蒜氨酸體外抗菌機制的研究*

裴天容，李明強

(1.遵義醫科大學第一附屬醫院急診科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫科大學微免實驗室，貴州 遵義 563003)

大蒜為百合科，蔥屬植物的地下鱗莖，早期以食物調味劑進入人們的生活，已有千年歷史。大蒜素抗菌作用開啟了大蒜生物活性成分的研究進程，大蒜素具有抗菌、抗腫瘤、抗衰老、降低血脂血糖、調節免疫功能、防治心血管疾病、改善血液循環等多種生物學活性[1-4]。大蒜素包括二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物、二烯丙基四硫化合物等幾種含硫化合物，具有獨特的臭味和刺激性，均為脂溶性物質[5]。大蒜素脂溶性特征導致大蒜素注射液配制必須使用有機溶劑、助溶劑、增溶劑等，故而帶來了不良反應[6]。局部高濃度大蒜素的刺激性引起局部組織炎性反應，導致組織細胞受損[7-8]，以致大蒜素注射液臨床應用受限，療效達不到預期效果。為此人們將目光轉移到大蒜素前體物質——水溶性蒜氨酸。蒜氨酸與蒜酶同時使用引起蒜氨酸的藥理作用研究，在進行蒜氨酸藥理作用研究過程中采用蒜氨酸、蒜氨酸加蒜酶、大蒜素進行對比實驗發現，蒜氨酸的藥理作用顯著低于蒜氨酸加蒜酶、大蒜素的藥理作用[9-11]。同時，蒜氨酸與蛋白非特異性結合影響實驗結果[12]，影響人們對蒜氨酸的研究進程，更未見蒜氨酸體外抗菌機制的相關文獻報道。本研究探討了蒜氨酸在機體外的抗菌機制，以提高人們對蒜氨酸的認識，旨在為推動蒜氨酸的開發研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料 2020年3月從農貿市場購買紫皮大蒜參照文獻[13]方法分離提取蒜氨酸，分離的蒜氨酸經化學分析、紫外光譜分析、紅外、質譜和核磁共振波譜等鑒定結果與文獻[13]記載一致。配制成100 mg/mL蒜氨酸溶液，調節pH值至7.4備用。菌種為金黃色葡萄球菌(金葡菌)CMCC(B)26003、白色葡萄球菌(白葡菌)CMCC(B)26101、大腸桿菌CMCC(B)44102、傷寒桿菌CMCC(B)50037等。杜氏改良Eagle培養基(DMEM)培養液購于上海立菲生物技術有限公司(貨號：C11995500BT)，異硫氰酸熒光素(FITC)購于蘇州亞科科技股份有限公司(貨號：3326-32-7)，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司(貨號:PC0020),青霉素購于中諾藥業有限公司(批號：0121804114)，二抗購于Sigma公司(貨號：G7402)。超薄切片機生產廠家為Leica(型號Leica UC7)，鉆石切片刀生產廠家為Daitome(型號Ultra 45°)，透射電子顯微鏡生產廠家為HITACHI(型號HT7800/HT7700)。

1.2方法

1.2.1微量稀釋法檢測蒜氨酸最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度 參照文獻[14]的方法，細菌用大腸桿菌、傷寒桿菌、金葡菌、白葡菌16 h斜面培養物，無菌生理鹽水洗下菌苔，配制成0.5個麥氏單位菌液，再用DMEM培養液進行20倍稀釋，調至5×105CFU/mL，1 h內使用。蒜氨酸稀釋：用96孔板，每一塊板8排，每排12孔，每個蒜氨酸濃度40個復孔，22個濃度孔，大腸桿菌、傷寒桿菌、金葡菌、白葡菌4種細菌各做10個復孔。每孔加入DMEM培養液100 μL，從第1孔開始至第2排最后一孔，100 mg/mL蒜氨酸溶液100 μL加入第1孔，混勻后吸取100 μL加入第1孔混勻，倍比稀釋至第1排第10孔，第10孔混勻后吸取100 μL丟去，微量反應板上對蒜氨酸濃度進行倍比稀釋，第1孔濃度為50 000 μg/mL，第2孔濃度為25 000 μg/mL，第3孔濃度為12 500 μg/mL，第4孔濃度為6 250 μg/mL，第5孔濃度為3 125 μg/mL，第6孔濃度為1 563 μg/mL，第7孔濃度為781.3 μg/mL，第8孔濃度為390.1 μg/mL，第9孔濃度為195 μg/mL，第10孔濃度為97.510 μg/mL，第11孔濃度為48.750 μg/mL，第12孔濃度為24.380 μg/mL，第13孔濃度為12.190 μg/mL，第14孔濃度為6.094 μg/mL，第15孔濃度為3.047 μg/mL，第16孔濃度為1.524 μg/mL，第17孔濃度為0.762 μg/mL，第18孔濃度為0.386 μg/mL，第19孔濃度為0.193 μg/mL，第20孔濃度為0.096 μg/mL，第21孔濃度為0.048 μg/mL，第22孔濃度為0.024 μg/mL，第23孔為陽性對照，第24孔為培養基對照。第1孔至第2排第11孔每孔加入上述準備好的5×105CFU/mL菌液100 μL，第2排第11孔為細菌正常生長，陽性對照；第2排第12孔加入DMEM培養液100 μL為培養基對照，蓋好板蓋37 ℃培養24、48、72 h觀察結果。24 h結果觀察后用接種環挑取1環培養液劃線接種平板培養基(血液瓊脂或伊紅美藍培養基)。抑菌試驗培養板繼續培養72 h，分別收集第0孔至MIC孔培養液和陽性對照孔培養液，用熒光免疫技術檢測菌體表面結合蒜氨酸情況。

1.2.2免疫熒光檢測抑菌菌體表面蒜氨酸抗原

1.2.2.1FITC兔抗蒜氨酸熒光抗體的制備 利用本實驗室分離提取蒜氨酸免疫家兔制備多價抗體，參照文獻[15-17]進行抗體純化與FITC標記。

1.2.2.2抗體純化 取蒜氨酸免疫兔血清50 mL用0.06 mol/L pH 4.0醋酸鹽緩沖液調節pH值為4.5。按每毫升血清逐滴加入正辛酸至終質量濃度為25 μL/mL，室溫下充分攪拌30 min，10 000 r/min離心30 min取上清液，用0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)調節pH值至7.4，每毫升上述混合液加0.277 g固體硫酸銨，4 ℃攪拌30 min，5 000 r/min離心15 min，沉淀溶于0.005 mol/L氯化鈉溶液，裝入透析袋，置相同溶液中透析，每6 小時更換透析液1次，直至用奈氏試劑檢測透析液中無銨離子存在。采用BCA蛋白測定試劑盒測定抗體蛋白質量濃度，并調整質量濃度為1 mg/mL球蛋白。

1.2.2.3FITC標記抗體 取抗體蛋白總量為1 mg適量溶液用0.3 mol/L碳酸鈉溶液調節抗體溶液pH值至9.0，加入適量二甲基亞砜溶解FITC至終質量濃度為0.25 mg/mL，于室溫避光振蕩反應1 h，再加入1 mL DPBS、1 mL 4%聚乙二醇8000和1 mL 3%氯化鈉沉淀標記的抗體，5 000 r/min離心15 min，重復2次。用0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶解沉淀即為FITC標記的家兔抗蒜氨酸抗體。

1.2.2.4蒜氨酸抗原檢測 采用微量稀釋法經72 h培養后用無菌吸管吸取板孔中培養液于小試管中，1 000 r/min離心10 min，取上清液于10 mL離心管中，加入甲醛溶液至終濃度10%，室溫靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，棄上清液留取沉淀，用生理鹽水洗滌3次，用100 μL pH 7.4 PBS分散細菌，涂片、干燥、甲醇固定。在涂片上加入FITC兔抗蒜氨酸熒光抗體，濕盒中37 ℃培養1 h，用pH 7.4 PBS沖洗干凈，冷風吹干，于熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.3免疫電鏡觀察蒜氨酸在菌體內的分布

1.2.3.1標本準備 大腸桿菌和金葡菌12 h斜面培養物，用生理鹽水洗下菌苔，4 000 r/min離心20 min，離心洗滌3次，配制成9×109個/mL細菌濃度，分別分為2份，一份按每毫升加入100 mg/mL蒜氨酸溶液0.2 mL充分混勻，靜置30 min，加入甲醛溶液至終濃度為10%，靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，離心洗滌3次，配制成9×1010個/mL細菌濃度，為蒜氨酸陽性標本。另一份不加蒜氨酸處理，作為陰性對照。2份均4 000 r/min離心20 min，沉淀物用免疫電鏡固定液固定。標本經清洗、脫水、樹脂滲透、包埋、聚合等處理后進行70～80 nm超薄切片予4 ℃保存備用。

1.2.3.2免疫標記 鎳網從4 ℃取出用超純水懸浮5 min，清洗、封閉后加入1∶5稀釋的兔抗蒜氨酸抗體覆蓋標本后4 ℃過夜孵育；室溫復溫后用三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育 20 min后轉37 ℃烘箱孵育 1 h，然后轉室溫復溫0.5 h。實驗過程中防止干片。用三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗5次，每次5 min，超純水清洗5次，每次5 min；采用鈾復染后用70%乙醇清洗3次，超純水清洗3次；烘干，透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，黑色10 nm大小的金顆粒即為陽性表達。

2 結 果

2.1蒜氨酸體外抗菌結果 采用微量稀釋法培養24 h，4種細菌光密度(OD)值均呈現以第1孔最高，逐漸下降至OD值最低；大腸桿菌最低OD值為第14孔(1.16±0.09)，傷寒桿菌最低OD值為第13孔(0.94±0.06)，金葡菌最低OD值為第17孔(0.15±0.02)，白葡菌最低OD值為第17孔(0.19±0.03)，然后又逐漸上升至陽性對照孔，形成一個V型曲線。見表1、圖1。4種細菌OD值比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩兩比較以最低OD值孔為蒜氨酸對該菌的MIC。同時，第14孔蒜氨酸稀釋濃度為6.094 μg/mL，加入菌液后的最終質量濃度為3.047 μg/mL，因此，蒜氨酸對大腸桿菌的MIC值為3.047 μg/mL，由此蒜氨酸對傷寒桿菌的MIC值為6.094 μg/mL，對金葡菌和白葡菌MIC值均為0.386 μg/mL。96孔板培養24 h后用接種環于各孔挑取菌液劃線接種血平板和伊紅美藍培養基平板，經培養24 h平板上均有相應細菌生長。96孔板繼續培養72 h，大腸桿菌和傷寒桿菌第1孔至OD值最低孔的OD值均明顯低于陽性對照孔，差異均有統計學意義(P<0.05)；最低孔至陽性對照孔OD值均繼續升高。金葡菌和白葡菌各孔OD值無明顯變化。見表1、圖2。在收集培養液時可見培養基pH明顯升高，酚紅指示劑顏色明顯變紅，可嗅到淡淡的大蒜素氣味。

表1 蒜氨酸體外抑菌試驗OD值

續表1 蒜氨酸體外抑菌試驗OD值

圖1 蒜氨酸抑菌試驗24 h OD值曲線圖

圖2 蒜氨酸抑菌試驗72 h OD值曲線圖

2.2菌體表面蒜氨酸抗原檢測結果 熒光顯微鏡下可見綠色熒光的菌體，見圖3。對照孔無綠色熒光出現。革蘭陰性菌的菌體表面熒光較革蘭陽性菌薄，熒光強度也弱于革蘭陽性菌。

2.3免疫電鏡觀察 蒜氨酸陽性標本可見大腸桿菌和葡萄球菌菌體表面、細胞壁、細胞內均有較多的黑色金顆粒，表明結合了較多的蒜氨酸，結合蒜氨酸處細菌細胞壁、細胞膜、菌體內容物形態與陰性對照比較未見異常表現，陰性標本未見黑色金顆粒。革蘭陽性球菌表面與細胞壁黑色金顆粒較革蘭陰性桿菌菌多,見圖4。

A:大腸桿菌;B:葡萄球菌。

A：大腸桿菌免疫電鏡蒜氨酸陽性結果；B：大腸桿菌免疫電鏡蒜氨酸陰性結果；C：金葡菌免疫電鏡蒜氨酸陽性結果；D：金葡菌免疫電鏡蒜氨酸陰性結果。

3 討 論

本研究采用微量稀釋法結果顯示，蒜氨酸對大腸桿菌MIC為3.047 μg/mL，對傷寒桿菌MIC值為6.094 μg/mL，對金葡菌和白葡菌MIC值均為0.386 μg/mL。蒜氨酸對4種細菌均無殺菌作用。

從微量稀釋法培養不同時間結果分析可見第1孔至OD值最低孔OD值升高是由于蒜氨酸與大分子蛋白結合產生乳白色沉淀所致，OD值最低孔至陽性對照孔OD值升高為細菌生長所致。培養72 h大腸桿菌和傷寒桿菌由于細菌緩慢生長，導致第1孔至OD值最低孔OD值均明顯低于陽性對照孔，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明第1孔至OD值最低孔蒜氨酸與蛋白結合出現乳白色結合物沉淀，導致OD值明顯升高，由于細菌生長繁殖消耗大量蒜氨酸后結合蒜氨酸減少，乳白色結合物降低，OD值明顯下降。最低孔OD值與陽性對照孔OD值持續升高，72 h也是持續升高，表明是細菌生長所致。革蘭陽性菌由于細胞壁厚而致密、蛋白含量高結合大量蒜氨酸，嚴重阻斷了細菌與環境的物質交換，即使延長培養時間細菌也無生長表現。24 h培養物接種相應培養基，培養鑒定出相應細菌，說明蒜氨酸體外無殺菌活性。

在收集培養液時可嗅大蒜素氣味，也可見培養基pH升高，以大腸桿菌最為顯著。這是由于革蘭陰性菌細胞壁薄、脂質含量高而蛋白含量較低，蒜氨酸阻斷細菌與環境的物質交換的嚴重程度較低，細菌緩慢生長繁殖分解蒜氨酸產氨使培養基pH升高，產生的大蒜素濃度不足以殺死細菌，但可增強蒜氨酸抑菌作用，同時，大腸桿菌的營養要求較傷寒桿菌低，生長速度快于傷寒桿菌，提高了蒜氨酸對大腸桿菌的抑菌效果，致使蒜氨酸對大腸桿菌MIC值低于傷寒桿菌MIC值。

免疫電鏡下可見革蘭陰性桿菌表面熒光層較陽性菌薄，熒光強度弱于革蘭陽性球菌。免疫電鏡顯示革蘭陰性桿菌有較厚的外膜，黑色金顆粒較少；革蘭陽性球菌具有堅硬、厚實的細胞壁肽聚糖層，具有較多的黑色金顆粒，與免疫熒光檢測結果吻合。這是因為革蘭陰性細胞壁外膜脂質含量高，革蘭陽性菌細胞壁蛋白含量高，蒜氨酸與蛋白質非特異結合，所以，革蘭陽性菌黑色金顆粒較革蘭陰性菌多。由于蒜氨酸與細胞壁及外膜中蛋白結合，使蛋白空間構象改變，從而改變了細胞壁與細胞膜的通透性，阻斷了細菌與環境物質交換，抑制了細菌生長、繁殖，以致革蘭陽性菌MIC值(0.386 μg/mL)顯著低于革蘭陰性桿菌MIC值(3.047 μg/mL)。免疫電鏡觀察到菌體內均有黑色金顆粒，是因為蒜氨酸為小分子氨基酸類物質，因被動轉運進入細胞內。同時，蒜氨酸與菌體內功能蛋白(如酶蛋白)結合抑制細菌生命活動，具有較強的抑菌作用。由于革蘭陽性菌與革蘭陰性菌結構與化學組成不同，導致蒜氨酸與之結合存在差異，以致對不同細菌的抑菌作用也出現差異，與蒜氨酸MIC出現明顯差異的結果吻合。細菌菌體內、細胞壁、細胞膜、細胞器結合蒜氨酸處的形態、結構與陰性對照比較未見異常表現，當細菌離開蒜氨酸環境表現為正常生長、繁殖，顯示蒜氨酸無殺菌活性。

綜上所述，蒜氨酸能與菌體蛋白質、細菌酶蛋白結合阻止細菌與環境物質交換，抑制細菌生命活動，具有較強的抑菌活性；細菌緩慢的生命活動又可分解蒜氨酸，形成大蒜素，加強蒜氨酸抑菌效應。蒜氨酸無殺菌活性。