植物乳桿菌-Gm4 發酵制備酸面團粉的工藝優化

張國華，賀霞霞，衛曉蓉，趙明利，張越洋

（山西大學生命科學學院，山西太原 030006）

酸面團（Sourdough）是以谷物加工產物、水為主要原料，接種微生物，經培養、發酵等工藝制成的產品[1]，其作為世界范圍內的傳統發酵劑具有悠久的歷史[2]，在歐洲不同的國家被分別稱為“Sourdough”、Lievitonaturale（意大利）、Levain（法國）、Sauerteig（德國）、Masa madre（西班牙）等，主要用于培烤食品。在我國，一般被稱為老面、酵子、面肥等，主要用作面食發酵。

酸面團是一種多菌種復合發酵劑，具有改善發酵面制品的風味[3]、延長貨架期[4]、延緩老化[5]、提高面制品的營養價值[6?9]等作用，主要分為三種類型：自然發酵型酸面團、接種發酵型酸面團和混合型酸面團[10]。李曉敏等[11]利用高通量測序技術分析發現酸面團中的優勢菌群有乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬及酵母屬等。MICHEL 等[12]的研究也得出相似結論，酸面團中的優勢菌種以乳酸菌和酵母菌為主[13]，HAMMESW 等[14]的研究證明植物乳桿菌是酸面團中典型的發酵菌種。不同的菌種在面團發酵過程中所起到的作用不同[15]，植物乳桿菌能優化面團的流變學性質[16?17]、提高面團的拉伸性能[18?19]、增加面團的烘焙體積[20]及延長面制品的貨架期[21]。植物乳桿菌利用糖類和蛋白質，產生某些風味物質的重要前體[22?23]，如小肽、游離氨基酸等，以及豐富的有機酸[24]，作為酸味劑賦予食品獨特風味[25]。此外，廖蘭等[26]的研究表明植物乳桿菌B02012 可以改變酸面團小麥的蛋白結構，并可應用于低敏發酵谷物制品的加工中。

國外相關研究表明在酸面團中接種乳酸菌進行發酵可延長其保質期，使酸面團易于儲存和運輸，已被廣泛應用于面包工業中[27]。相比之下，國內傳統酸面團的生產以家庭或小作坊自制為主[28]，由于缺少酸面團的相關產品標準，目前尚未有工業化生產的酸面團產品[29]。因此，實現優良菌種和新型發酵改良劑的工業化生產，對推進我國傳統發酵面食改良劑的工業化進程具有重要的現實意義[30]。

本研究以實驗室保藏的植物乳桿菌-Gm4（Lactobacillus plantarum-Gm4, LP-Gm4）為研究對象，在單因素實驗基礎上進行響應面試驗，優化植物乳桿菌發酵酸面團粉（簡稱酸粉）制備工藝，以期為開發適應工業化生產的發酵面食改良劑提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LP-Gm4 保藏于山西大學生命科學學院；mMRS培養基：麥芽糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉浸粉10 g、酵母粉5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1000 mL、pH（5.4±0.1）；五得利金特精高筋小麥粉 五得利面粉集團；燕牌高活性干酵母 樂斯福管理（上海）有限公司。

LY01-3 厭氧培養箱 上海龍躍儀器設備有限公司；CF340C 卡士發酵箱 中山卡士電器有限公司；HMJ-A35A1 小熊和面機 佛山市小熊廚房電器有限公司；JYS-A800 絞肉機 九陽股份有限公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；SC-3614 低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；雷磁pHS-3C pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LP-Gm4 菌株活化 挑取斜面保藏的LP-Gm4，接種至10 mL 無菌mMRS 液體培養基中，將其于32 ℃厭氧培養活化24 h。按1%的接種量接種于無菌mMRS 液體培養基中，厭氧培養得到LP-Gm4 發酵液，4500 r/min 離心5 min 收集沉淀得LP-Gm4 菌。

1.2.2 LP-Gm4 酸面團的制作 用無菌蒸餾水清洗LP-Gm4 菌兩次得菌懸液。將小麥粉、LP-Gm4 菌懸液和無菌蒸餾水按比例加入和面機中，和面10 min，保證面團得率[31]（D（%）=100×（面粉質量+水質量）/面粉質量）為150%。手工揉制3~5 min 保證面團呈表面光滑，置于發酵箱，在相對濕度80%、選定的時間和溫度條件下發酵。

1.2.3 LP-Gm4 酸面團制備工藝的單因素實驗 以LP-Gm4 酸面團的pH 和總可滴定酸度（total titratable acidity，TTA）值為指標，設定LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發酵時間為12 h，探究發酵溫度（20、25、30、35、40 ℃）對LP-Gm4 酸面團品質的影響；設定LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發酵溫度為30 ℃，探究發酵時間（8、12、16、20、24 h）對LP-Gm4 酸面團品質的影響；設定發酵時間為12 h，發酵溫度為30℃，探究LP-Gm4 添加量（6、7、8、9、10 lg（CFU/g）小麥粉）對LP-Gm4 酸面團品質的影響。

1.2.4 LP-Gm4 酸面團制備工藝的響應面優化試驗

根據單因素實驗結果，按Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）和LP-Gm4 添加量（C）為自變量，以LP-Gm4 酸面團的TTA 值（R）為響應值進行響應面優化試驗，試驗因素水平如表1 所示。

表1 響應面實試驗因素水平設計Table 1 Response surface test factor and level design

1.2.5 LP-Gm4 發酵酸粉制備方法 采用響應面試驗優化后的工藝參數制備LP-Gm4 酸面團，將其揉搓成小塊后置于篦上，放置到電熱恒溫鼓風干燥箱中35 ℃干燥6 h，再絞肉機碎制成LP-Gm4 發酵酸粉過40 目篩。

1.2.6 LP-Gm4 發酵酸粉饅頭的制作方法 LP-Gm4發酵酸粉饅頭的制作配方見表2，參考陳友磊等[32]的方法，將小麥粉、LP-Gm4 發酵酸粉、高活性干酵母、水按配方加入和面機攪拌10 min，手工揉制3~5 min 至面團表面光滑完整，將饅頭坯置于相對濕度80%、發酵溫度35 ℃的醒發箱中醒發40 min，隨后汽蒸25 min 即得饅頭樣品，樣品于室溫冷卻后裝袋密封。

表2 LP-Gm4 發酵酸粉饅頭配方Table 2 Formula of LP-Gm4 sourdough powder steamed bread

1.2.7 指標測定

1.2.7.1 LP-Gm4 活菌數的測定 參考GB 4789.35-2016 食品微生物學乳酸菌檢驗的操作步驟，在無菌環境下取1 mL LP-Gm4 培養液于裝有9 mL 滅菌蒸餾水的試管中，梯度稀釋至10?9濃度，選取3 個適宜濃度的稀釋液，各吸取100 μL 分別涂布至mMRS固體培養皿上，將培養基于35 ℃厭氧條件下培養48 h 后計菌落數，每個梯度做3 個平行。

1.2.7.2 LP-Gm4 酸面團的酸度測定 參考ZHANG等[33]的方法，測定pH 和TTA。準確稱取10.0 g LP-Gm4 酸面團樣品，加入少量無二氧化碳水，用磁力攪拌器中速攪拌10 min 后用無二氧化碳水轉移至100 mL 容量瓶中定容至100 mL。以pH 計測定所得樣液即LP-Gm4 酸面團pH，每份樣品平行測定3 次。

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以0.1 mol/L 的NaOH 標準溶液將上述樣液滴定至pH 為8.2，記消耗標準溶液體積的數值為V1，用無菌水代替試液進行空白實驗，重復上述操作，記空白試液消耗標準溶液體積的數值為V2。樣品中TTA 用乳酸質量分數X 表示，數值以克每千克（g/kg）表示。根據以下公式計算TTA 值，計算結果保留一位小數，每份樣品平行測定3 次。

1.2.7.3 LP-Gm4 發酵酸粉理化及微生物指標的測定

在無菌環境中稱取25 g LP-Gm4 發酵酸粉置于滅菌錐形瓶中，加入225 mL 蒸餾水并用磁力攪拌器攪拌10 min。最后參照 1.2.7.1 進行稀釋涂布并計菌數，并參照GB 5009.3-2016 食品中水分的測定中的直接干燥法測定LP-Gm4 發酵酸粉中的水分含量，參照 1.2.7.2 測定pH 和TTA 值。

1.2.7.4 LP-Gm4 發酵酸粉饅頭的感官評價 參考張國華等[34]的感官評定方法，遴選6 名（男女各半）食品專業的成員組成評定小組，對LP-Gm4 發酵酸粉饅頭進行感官評價，滿分為100 分，實驗三次重復后取均值。LP-Gm4 發酵酸粉饅頭的感官評分標準見表3。

表3 LP-Gm4 發酵酸粉饅頭感官評分標準Table 3 Sensory scoring criteria of LP-Gm4 sourdough powder steamed bread

1.3 數據處理

利用Excel 2019 及Origin 2021 進行數據分析和圖表繪制，采用Design Expert 8.0.6 進行響應面分析，數據顯著性分析利用ANOVA 進行，P＜0.05 判斷差異顯著，P＜0.01 判斷差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵溫度對LP-Gm4 酸面團pH 和TTA 值的影響 在LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發酵時間為12 h 的條件下，不同發酵溫度對LP-Gm4酸面團pH 和TTA 值的影響見圖1。隨著溫度的升高，LP-Gm4 酸面團的pH 先迅速降低，到達最低值3.65 后緩緩升高；TTA 值則先迅速升高，達到最高值9.3 后緩慢降低。二者的拐點都出現在發酵溫度為30 ℃時，可能是由于植物乳桿菌的最適溫度在30 ℃[35]，發酵溫度較低時LP-Gm4 活動受到抑制，生長緩慢，面團發酵不充分，產酸量不足；當發酵溫度到達適宜溫度時，LP-Gm4 生長旺盛，利用糖類和蛋白質發酵大量產酸；而隨著發酵溫度的持續升高，LPGm4 的活性降低。因此，選擇28~32 ℃的溫度范圍進行響應面試驗設計。

圖1 發酵溫度對 LP-Gm4 酸面團 pH 和 TTA 值的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on pH and TTA value of LP-GM4 sourdough

2.1.2 發酵時間對LP-Gm4 酸面團pH 和TTA 值的影響 在LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發酵溫度為30 ℃的條件下，發酵時間對LP-Gm4 酸面團pH 和TTA 值的影響，見圖2。隨著發酵時間的延長，LP-Gm4 酸面團的pH 有遞減趨勢，TTA 值呈現遞增趨勢。在發酵8~12 h 時，LP-Gm4 產酸速度最快；隨后LP-Gm4 酸面團的pH 緩慢降低，TTA 值略有升高。這可能是由于隨著時間的延長，有機酸等代謝產物逐漸積累，LP-Gm4 自身的生長受到抑制。因此，結合曲線變化趨勢，考慮經濟性，選擇發酵時間在10~14 h 范圍內，每間隔2 h 選擇實驗點進行后續響應面試驗設計。

圖2 發酵時間對 LP-Gm4 酸面團 pH 和 TTA 值的影響Fig.2 Effect of fermentation time on pH and TTA value of LP-GM4 sourdough

圖3 LP-Gm4 添加量對 LP-Gm4 酸面團 pH 和 TTA 值的影響Fig.3 Effect of LP-Gm4 added amount of bacteria on pH and TTA value of LP-Gm4 sourdough

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果及分析 在三組單因素實驗確定的數據基礎上，按照Box-Behnken 原理選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）和LP-Gm4 添加量（C）作為自變量，以LP-Gm4 酸面團的TTA 值（R）為響應值，設計三因素三水平的優化試驗共17 個。響應面數據結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface experimental design and results

通過對表4 實驗結果進行多元回歸擬合分析，得到以LP-Gm4 酸面團的TTA 值為響應值的擬合方程 Y=10.10+0.16A+0.90B+5.86C+0.55AB+1.48 AC+0.50BC+0.01A2?0.86B2+1.71C2。對模型進行顯著性檢驗，結果見表5。模型方差分析表明，該模型P＜0.0001，模型極顯著；失擬項P值>0.05，失擬項不顯著，表明該方程擬合程度較好。模型總決定系數R2=0.9780，校正決定系數=0.9497，說明此模型可以解釋94.97%的響應值變化，自變量選擇合適，可用來預測LP-Gm4 酸面團的TTA 值，具有較高的可信度和可行性。

表5 Box-Behnken 二次回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken quadratic regression model

由F值檢驗可獲得影響LP-Gm4 酸面團TTA值的主次因素為：LP-Gm4 添加量（C）>發酵時間（B）>發酵溫度（A）。其中，一次項B、C，二次項C2和交互項AC 對LP-Gm4 酸面團的TTA 值影響顯著（P＜0.05），而一次項A，二次項A2、B2和交互項AB、BC 對響應值的影響不顯著（P>0.05）。由此可知，各實驗因素對LP-Gm4酸面團的TTA 值的影響比較復雜，不是簡單的線性關系。

2.2.2 響應面交互作用分析 使用Design Expert 8.0.6 軟件對發酵時間、發酵溫度和LP-Gm4 添加量三因素及其之間的交互作用進行分析得到相應的響應面。交互作用的顯著性可以由等高線的形狀呈現出來，即趨于橢圓交互作用強，趨于圓形則相反[37]。由圖4 可知，發酵溫度（A）與LP-Gm4 添加量（C）之間的交互作用對LP-Gm4 酸面團TTA 值的影響最大（圖4-c），發酵時間（B）和LP-Gm4 添加量（C）之間的交互作用對LP-Gm4 酸面團TTA 值的影響最小（圖4-b）。在適當的發酵時間和溫度下，添加較高比例的LP-Gm4，面團TTA 值增長較快，這與單因素實驗結果一致。

圖4 各因素之間的交互作用對 LP-Gm4 酸面團 TTA 值的影響Fig.4 Influence of interaction of various factors on TTA value of LP-GM4 sourdough

2.2.3 響應面優化結果驗證 如前所述，有機酸過多的積累會抑制菌株的生長、降低面團的品質，而且酸澀的口感導致發酵終產品不被消費者接受，故以TTA=20 為目標值，根據回歸模型預測植物乳桿菌發酵面團的最佳發酵工藝參數為：發酵溫度31.76 ℃、發酵時間13.44 h、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麥粉，預測LP-Gm4 酸面團TTA 值為20。考慮實際操作的簡便性，將各參數修正為發酵溫度31.8 ℃、發酵時間13.5 h、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麥粉，在此優化條件下進行3 次重復性驗證實驗，實際測得LP-Gm4 酸面團TTA 值的平均值為20.1，與預測值之間沒有顯著性差異，說明實驗結果與模型擬合良好，通過響應面法優化得到的最佳工藝參數可靠性高。

2.2.4 LP-Gm4 發酵酸粉理化及微生物指標測定經工藝優化后制得的LP-Gm4 發酵酸粉微酸且帶有小麥香氣，在自然光下呈現淡黃色，其理化及微生物指標如表6 所示。

表6 LP-Gm4 發酵酸粉理化及微生物指標Table 6 Physicochemical and microbial indices of LP-Gm4sourdough powder

2.2.5 饅頭感官評定分析 使用優化參數制備的LP-Gm4 發酵酸粉制作饅頭，經評定小組品評打分后繪得感官評定雷達圖（圖5）。在4 組實驗樣品中，添加了LP-Gm4 發酵酸粉的饅頭感官評分優于未添加LP-Gm4 發酵酸粉的干酵母饅頭。且當LP-Gm4發酵酸粉添加量為1:8（實驗組2）時，饅頭的感官評分最高。由圖5 可直觀看出LP-Gm4 發酵酸粉饅頭在表皮結構、內部彈性、口感、滋味和氣味上明顯優于干酵母饅頭，而在表皮色澤和內部組織上與干酵母饅頭差異不明顯。

圖5 LP-Gm4 發酵酸粉饅頭感官評分雷達圖Fig.5 Sensory score radar map of LP-GM4 sourdough powder steamed bread

3 結論

通過單因素實驗及響應面試驗確定影響LP-Gm4酸面團TTA 值的主次因素為：LP-Gm4 添加量>發酵時間>發酵溫度。最佳工藝參數為：發酵時間13.5 h、發酵溫度31.8 ℃、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麥粉。此條件下制得的LP-Gm4 發酵酸粉具備較好的理化特性，其pH 為3.51，TTA 值為17.8，LP-Gm4菌數為7.2×108CFU/g。當LP-Gm4 發酵酸粉添加量為1:8 時，饅頭的感官評分高達89.9，相比干酵母饅頭具有更光滑完整的表皮結構、更細膩均勻的內部結構、更濃郁的麥香味和老面饅頭獨有的發酵香味。