煙草硝酸鹽轉運蛋白NtNRT1.7 基因的克隆、亞細胞定位及表達模式分析

尹卓然，王 馳，軒棟棟，羅 勇，連文力，賈宏昉*

1. 河南農業大學煙草學院，鄭州市文化路95 號 450002

2. 廈門大學生命科學學院，福建省廈門市翔安區翔安南路4221-120 號 361000

煙草是我國重要的經濟作物，在生產過程中常施用硝態氮肥以提升煙葉的產量和品質。硝態氮（NO3-）不僅是一種營養物質還可以作為信號分子調節葉片生長［1］。Tahir 等［2］研究表明植物吸收與利用硝態氮（NO3-）主要是通過硝酸鹽轉運蛋白（Nitrate transporter，NRT）完成的。當外部硝酸鹽濃度小于1 mmol/L 時，主要是NRT2 家族編碼的高親和硝酸鹽轉運蛋白系統（High-affinity nitrate transporter system，HATS）負責吸收和轉運硝酸鹽；當外部硝酸鹽 濃 度 大 于1 mmol/L 時，NRT1/PTR（Nitrate transporter 1/Peptide transporters，NPF）家族編碼的低親和硝酸鹽轉運蛋白系統（Low-affinity nitrate transporter system，LATS）負責對外部硝酸鹽進行吸收與轉運［3-6］。由于適合煙草幼苗根系生長和葉片生物量積累的氮濃度為4 ～6 mmol/L［7］，故在適宜植物根系與葉片生長條件下硝酸鹽的吸收、轉運和再利用主要由NRT1/PTR家族負責，該家族在植物正常的生長發育過程中發揮關鍵作用［8-9］。

目前植物中關于NRT1 基因家族成員的研究主要集中在擬南芥和水稻中。已發現擬南芥中有53個NRT1/PTR家族成員基因［10］，12個基因的功能已經明確［11］，其中：AtNRT1.4 參與葉柄中硝酸鹽的積累［12］；AtNRT1.5 主要參與硝酸根向木質部的裝載［13］；AtNRT1.6 主要影響擬南芥胚的早期發育［14］；AtNRT1.7主要參與介導擬南芥韌皮部硝酸鹽再利用的過程［15-16］。水稻中至少有80 個NRT1/PRT 家族成員［17-18］，7個基因的功能已經明確［11］，其中：OsNPF7.2［19］是水稻中第一個鑒定出的參與液泡NO3-運輸的NPF基因，對根細胞內硝酸根的平衡有重要意義；OsNPF2.2［20］參與了根中NO3-向地上部分的運輸。而煙草NRT1/PTR 家族成員至少有9 個成員，目前僅Liu 等［21］初步研究了煙草NRT1 家族的2 個基因，其中NtNRT1.1在根系中特異性表達，而NtNRT1.2主要在衰老葉片中強烈表達，其余煙草NRT1家族基因的功能研究還鮮見報道。因此，克隆煙草硝酸鹽蛋白家族成員NtNRT1.7，鑒定其同源關系，測定不同氮濃度處理和不同非生物脅迫下基因的表達模式，旨在探究NRT1.7基因在脅迫條件下對氮素的調控機制，為培養氮素高效利用新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

普通煙草品種K326在培養箱中培養，培養箱周期設置為16 h/8 h（光/暗），光強設置為300 μmol·m-2·s-1，溫度設置為28 ℃/22 ℃（光/暗），相對濕度設置為60%。對其進行不同氮素條件、鹽處理、干旱處理和低溫處理。正常處理所采用的營養液試劑及其濃度為：5 mmol/L NaNO3；1 mmol/L NaH2PO4·2H2O；1 mmol/L K2SO4；0.75 mmol/L CaCl2·2H2O；0.5 mmol/L MgSO4·7H2O；9 μmol/L MnCl2·4H2O；0.03 μmol/L（NH4）2MoO4；46 μmol/L H3BO3；8 μmol/L ZnSO4·7H2O；3 μmol/L CuSO4·5H2O；20 μmol/L FeSO4·7H2O和Na2-EDTA螯合物，pH調至7.0。采用霍格蘭營養液水培法，在種子露白后使用1/4正常營養液培養3 d，之后更換為1/2 正常營養液培養3 d，最后更換為正常營養液培養4 d，培養結束后開始處理。氮素處理：設置正常處理（CK：5 mmol/L NO3-）和低氮處理（LN：0.25 mmol/L NO3-）2 個處理，處理時間分別為7 d；鹽脅迫處理：150 mmol/L NaCl 處理7 d；干旱處理：10%的PEG-6000處理7 d；低溫處理：4 ℃處理3 h。結束后取各處理長勢一致的3株幼苗用去離子水洗滌，提取樣品的根、莖、幼葉和老葉（幼葉為完全展開的葉片從上往下數第2片，老葉為完全展開的葉片從上往下數第7片），獲得檢測基因表達模式分析的供試材料。

1.2 目的基因的克隆

參考煙草、擬南芥和水稻等物種在GenBank 收錄的NRT1 基因序列，應用Sol Genomics Network 和NCBI網站Blast程序搜索煙草EST序列數據庫。使用Primer Premier 6軟件設計煙草引物（表1），以煙草cDNA 為模板進行PCR 擴增，擴增條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個循環；72 ℃5 min。將擴增目的片段連接在中間載體pMD19-T 上，后送Invitrogen 生物公司測序驗證，獲得全長cDNA序列信息。

表1 RT-PCR和定量PCR擴增引物序列Tab.1 RT-PCR and quantitative PCR amplification primer sequences

1.3 序列分析方法

利 用NCBI 軟 件 的ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行基因序列的蛋白翻譯。利用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）和PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto mat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html）分析NtNRT1.7的蛋白結構，利用NetPhos 3.1（https：//services.health tech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預測NRT1.7 的磷酸化位點。利用TMHMM 2.0（https：//services.hea lthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預測NRT1.7蛋白的跨膜結構域。利用DNAMAN 進行蛋白質多序列比對分析；利用MEGA 6.0 制作鄰接樹（Neighbor-Joining Tree），分析NtNRT1.7 與NRT1 家族成員的親緣關系；在線網站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析序列基序（Motif），利用TBtools［22］將系統進化樹和Motif組合，對NRT1.7 與煙草、擬南芥和水稻中的NRT1 家族進行對比分析。

1.4 啟動子分析

以煙草NtNRT1.7 基因全長序列為探針，利用Sol Genomics Network 網站進行Blast 搜索基因全長，在起始密碼子ATG 上游取一段長1 500 bp 的啟動子序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線工具分析啟動子序列的順式元件。

1.5 亞細胞定位分析

設計帶有酶切位點的特異引物，將擴增得到的PCR 產物連到經內切酶酶切的pBWA（V）HS-GLosgfp 載體上，連接產物轉化到大腸桿菌DH5a 中，對陽性克隆進行測序驗證，獲得融合載體pBWA（V）HS-NtNRT1.7-GLosgfp。采用注射煙草表皮細胞的方法，將表達載體導入煙草表皮細胞，并置于22 ℃培養箱中培養30～60 h 后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白在煙草表皮細胞中的位置，未插入NtNRT1.7基因的pBWA（V）HS-GLosgfp空載體作對照。

1.6 基因表達分析

按 照Invitrogen 公 司 的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR檢測，實時定量的實驗數據以煙草組成型表達基因NtL25（GenBank：L18908.1）為內參基因，進行3 次重復試驗，采用2-ΔΔCT）算法進行分析。假設目的基因在脅迫處理下的表達量是對照（正常培養）的N 倍，N =2-ΔΔCT，ΔΔCT=Treat（CT樣品-CTL25）-CK（CT樣品-CTL25）［23］。

1.7 數據分析

使用DPS 7.5 軟件進行單因素完全隨機試驗統計分析，運用LSD 法進行多重比較，分析1%水平下的顯著性，運用Origin 2018 制作基因相對表達量柱形圖。

2 結果與分析

2.1 基因的克隆與序列分析

以K326 的cDNA 作為模板，進行PCR 擴增，瓊脂凝膠電泳結果（圖1）顯示克隆基因全長在1 500 bp和2 000 bp之間。進一步對克隆基因NtNRT1.7的全長進行序列分析，該序列全長為1 839 bp，可編碼612個氨基酸。

圖1 NtNRT1.7全長基因PCR擴增電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification of full-length NtNRT1.7

2.2 生物學分析

2.2.1 NtNRT1.7蛋白結構

分析NtNRT1.7 蛋白結構可知，其分子式為C3133H4877N793O859S30，分子量為68 358.78，理論等電點（pI）為8.91，含有45 個酸性氨基酸和53 個堿性氨基酸，不穩定性指數（Ⅱ）為40.08，屬于不穩定蛋白。該蛋白的二級結構主要包含了46.08%的α螺旋，12.42%的β折疊結構和37.91%的不規則卷曲結構。

由磷酸化位點分析結果可知，NtNRT1.7 中含有37個絲氨酸、16個蘇氨酸和7個酪氨酸，推測在這些位點可能發生磷酸化。

2.2.2 NtNRT1.7的跨膜結構域分析

圖2（0～1 之間）表示氨基酸位于螺旋、內部或外部的總概率，頂部（1～1.2 之間）表示NtNRT1.7 跨膜結構的最佳預測，也是總體最可能的結構。預測結果顯示NtNRT1.7含有12個疏水的跨膜螺旋區，其中在第6 個和第7 個跨膜區之間有一個中央親水環將其分隔為2組。

圖2 NtNRT1.7蛋白跨膜結構域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of NtNRT1.7 protein

2.2.3 NtNRT1.7同源性與系統發育樹分析

NtNRT1.7 與擬南芥、水稻中NRT1 家族成員的同源性分析結果如圖3 所示。 NtNRT1.7 與NtNRT1.1 和NtNRT1.2 同源性分別為30.95%和31.43%；與AtNRT1.7 的同源性達到57.23%；與水稻OsNRT1.7 的同源性達35.51%。NtNRT1.7 與擬南芥AtNRT1.7、AtNRT1.6 的親緣關系較近（圖4），同時NtNRT1.7與擬南芥AtNRT1.7含有相似的Motif。

圖3 氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homology analysis of amino acid sequences

圖4 NtNRT1.7系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of NtNRT1.7

2.3 啟動子分析

如圖5 所示，NtNRT1.7 除含有啟動子所必需的TATA-box和CAAT-box外，還含有3個脫落酸反應性涉及的順式元件（ABRE），1 個生長素反應元件（TGA-element）和3 個MBS。其中，ABRE 與轉錄因子結合，促進或抑制脫落酸誘導基因的表達，從而表現出加速或減緩植株衰老過程；TGA-element與生長素響應因子結合后可以促進或抑制基因的轉錄，從而影響植株的生長；MYB 與CAACTG 基序（MBS）結合激活了基因的表達，參與苯丙烷類代謝途徑，進而增強抗植株抗逆性。

圖5 NtNRT1.7啟動子克隆及啟動子順式元件分析Fig.5 NtNRT1.7 promoter cloning and analysis of its cis-elements

2.4 亞細胞定位

激光共聚焦顯微鏡下觀察到在細胞膜上存在GFP 信號（圖6），說明轉pBWA（V）HS-NtNRT1.7-GLosgfp 融合蛋白存在于細胞膜上，NtNRT1.7 為膜蛋白，可作為載體轉運物質進出細胞。

圖6 NtNRAT1.7亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of NtNRT1.7

2.5 表達特性

2.5.1 氮素處理下不同部位NtNRT1.7 基因的表達特性

圖7 可見，在正常處理下（CK：5 mmol/L NO3-），NtNRT1.7 主要在葉片中高表達，老葉相對表達量是根部相對表達量的105倍，葉片與根部的相對表達量間存在極顯著差異。在低氮處理下（LN：0.25 mmol/L NO），NtNRT1.7 在幼葉和根中的相對表達量有所增加，老葉中的相對表達量是正常處理下的20%，NtNRT1.7的相對表達量總體不及正常處理。整體來看，NtNRT1.7主要在葉片，尤其是衰老的葉片中高表達，低硝態氮處理時會抑制表達。

2.5.2 不同非生物脅迫下NtNRT1.7基因的表達特性圖8 可見，在不同生物脅迫下NtNRT1.7 基因的相對表達量均顯著增加。與正常處理相比，鹽脅迫、干旱脅迫與低溫脅迫條件下NtNRT1.7 相對表達量分別增加1.16 倍、1.29 倍和2.76 倍，存在極顯著差異。以上結果表明，NtNRT1.7 在煙草非生物脅迫應答方面發揮著重要的作用。

圖8 不同非生物脅迫下NtNRT1.7基因的相對表達量Fig.8 Relative expression of NtNRT1.7 gene under different abiotic stresses

3 討論

在煙草K326 中克隆出了NtNRT1.7 基因，對NtNRT1.7 進行了生物學分析。結果顯示NtNRT1.7包含12個跨膜結構，且在第6和第7個跨膜結構間有1個中央親水環，這與Tsay等［24］高等植物NRT1/PTR（NPF）在第6和第7個跨膜結構間有1個中央親水環的研究結果一致。NtNRT1.7與AtNRT1.7高度同源，親緣關系較近，此外還發現NtNRT1.7蛋白定位在細胞質膜上，Fan 等［16］的研究中也證實AtNRT1.7 蛋白定位于細胞質膜上，參與硝酸鹽的再利用，初步猜測NtNRT1.7是具有吸收和轉運硝酸鹽功能的膜蛋白。

進一步分析煙草NtNRT1.7 的表達特征發現該基因主要在衰老的葉片中表達，其表達量為幼葉的8倍，根部的105 倍；在低氮條件下，NtNRT1.7 在幼葉中表達增強，在老葉和莖中表達減弱，這是因為煙株吸收硝酸鹽后優先供給幼葉生長，之后轉運至中下部葉，最后到達根部［25］。在老葉中高表達暗示了NtNRT1.7 可能參與硝酸鹽的轉運和再利用；老葉和莖中表達量降低暗示了低氮條件抑制了NtNRT1.7對硝酸鹽的轉運。下一步可通過轉基因技術獲得NtNRT1.7過量表達的轉基因株系，研究NtNRT1.7在提高煙草氮素利用效率方面的功能。

NtNRT1.7 的啟動子中除含有TATA-box 和CAAT-box等組織特異性元件外，還含有參與防御和應激反應的特異轉錄因子［26-27］結合的順式元件。其中MYB 通過調控相關基因的表達來促進特定代謝產物花青素［28］的生成與積累，進而增強抗干旱能力，暗示該基因可能參與各種非生物脅迫的調控。因此，通過qRT-PCR 進一步研究NtNRT1.7 在不同非生物脅迫處理條件下的表達情況，發現NtNRT1.7 基因受干旱、高鹽和冷害的脅迫誘導并增強表達，這和啟動子序列分析的結果（含有3 個ABRE 基序，3 個MBS基序）一致，表明該基因可能參與了多種非生物脅迫下氮素的吸收與再利用。

4 結論

在煙草中克隆了低親和硝酸鹽轉運蛋白基因NtNRT1.7，研究了NtNRT1.7 的蛋白結構、跨膜結構域、同源性和亞細胞定位，發現該蛋白是膜蛋白，可能參與硝酸鹽的轉運。啟動子順式元件分析與基因的表達模式分析結果顯示，正常處理下NtNRT1.7 在老葉中高表達，低氮處理后NtNRT1.7 在老葉的表達量降低，非生物脅迫下表達量增強，說明該基因在受低硝態氮處理時抑制表達，可能參與調控煙葉非生物脅迫下硝酸鹽的轉運和再利用。