刺五加多糖調控PI3K/Akt/mTOR 通路改善大鼠抑郁行為的作用

丁繼紅，姜春玉，楊 樂，王顯艷

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

抑郁癥是一種常見的精神類疾病，其主要表現為情緒低落、樂趣降低及興趣缺乏[1]。據世界衛生組織估算，全球大約有3.5 億人深受抑郁癥的困擾，且發病率逐年增加，已成為全球性公共衛生問題[2]。服用抗抑郁藥是當前治療抑郁癥的重要手段，但研究表明，經一線抗抑郁藥治療的患者中仍有30%癥狀難以得到有效緩解[3]。此外，現有的抗抑郁藥存在不良反應多、復發率高、有效率低及起效慢等缺點，而中藥在抗抑郁方面的研究近年來倍受矚目[4]。

刺五加為五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr. Et Maxim.） Harms）的莖或根莖，為傳統中藥材，藥食兩用，具有降血壓、抗炎、抗氧化、抗衰老等多種藥理作用[5]。研究發現[6]，刺五加-云芝配伍組合對抑郁模型小鼠的抑郁行為具有緩解作用；同時，臨床研究也證實，刺五加治療抑郁癥療效顯著[7]。雖然刺五加的抗抑郁作用在動物實驗及臨床研究中均已被證實，但其抗抑郁作用的功效成分目前為止并不清楚。植物多糖的抗抑郁作用已被多項研究證實[8?9]，其活性研究目前主要集中在保護肝臟損傷、增加免疫功能及抗炎、鎮痛等方面[10?12]，但刺五加多糖（Acanathopanax senticosuspolysaccharides，ASPs）的抗抑郁作用未見報道。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）與抑郁、阿爾茨海默病、癲癇等多種神經系統疾病密切相關，mTOR 的表達受上游信號分子磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3 kinases，PI3K）及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的調控[13]。此外，研究發現腦組織炎癥反應和氧化應激是相互影響的兩種病理過程，在包括抑郁癥在內的多種神經系統疾病中共同發揮致病作用[14?15]。本研究采用單籠孤養及慢性輕度不可知應激刺激建立大鼠抑郁模型，在明確刺五加多糖具有改善抑郁行為作用的基礎上，進一步探討該作用與調控PI3K/Akt/mTOR 通路及抗炎、抗氧化應激作用的相關性，旨在為刺五加多糖應用于抑郁癥的預防及治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加多糖 純度>80%，西安源森生物科技有限公司；鹽酸氟西汀 20 mg/粒，禮來蘇州制藥有限公司；大鼠血清白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）檢測試劑盒 上海晶抗生物工程有限公司；大鼠海馬組織過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 上海研啟生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒 上海原鑫生物科技公司；兔抗大鼠磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、PI3K、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、Akt、磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、mTOR 多克隆抗體及二抗 武漢三鷹生物技術有限公司。

3K-30 型低溫高速離心機 美國Sigma 公司；HM525 型冰凍切片機 美國Thermo Fisher 公司；CX23 光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；HBS-1096A型酶標儀 南京德鐵公司；PowerPac Basic 型電泳儀、Mini Transblot 型濕轉印槽 美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模及藥物處理 Wistar 大鼠50 只，SPF 級，成年雄性，體重180~220 g，哈爾濱醫科大學實驗動物學部[SCXK（黑）2019-001]。本研究獲齊齊哈爾醫院實驗動物倫理委員會審批（QMU-AECC-2021-122）。飼養1 周適應環境后，隨機分為正常對照組、模型對照組、鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組，每組10 只。正常對照組大鼠按時給予食水，常規環境飼養；其余各組大鼠均采取單籠孤養，并接受隨機循環進行的7 種慢性輕度不可知應激刺激（懸尾、夾尾、禁水、禁食、冰水游泳、電擊足底、黑白顛倒），7 種刺激輪流進行，每天進行1 種刺激，每周以不同的順序循環1 次，其中禁水、禁食不可接續進行，共計28 d[16]。從建模第1 d 開始灌胃給藥，鹽酸氟西汀及刺五加多糖均用蒸餾水溶解，鹽酸氟西汀組的給藥劑量為2.1 mg/kg[17]，刺五加多糖低、高劑量組的給藥劑量為60、120 mg/kg[18]；正常對照組和模型對照組灌胃蒸餾水，灌胃體積均為1 mL/100 g，1 次/d，共計28 d。給藥期間觀察并記錄各組動物活動、毛色光澤度及精神等一般狀態。

1.2.2 行為學指標檢測

1.2.2.1 敞箱實驗 自制敞箱，其內漆為黑色，長、寬、高均80 cm，底部均分為25 個方格。大鼠在敞箱適應2 min 后，拍攝記錄連續3 min 的自主活動；通過回放錄像，計數大鼠三爪跨格的水平活動次數[19]。

1.2.2.2 糖水偏好實驗 大鼠禁食、禁水24 h，然后進行糖水偏好實驗。每個鼠籠放置1 瓶1%蔗糖水和1 瓶純水，且每間隔0.5 h 更換一次位置，以排除位置因素的干擾[20]。自由攝水2 h（8:00~10:00），測定蔗糖水和純水的消耗量，計算糖水偏好度。糖水偏好度（%）=糖水消耗量/（蔗糖水+純水）消耗量×100。

1.2.2.3 強迫游泳實驗 在液面高度為50 cm、底面尺寸為30 cm×45 cm 的方形水桶進行強迫游泳實驗，實驗前1 d，大鼠需練習游泳15 min。水溫24~26 ℃，水深50 cm，大鼠自由游泳時間5 min，通過回放錄像，計時不動時間[21]。

1.2.3 海馬組織病理檢測 行為學指標檢測結束后，大鼠經10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，制備血清，低溫冰箱保存。大鼠處死后，冰上斷頭取腦，分離海馬組織，一部分放入液氮中保存；另外一部分經固定、梯度脫水、包埋切片后，以常規方法[22]進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及尼氏染色。

1.2.4 炎癥及氧化應激指標檢測 取凍存的血清，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟分別檢測血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平等炎癥反應指標；取凍存的海馬組織，準確稱重后制備勻漿液上清，按照試劑盒說明書中的方法分別檢測海馬組織CAT、SOD 活性及MDA 水平等氧化應激指標。

1.2.5 蛋白表達檢測 參考文獻[23]中的方法，通過Western blot 法檢測刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達的影響。取凍存的海馬組織，加入液氮于研缽中研磨，再加入蛋白裂解液，在4 ℃下離心（12 000 r/min，10 min）制備上清液，并通過BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。定量后，在沸水浴中使蛋白變性。配制濃縮膠（5%）及分離膠（12%），取30 μg 總蛋白進行SDSPAGE 電泳，分離目的蛋白。電泳結束后，轉膜至聚偏氟乙烯膜上，經脫脂奶粉（5%）封閉1 h，TBST 漂洗后，加入p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR 及mTOR 多克隆抗體（均為1:1500 稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗后，加入二抗（1:5000 倍稀釋），常溫孵育2 h。TBST 漂洗后，加入發光劑顯影，拍照后用Image J 計算灰度值，分析目的蛋白相對表達量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 刺五加多糖對抑郁模型大鼠一般狀態的影響

本研究采用單籠孤養及慢性輕度不可知應激刺激建立大鼠抑郁模型，該模型操作簡便、成本低廉、結果可靠，能夠很好地模擬抑郁癥患者情緒低落、樂趣降低、興趣缺乏及活動減少等典型癥狀[24]。建模前，各組大鼠尋覓探查等自主活動較多，皮毛光澤順滑，精神狀態良好；從建模第7 d 開始，模型對照組大鼠常蜷縮不動，自主活動減少，毛色晦暗無光澤，精神狀態逐漸變差；各給藥組大鼠較模型對照組自主活動增加，精神狀態有不同程度改善。

2.2 刺五加多糖對抑郁模型大鼠抑郁行為的影響

敞箱實驗、糖水偏好實驗及強迫游泳實驗是評價抑郁行為的經典實驗，其中敞箱實驗和強迫游泳實驗能夠反映小鼠的行為絕望，而糖水偏好實驗能反映快感缺乏程度[25?26]。王冰梅等[19]發現，合歡花-遠志單味藥及復合藥對均可以增加大鼠水平活動次數和糖水偏好度，縮短游泳不動時間，進而改善慢性不可預知應激大鼠抑郁樣行為。本研究結果同樣發現，模型對照組大鼠的水平活動次數、糖水偏好度極顯著低于正常對照組（P＜0.01），而游泳不動時間極顯著高于正常對照組（P＜0.01），表現出明顯的抑郁行為。與模型對照組比較，鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組大鼠水平活動次數、糖水偏好度極顯著增加（P＜0.01），而游泳不動時間顯著降低（P＜0.05、P＜0.01）。與鹽酸氟西汀組比較，刺五加多糖低劑量組大鼠水平活動次數及低、高劑量組糖水偏好度極顯著降低（P＜0.01），而游泳不動時間顯著增加（P＜0.05、P＜0.01），見表1。以上結果表明，刺五加多糖具有改善抑郁模型大鼠抑郁行為的作用。

表1 刺五加多糖對抑郁模型大鼠抑郁行為的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of ASPs on depressive behavior in depression model rats (±s, n=10)

表1 刺五加多糖對抑郁模型大鼠抑郁行為的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of ASPs on depressive behavior in depression model rats (±s, n=10)

注：與 正常對照組相比，**表示P＜0.01 ；與 模型對照組相比，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01 ； 與鹽酸氟西汀組相比，＆表示P＜0.05，＆＆表示P＜0.01；表2~表4同。

分組 劑量（mg/kg） 水平活動次數（次） 糖水偏好度（%） 游泳不動時間（s）正常對照組 / 52.55±6.42 83.37±8.63 45.23±4.41模型對照組 / 31.38±3.87** 40.24±5.11** 66.47±8.45**鹽酸氟西汀組 2.1 48.19±4.30## 65.88±6.09## 49.15±5.12##刺五加多糖低劑量組 50 37.27±4.75##＆＆ 47.90±4.52##＆＆ 59.91±7.58#＆＆刺五加多糖高劑量組 100 44.85±5.69## 51.67±6.64##＆＆ 54.03±5.31##＆

2.3 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織結構的影響

海馬組織與機體的情緒調節關系密切，研究發現，在抑郁模型動物的海馬組織中常常表現出較明顯的病理損傷，而抗抑郁藥可以通過改善海馬組織病理損傷，減輕抑郁癥狀[27]。本研究分別采用HE 染色及尼氏染色檢測了刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織結構的影響，結果見圖1。HE 染色結果顯示，正常對照組海馬組織細胞未見炎性浸潤、壞死等病理改變，細胞排列緊密，細胞形態及胞核完整，核仁清晰；模型對照組可見明顯炎性細胞浸潤、壞死等病理改變，細胞排列紊亂，結構模糊，核固縮；鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組炎性細胞浸潤、壞死等病理改變得到一定程度改善，且鹽酸氟西汀組改善效果更為明顯。尼氏染色結果顯示，正常對照組海馬組織染色均勻，尼氏體豐富，細胞排列整齊，胞核清晰；模型對照組尼氏體表達較低，細胞排列紊亂；鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組尼氏體增多，細胞形態較完整，細胞狀態明顯好轉，且鹽酸氟西汀組效果更為明顯。馮楚鈺等[28]利用單籠孤養及慢性輕度不可知應激刺激方法復制抑郁模型，發現刺激4周后，大鼠海馬組織出現炎性細胞浸潤、壞死等病理改變，與本實驗結果一致；而給予藥物治療后，海馬組織病理改變明顯減輕，進而發揮抗抑郁作用。以上結果提示，刺五加多糖也可以通過減輕海馬組織病理改變，從而起到緩解抑郁行為作用。

圖1 HE 染色及尼氏染色檢測刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織結構的影響（200×）Fig.1 Effects of ASPs on the structure of hippocampus in depression model rats evaluated by HE staining and Nissl staining （200×）

2.4 刺五加多糖對抑郁模型大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平的影響

炎癥反應是機體的一種自我保護機制，可限制有害刺激對身體的損害；同時，炎癥反應也是導致多種中樞神經系統疾病的重要原因，例如抑郁癥、癲癇及神經退行性疾病等[29]。研究表明，炎癥因子如IL-1β、IL-6 和TNF-α參與抑郁的發病過程，抗抑郁藥作用后，抑郁癥患者血清中炎癥因子恢復正常水平[30]。刺五加多糖對刀豆蛋白A 誘導的小鼠免疫性肝損傷的保護作用主要與抗炎作用有關，可以降低該模型小鼠IL-1β及TNF-α水平[31]。在本研究中，造模28 d后與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平均極顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01）；與鹽酸氟西汀組比較，刺五加多糖低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平均極顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01），見表2。以上結果提示，刺五加多糖能夠降低抑郁模型大鼠血清炎癥因子的水平，其改善抑郁行為作用與抗炎作用有關。

表2 刺五加多糖對抑郁模型大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of ASPs on levels of serum IL-1β, IL-6 and TNF-αin depression model rats (±s, n=10)

表2 刺五加多糖對抑郁模型大鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α水平的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of ASPs on levels of serum IL-1β, IL-6 and TNF-αin depression model rats (±s, n=10)

分組 劑量（mg/kg） IL-1β（pg/mL） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）正常對照組 / 12.93±1.47 5.74±0.61 44.23±5.46模型對照組 / 40.55±5.54** 71.31±8.70** 82.46±9.33**鹽酸氟西汀組 2.1 16.30±2.73## 13.54±1.18## 49.57±5.18##刺五加多糖低劑量組 50 27.58±3.45##＆＆ 42.96±5.43##＆＆ 73.79±6.51#＆＆刺五加多糖高劑量組 100 23.17±2.58##＆＆ 26.24±3.02##＆＆ 61.14±8.32##＆＆

2.5 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織CAT、SOD 活性及MDA 水平的影響

抑郁癥發病機制復雜，氧化應激水平異常升高被認為是關鍵因素之一，臨床及動物實驗均證實，抑制升高的氧化應激水平可減輕機體抑郁行為，是抑郁癥治療的重要策略之一[32?33]。機體內CAT、SOD 等酶在體內發揮重要的抗氧化作用，而MDA 水平可反映機體氧自由基含量[34]。研究[35]發現刺五加多糖具有保護氧糖剝奪誘導的神經元氧化損傷作用，該作用與提高SOD 活性及降低MDA 水平有關。本研究結果同樣發現，與正常對照組比較，模型對照組大鼠海馬組織CAT、SOD 活性極顯著降低，MDA 水平極顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組大鼠海馬組織CAT、SOD 活性顯著增加，MDA水平極顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01）；與鹽酸氟西汀組比較，刺五加多糖低、高劑量組大鼠海馬組織CAT、SOD 活性顯著降低，MDA水平極顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01），見表3。以上結果提示，刺五加多糖改善抑郁模型大鼠抑郁行為的作用與抗氧化應激作用有關。

表3 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織CAT、SOD 活性及MDA 水平的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of ASPs on CAT, SOD activities and MDA level of hippocampus in depression model rats (±s, n=10)

表3 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織CAT、SOD 活性及MDA 水平的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of ASPs on CAT, SOD activities and MDA level of hippocampus in depression model rats (±s, n=10)

分組 劑量（mg/kg）CAT（U/mg）SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）正常對照組 / 11.30±1.48 71.62±8.55 6.12±0.81模型對照組 / 5.49±0.69** 32.87±4.61** 18.51±2.25**鹽酸氟西汀組 2.1 10.92±1.21## 63.02±7.28## 10.18±1.34##刺五加多糖低劑量組 50 6.34±0.83#＆＆ 37.86±4.83#＆＆ 15.64±2.08##＆＆刺五加多糖高劑量組 100 9.48±1.06##＆ 46.65±5.30##＆＆ 13.17±1.56##＆＆

2.6 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達的影響

在真核細胞中PI3K/Akt/mTOR 通路廣泛存在，參與神經元細胞的生長、分化和發育過程，抑制PI3K/Akt/mTOR 通路的活性可引起神經元損傷[36]。在單籠孤養及慢性輕度不可知應激刺激誘導的抑郁模型中，PI3K、Akt 及mTOR 的磷酸化水平下調，而甘草素可以通過上調PI3K/Akt/mTOR 通路的活性減輕小鼠抑郁行為[37]。刺五加多糖激活PI3K/Akt通路的作用在糖尿病大鼠模型中同樣被證實，其可以增加該模型大鼠PI3K 及Akt 蛋白的磷酸化水平，進而調節糖、脂代謝功能[18]。本研究通過Western blot法進一步探討了刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達的影響，結果見圖2 及表4。與正常對照組比較，模型對照組大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達極顯著降低（P＜0.01），提示抑郁模型大鼠PI3K/Ak/mTOR通路的激活受到一定程度的抑制；與模型對照組比較，鹽酸氟西汀組及刺五加多糖低、高劑量組大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達顯著增加（P＜0.05、P＜0.01）；與鹽酸氟西汀組比較，刺五加多糖低、高劑量組大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達極顯著降低（P＜0.01）。以上結果表明，刺五加多糖可以激活抑郁模型大鼠PI3K/Ak/mTOR 通路。

圖2 Western blot 法檢測刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達的影響Fig.2 Effects of ASPs on the p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein expressions of hippocampus in depression model rats evaluated by Western blot

表4 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of ASPs on p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein expressions of hippocampus in depression model rats (±s, n=10)

表4 刺五加多糖對抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K、p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of ASPs on p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein expressions of hippocampus in depression model rats (±s, n=10)

分組 劑量（mg/kg） p-PI3K（PI3K） p-Akt（Akt） p-mTOR（mTOR）正常對照組 / 0.88±0.07 1.34±0.15 0.90±0.11模型對照組 / 0.37±0.04** 0.56±0.04** 0.23±0.03**鹽酸氟西汀組 2.1 0.75±0.08## 1.19±0.13## 0.81±0.09##刺五加多糖低劑量組 50 0.51±0.05##＆＆ 0.64±0.06#＆＆ 0.45±0.06##＆＆刺五加多糖高劑量組 100 0.63±0.08##＆＆ 0.92±0.10##＆＆ 0.66±0.05##＆＆

3 討論與結論

本研究采用單籠孤養及慢性輕度不可知應激刺激建立大鼠抑郁模型，探討刺五加多糖對抑郁行為的影響及分子機制。首先，通過行為學實驗結果發現，與模型對照組比較，刺五加多糖低、高劑量組大鼠水平活動次數、糖水偏好度明顯增加，游泳不動時間降低，且海馬組織結構病理變化得到緩解，表明刺五加多糖具有改善抑郁模型大鼠抑郁行為作用。進一步的研究證實，與模型對照組比較，刺五加多糖低、高劑量組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA 水平降低，CAT、SOD 活性及p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達增加，表明刺五加多糖改善抑郁行為作用與調控PI3K/Akt/mTOR 通路及抗炎、抗氧化應激作用有關。