酰胺二鹽酸鹽）混合。10 min 后，在540 nm 波長下測定吸光度。根據標準曲 線（y=0.0165x?0.0226，R2=0.999）計 算 各 組 分NO 的相對釋放量。

1.3 數據處理

單因素實驗和免疫活性試驗分別采用Origin 2021 和GraphPad Prism 8.3.0 進行數據處理和繪圖，數據以平均值±標準差（SD）表示；響應面試驗數據利用Design-Expert 8.0.6 進行響應面設計及參數優化和統計分析；試驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 復合酶添加量配比優化

2.1.1 酶添加量對知母多糖得率的影響 纖維素、果膠是植物細胞壁的主要構成物質，纖維素酶可以高效地破壞細胞壁的組織結構，加快知母多糖的溶出[24]；果膠酶更多的是協同分解果膠為半乳糖醛酸等小分子，破壞知母細胞壁，分解細胞壁上的多糖基質；木瓜蛋白酶不僅對多糖的提取起輔助作用，還能夠有效酶解與多糖結合在一起的蛋白質，從而將多糖釋放出來，提高多糖得率。纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶添加量對知母多糖提取效果的影響見圖1，不同種類以及不同添加量的酶對知母多糖有明顯的影響，其中，木瓜蛋白酶添加量為8000 U/g 時多糖得率達到最高，隨著酶濃度的持續增加，多糖得率逐漸降低；纖維素酶添加量在750~1200 U/g 范圍內，多糖得率持續增加，添加量大于1200 U/g 時多糖得率變化較為平緩；果膠酶添加量在400~1200 U/g 時，多糖得率隨著添加量的增加而增加，繼續增加后多糖得率略有降低。因此，3 種單一酶的最佳添加量分別為木瓜蛋白酶添加量為8000 U/g，纖維素酶添加量為1200 U/g，果膠酶添加量為1200 U/g。

圖1 酶添加量對知母多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

木瓜蛋白酶、纖維素、果膠酶及復合酶（木瓜蛋白酶8000 U/g，纖維素酶1200 U/g，果膠酶1200 U/g）分別酶解知母制備知母多糖得率見圖2。實驗結果表明：3 種酶的復合酶提取效果最好，知母多糖得率為（9.81%±0.09%），均顯著大于纖維素酶（8.88%±0.10%）、木瓜蛋白酶（5.05%±0.05%）和果膠酶（3.37%±0.11%）（P＜0.05）。從生產效率的角度出發，選取3 種酶的復合酶對提取制備知母多糖的工藝進行優化。

圖2 果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶及復合酶對知母多糖得率的影響Fig.2 The effect of pectinase, papain, cellulase and compound enzymes added on the extraction yield ofAnemarrhenaasphodeloidesBunge polysaccharide

2.1.2 復合酶添加量配比對知母多糖得率的影響根據單因素實驗結果，對木瓜蛋白酶（A）、纖維素酶（B）和果膠酶（C）3 個因素進行正交試驗，以確定最佳酶配比，正交試驗設計以及結果見表3。分析可知，影響知母多糖主次因素依次是果膠酶（C）>木瓜蛋白酶（A）>纖維素酶（B）。最佳酶解條件為A3B2C3，因此，確定最佳復合酶的比例為木瓜蛋白酶16000 U/g，纖維素酶1200 U/g，果膠酶1600 U/g。在此復合酶比例條件下進行驗證試驗，重復3 次，測得知母多糖得率為（10.19%±0.03%）。

表3 L9（34）正交試驗結果Table 3 L9(34)orthogonal experiment results

2.2 酶解條件優化結果

2.2.1 單因素實驗結果

2.2.1.1 酶解溫度對知母多糖提取的影響 由圖3可知，多糖的得率在40~55 ℃之間隨溫度的升高而增加，當提取溫度為55 ℃時，多糖得率最高，溫度在55~65 ℃時，多糖得率迅速下降。這可能是由于復合酶在55 ℃時活性最強，分解細胞壁效果最佳。當溫度進一步升高時，酶蛋白開始受熱變性，使得酶活性逐漸降低，導致多糖得率下降[25]。故選擇酶解溫度50~60℃進行響應面試驗。

圖3 酶解溫度對知母多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

2.2.1.2 酶解時間對知母多糖提取的影響 時間處理也是提取知母多糖的一個重要因素。文獻研究表明[26]，較長的酶處理時間有利于多糖的產生。由圖4可知，1~2 h 得率隨酶解時間的升高而增加，當提取時間持續增加時，多糖得率有所降低，這可能是由于酶解時間過長，多糖穩定性下降，結構部分易被破壞，致使得率降低[27]。故選擇酶解時間1.5~2.5 h 進行響應面試驗。

圖4 酶解時間對知母多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

2.2.1.3 液料比對知母多糖提取的影響 如圖5 所示，多糖得率最初呈上升趨勢，在15:1 mL/g 時達到最大值。這可能是因溶劑增多擴大了反應體系中知母多糖與復合酶的接觸面積，隨著液料比的增加，提取液粘度降低，多糖分子更多的被溶出。當溶劑用量超過一定范圍時，會使得復合酶的質量濃度明顯降低，進而影響到酶的催化效率，這可能是后期隨著溶劑用量不斷增加，知母多糖得率反而降低的原因[28]。故選擇液料比為10:1~20:1 mL/g 進行響應面試驗。

圖5 液料比對知母多糖得率的影響Fig.5 Effect of liquid-solid on the extraction yield ofAnemarrhena asphodeloidesBunge polysaccharide

2.2.2 Box-Behnken 響應面試驗結果 本實驗以多糖酶解時間（A）、液料比（B）、酶解溫度（C）為自變量，以多糖得率（Y）為響應值，根據Box-Behnken 試驗設計原理在三因素三水平上對復合酶提取知母多糖工藝進行優化，試驗方案及結果見表4。

表4 試驗設計及結果Table 4 Experimental design and results

使用軟件進行多元回歸擬合，計算回歸系數，可以得到知母多糖得率對液料比（A）、酶解時間（B）和酶解溫度（C）的多項回歸方程：

Y=10.49?0.29A?0.12B?0.69C+0.09AB?0.22AC+0.38BC?1.41A2?1.84B2?0.58C2

從表5 的模擬方差分析中可知，P=0.001，說明此模型具有顯著性；矢擬項P=0.0550>0.05，表明模型擬合較好，在實際實驗中非正常誤差較??；模型的決定系數R2=0.95，表明此模型擬合度好，可用于模型分析和預測各因素對知母多糖得率的影響；變異系數CV=5.73%，CV 值越大表明該模型的置信度越高[29]。二次項C2對響應值多糖得率影響達到顯著水平（P＜0.05），一次項C、二次項A2、B2對響應值多糖得率影響達到極顯著水平（P＜0.01），說明酶解時間、液料比和酶解溫度對響應值的影響是非線性的；交互項均為不顯著項，表明交互項對多糖得率影響不明顯。根據F值，3 個因素對多糖得率影響關系依次為酶解溫度>液料比>酶解時間。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression models

2.2.2.1 等高線圖和響應面圖 三維圖形用于表示變量與響應值之間的關系及其相互作用，坡度越陡、等高線越密且橢圓程度越高，表明兩因素交互作用對結果的影響越顯著[30]。通過響應面的陡峭程度分析發現（圖6），3 個因素無明顯交互作用。

圖6 兩因素交互作用對多糖得率的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharide

2.2.2.2 模型準確性分析 試驗數據的殘差和響應設計如圖7 所示，圖7（A）顯示不同水平知母多糖響應值的殘差正態分布曲線圖，17 組響應值較為合理分布于一條直線兩側，無明顯偏差，表明模型擬合效果較好。如圖7（B）所示，實驗值與預測值相關性較高，表明本試驗建立的模型成功地加強了三個變量與響應值的聯系。通過建模擬合，對內部學生化殘差與17 組試驗運行數據進行分析如圖7（C），結果分析，所有數據在-3~3 之間，表明試驗數據模型中沒有有效誤差存在。通過以上回歸診斷分析，說明本實驗建立的復合酶法提取知母多糖工藝模型準確性較高，可用于知母多糖的提取制備。

圖7 Box-Behnken 模型準確性診斷圖Fig.7 Diagnostic plots for the Box-Behnken model accuracy

2.2.2.3 模型驗證 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到知母多糖提取的最佳工藝為酶解時間1.95 h，液料比14.72:1 mL/g，酶解溫度51.92 ℃，在此條件下知母多糖預測得率為10.71%?？紤]到實際操作的便利，最優工藝修正為酶解時間2 h，液料比15:1 mL/g，酶解溫度52 ℃，進行3 次驗證，知母多糖的得率為（10.58%±0.03%），驗證實驗結果與預測值的誤差為1.12%，說明此模型與試驗擬合度較好，對復合酶提取知母多糖的工藝優化合理、有效。

2.3 知母粗多糖的分離純化

知母粗多糖依次用蒸餾水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mol/L NaCl 洗脫后，制圖獲得4 個形態具有差異的峰，分別收集在蒸餾水、0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl 4 處峰內溶液，根據峰合并相應管內的樣液（圖8），蒸發濃縮、透析，冷凍干燥得4 種多糖組分，得率分別為56.8%、2.20%、3.92%和2.45%，多糖含量分別88.2%、70.4%、72.9%、80.6%，命名為APSE-0、APSE-1、APSE-2 和APSE-3。

圖8 DEAE-52 纖維素柱洗脫曲線Fig.8 DEAE-52 cellulose column elution curve

2.4 知母多糖對RAW 264.7 巨噬細胞的免疫活性的影響

2.4.1 細胞增殖實驗 巨噬細胞在先天和適應性免疫反應中起著關鍵的作用，活化的巨噬細胞可以吞噬病原微生物，處理和呈遞抗原，同時合成和分泌趨勢化因子和細胞因子，以增強機體的免疫防御能力[20]。如圖9 所示，與對照組相比，在100~500 μg/mL 濃度內，APSE-0（A）高度顯著促進RAW264.7 巨噬細胞增殖（P＜0.01）；在1~100 μg/mL 濃度內，APSE-1（B）和APSE-2（C）極顯著促進RAW264.7 巨噬細胞增殖（P＜0.001）。APSE-3（D）在1 μg/mL 濃度下，增殖率最高為（123.05%±6.05%）（P＜0.001）；與對照組相比，APSE-3 在100、250 和500 μg/mL 下極顯著抑制細胞增殖（P＜0.001）。因此，對于APSE-3 僅選擇濃度為1、10 和50 μg/mL 進行后續NO 釋放量的檢測。

圖9 不同濃度的APSE-0、APSE-1、APSE-2 和APSE-3 對RAW 264.7 巨噬細胞存活率的影響Fig.9 Effect of different components of APSE-0、APSE-1、APSE-2 and APSE-3 on the cell viability of RAW 264.7 cells注：與空白對照組相比，顯著*P＜0.05；高度顯著**P＜0.01；極顯著***P＜0.001；ns 無顯著差異P>0,05；圖10 同。

2.4.2 NO 釋放量 NO 是巨噬細胞免疫應答中分泌的炎性介質，具有抵抗病原體入侵和調節細胞凋亡等多種生理功能[31]。在評估多糖的免疫刺激活性時，NO 釋放的增加通常作為巨噬細胞活化水平的指標[32]。如圖10 所示，APSE-1 與對照組相比基本無顯著的差異，表明APSE-1 不能誘導NO 釋放（P>0.05）；與對照組相比，在實驗濃度內，APSE-0（A）、APSE-2（C）和APSE-3（D）均極顯著促進巨噬細胞NO 的釋放（P＜0.001）。APSE-2、APSE-3 所有濃度對RAW264.7 巨噬細胞都有很強的刺激作用。與對照組對比，APSE-2 處理組以濃度依賴性方式極顯著誘導NO 釋放（P＜0.001），其中，高劑量組（500 μg/mL）NO 分泌量為（14.94±0.06）μg/mL，基本與LPS 組（15.49±0.32）相當。結果表明：APSE-0、APSE-2 和APSE-3 可以刺激RAW264.7 巨噬細胞產生NO。NO 是成熟單核細胞極化為M1 型巨噬細胞后分泌的主要細胞因子或信號分子，M1 型巨噬細胞可產生活性氮或活性氧，發揮機體免疫調節[33]。由此可見，APSE-0、APSE-2 和APSE-3 可能是通過提高巨噬細胞對NO 的合成，促進M1 型巨噬細胞的成熟，調節巨噬細胞的免疫能力，這與CAO 等[8]的研究結果一致。而ZHANG 等[9]分離得到的知母多糖AAP70-1不能誘導NO 的產生，而是通過促進細胞免疫因子IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放，從而增強巨噬細胞免疫功能。而復合酶提取知母多糖能否通過調節細胞免疫因子水平而發揮免疫活性作用，有待進一步研究。

圖10 不同濃度的APSE-0、APSE-1、APSE-2、APSE-3 對RAW 264.7 巨噬細胞分泌NO 的影響Fig.10 Effects of different components of APSE-0、APSE-1、APSE-2 and APSE-3 on nitric oxide (NO) release of RAW 264.7 cells

3 結論

本研究通過正交試驗確定復合酶配比為木瓜蛋白酶16000 U/g、纖維素酶1200 U/g、果膠酶1600 U/g。采用響應面Box-Behnken 法優化復合酶提取知母多糖最佳工藝為酶解時間2 h，液料比15:1 mL/g，酶解溫度52 ℃，在此條件下得率為（10.58%±0.03%）。本實驗所采用的復合酶法提取知母多糖工藝具有總操作時間短、條件溫和、耗能低等優點，可用于知母多糖的實際生產中。

體外免疫實驗證明4 種知母多糖組分均能促進細胞增殖，并且APSE-0、APSE-2 和APSE-3 均能極顯著誘導NO 的釋放，表明APSE-0、APSE-2 和APSE-3 對RAW264.7 細胞的有較好的增強免疫活性。其中，APSE-2 對RAW264.7 細胞的免疫效果最好，可作為潛在的功能性食品或作為免疫力低下人群的膳食補充劑。研究表明不同提取方法可能對多糖的結構和免疫活性有顯著的影響[34?35]，本文初步證實復合酶提法所得知母多糖對RAW264.7 細胞有較好的增強免疫活性，后續將對不同提取方法所得知母多糖的結構特征、免疫活性及其作用機制做進一步研究。