乳酸菌代謝低聚果糖/菊粉途徑及機理的研究進展

賴鯨慧，祝元婷，陳 媛，唐 林，陳貴希，李建龍，劉書亮,3,*

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610066；3.四川農業大學食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014）

低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）是由β-D(2→1)果糖基連接、末端有（或沒有）一個葡萄糖分子的碳水化合物，聚合度（degree of polymerization，DP）為2～10，分子式為GFn或FFn（G表示葡萄糖，F表示果糖基，n表示果糖基數）[1]。菊粉也稱菊糖，是由D-呋喃果糖分子以β(2→1)鍵連接而成的線性直鏈多糖，末端常帶一個葡萄糖殘基，常表示為GFn，DP一般在2～60。根據平均DP不同可分為3種：短鏈菊粉（DP≤10）、天然菊粉（2≤DP≤60）和長鏈菊粉（DP≥23）[2]。FOS和菊粉是研究最為廣泛的益生元，大量體內外實驗表明其可以選擇性調節腸道微生物，有助于宿主健康。

合生元又稱合生素，指益生元與益生菌結合使用的生物制劑（微生態制劑），具有益生功能及治療多種疾病的作用[3]。合生元可分為互補性合生元和協同性合生元。互補性合生元要求益生元和益生菌能產生益生效應，產生的影響是其中每個組分有益影響之和。協同性合生元各成分除應具有益生效應外，益生菌還應具有代謝益生元的能力。這是協同性合生元最大的優點，即益生元可為益生菌提供營養，賦予它與其他腸道微生物競爭的優勢，使得其在腸道定植和長期發揮益生作用成為可能。

乳酸菌屬于益生菌，是人體腸道菌群重要組成部分，具有多種益生功能，如代謝產生的短鏈脂肪酸、細菌素、過氧化氫可抑制或殺死腸道內的有害菌，維持腸道微生態平衡[4]。乳酸菌細胞內碳水化合物活性酶存在特異性[5]，對益生元的利用也具有特異性，因此，了解不同乳酸菌對FOS和菊粉的代謝情況可為合生元（特別是協同性合生元）的研究提供菌種資源，明確乳酸菌代謝FOS和菊粉的機制有利于合生元研究。本文對乳酸菌對FOS和菊粉的代謝能力差異、代謝途徑以及主要的代謝調控機制進行綜述，總結近年來FOS/菊粉合生元的應用，以期為益生元與益生菌進一步聯用提供參考依據，同時展望了未來的研究方向。

1 乳酸菌對低聚果糖和菊粉代謝能力的差異

FOS和菊粉被廣泛用于評價乳酸菌的益生功能。常以FOS或菊粉代替MRS培養基中的葡萄糖，觀察乳酸菌能否生長或能否達到在MRS培養基生長時的生物量。表1總結了近年來部分能利用FOS/菊粉的乳酸菌。能代謝FOS和菊粉的乳酸菌種類多樣，以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為主，乳桿菌對菊粉的利用較雙歧桿菌更常見。此外，乳酸菌與FOS和菊粉存在著特異性代謝關系，有的乳酸菌對FOS和菊粉均能代謝，如Lactobacillus paracaseiI321、L. caseiL1等，而Bifidobacterium longumB2a、B. bifidumB6A僅能代謝FOS[6]。

表1 近年報道的能代謝FOS/菊粉的乳酸菌Table 1 Overview of lactic acid bacteria capable of metabolizing FOS/inulin

乳酸菌在代謝FOS和菊粉時，對DP有不同偏好性。當FOS（DP為4）和長鏈菊粉（DP＞23）共同作為碳源時，L. paracaseisubsp.paracasei8700:2優先代謝FOS，且不受FOS的DP影響[20]。類似地，B. longumBB536會先代謝scFOS）[21]。然而L. delbrueckiiTU-1、L. delbrueckiiJCM 1002T會優先利用DP較高的FOS[22]。于雙歧桿菌而言，目前普遍認為其優先代謝低DP的FOS[21]。綜上所述，不同種類乳酸菌對不同DP的FOS的利用存在先后差異，因此代謝方式可能不同。

2 乳酸菌代謝低聚果糖和菊粉的途徑

通過薄層色譜法和高效液相色譜法檢測發現L. paracasei1195在用FOS替換葡萄糖的改良MRS培養基中生長時，培養液中果糖、蔗糖含量會短暫增加，細胞提取物沒有FOS水解酶活性[10,23]。在L. plantarumP14和P76的無細胞上清液和細胞壁提取物中檢測到了水解酶活性，在細胞質部分未檢測到[24]。相反，L. plantarumWCFS1培養液中未發現單糖和二糖的積累[25]，為此研究者們提出兩種乳酸菌代謝FOS的途徑。

2.1 水解轉運途徑

水解轉運途徑即先水解后轉運的途徑，對L. paracaseiDSM 20020[22]、L. paracaseiDSM 23505[26]、L. caseiIAM 1045[27]和L. plantarumP14、P76[24]等而言，FOS先在胞外被水解酶水解，然后一個或多個轉運蛋白將水解產物（果糖、蔗糖和葡萄糖）轉運進入胞內。以L. plantarumP14[24]為例分析其代謝過程：GFn和FFn型FOS或菊粉在胞外β-果糖苷酶作用下水解為果糖和scFOS，分別通過果糖和蔗糖磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）轉運系統進入細胞。即一方面scFOS在蔗糖PTS轉運系統作用下穿過細胞膜并被磷酸化，再在蔗糖-6-磷酸水解酶（也稱作β-果糖苷酶）作用下水解成6-磷酸葡萄糖和果糖，6-磷酸葡萄糖再在磷酸己糖異構酶的作用下轉化為6-磷酸果糖，果糖在果糖激酶作用下生成6-磷酸果糖，隨后進入糖酵解途徑（圖1）。另一方面，胞外果糖通過果糖PTS轉運系統后被磷酸化，在磷酸果糖激酶作用下生成1,6-二磷酸果糖繼續進行糖酵解。

2.2 轉運水解途徑

轉運水解途徑即先轉運再水解的途徑，如L. acidophilusNCFM[28]、L. delbrueckii[22]、L. plantarumST-III[29]以及L. plantarumWCFS[25]等是先通過轉運系統將FOS轉運進胞內，再在胞內水解酶作用下水解成單糖后被利用。雙歧桿菌多以此方式代謝FOS，如B. breveUCC2003[30]、B. adolescentisG1[31]、B. lactisDSM 1014[32]。以L. plantarumWCFS1[25]為例分析其代謝過程：乳酸菌通過蔗糖PTS轉運系統攝取胞外蔗糖或scFOS并將其磷酸化，接著胞內果糖苷酶作用于葡萄糖和果糖之間糖苷鍵生成果糖和葡萄糖-6-磷酸；果糖在果糖激酶作用下磷酸化成果糖-6-磷酸，最后進入糖酵解途徑（圖1）。有研究表明，轉運蛋白能力會隨FOS的DP增加而顯著減弱，因此，高DP的FOS、菊粉是通過先水解再轉運的方式被代謝[25,29]。但Tsujikawa等[22]發現L. delbrueckiiTU-1的轉運系統可直接將高DP菊粉型果聚糖轉運到胞內。因此，推測L. delbrueckiiTU-1代謝菊粉的途徑是先轉運再水解。

圖1 乳酸菌代謝FOS的途徑[25]Fig. 1 FOS catabolic pathways of lactic acid bacteria[25]

3 乳酸菌代謝低聚果糖和菊粉的分子機制

由上述乳酸菌代謝FOS途徑可知，水解酶和轉運系統在代謝過程中至關重要。許多研究表明水解酶和轉運系統的編碼基因一般位于同一個編碼FOS代謝的基因簇中，還包括相應調控因子基因。表2歸納了預測到的在一些菌株中與FOS或菊粉代謝相關的基因簇。粉乳酸菌在代謝FOS或菊時，可能會有多個相關基因簇參與。Saulnier等[25]比較L. plantarumWCFS1在MRS培養基和改良MRS培養基（葡萄糖替換為FOS）中基因表達情況，發現位于同一基因簇中分別編碼果糖激酶（sacK1）、蔗糖PTS轉運系統（pts1BCA）、β-果糖苷酶（SacA）、轉錄調節蛋白（SacR）和α-葡萄糖苷酶（Agl）基因的表達明顯增強。Goh等[23]運用微陣列分析發現一個由編碼轉錄調控蛋白（fosR）、果糖/甘露糖特異PTS轉運系統（fosABCD）、假定蛋白（fosX）和β-果糖苷酶（fosE）基因組成的fosRABCDXE操縱子參與了L. paracasei1195對FOS的代謝。Buntin[24]和Chen Chen[29]等發現L. plantarumST-III對FOS的代謝以及L. plantarumP14和L. plantarumP76對菊粉的代謝都有2 個相關基因簇參與。

表2 乳酸菌對FOS和菊粉代謝相關的酶及基因簇Table 2 Gene clusters and enzymes involved in metabolism of FOS and inulin in lactic acid bacteria

3.1 基因簇編碼蛋白

3.1.1 水解酶

與FOS和菊粉代謝相關水解酶有多種，均屬于GH32家族，如β-果糖苷酶（EC 3.2.1.26）[33-34]、菊粉酶（EC 3.2.1.7）[35-36]、果聚糖酶（EC 3.2.1.65）[35]和果聚糖β-果糖苷酶（EC 3.2.1.80）[26,37]等。許多研究者從分子水平證實了果糖苷酶對FOS的水解作用。如Chen Chen等[29,38]通過轉錄組分析發現了參與L. plantarumST-III代謝FOS的果糖苷酶（編碼基因為sacA），并用基因敲除實驗證明果糖苷酶獨立負責FOS水解，sacA基因在大腸桿菌和L. rhamnosusGG的成功表達也進一步證實了果糖苷酶對FOS的水解作用。由于代謝途徑存在胞內水解和胞外水解，水解酶也有胞內外之分，FOS胞外酶最典型特征是N端包含信號肽，C端有細胞壁的錨定位點LPQAG[23-24,39]。

通過分析酶水解產物和動力學常數發現，不同酶作用的糖苷鍵種類以及酶切位點有所不同，而且同一種酶在不同菌株中對底物的活性都存在差異。如菊粉酶是內切菊粉β(2-1)糖苷鍵，形成DP 3～6的FOS，果聚糖β-果糖苷酶卻作用于非還原末端的糖苷鍵，釋放果糖[40]。Ryan等[30]發現B. breveUCC 2003的果糖苷酶能夠催化裂解蔗糖或低DP的FOS中葡萄糖與相鄰果糖分子間的β(2-1)糖苷鍵，并且水解蔗糖時活力最高，然而B. lactisDSM 10140T果糖苷酶是裂解末端果糖之間的β(2-1)糖苷鍵，作用于FOS時活力高于蔗糖[30,32]。因此水解酶酶切位點的不同將會影響水解產物種類及比例，這可能會影響乳酸菌代謝FOS過程中參與的轉運蛋白種類。

研究表明果糖苷酶的底物特異性取決于其晶體結構。果糖苷酶三維結構具有典型的GH32家族蛋白結構特征：N端為含有催化位點的β-螺旋槳結構域（包括5 個β-折疊保守區域），C端為與底物結合有關的β-三明治結構域，酶活性中心位于β-螺旋槳結構的中心區域，Asp-63位點充當親核試劑，Glu-234位點作為廣義酸堿（圖2）[41-42]。據報道，通常果糖苷酶催化水解底物的機理是：Glu為底物氧原子提供質子，Asp作為親核體攻擊底物果糖殘基的異頭C-2碳原子，形成了果糖殘基-共價酶復合物，同時底物其余殘基被釋放，然后Glu從水分子中奪走一個質子（作為廣義堿）使得羥基取代酶-果糖殘基復合物的果糖殘基，從而釋放果糖使酶活性中心恢復[43]。此外，Mendoza-Llerenas等[44]認為β-螺旋槳結構域中擁有開放式漏斗狀通道的果糖苷酶比僅有一個空洞的果糖苷酶具有更廣泛的底物選擇性。

圖2 β-果糖苷酶的三維結構[41]Fig. 2 Three-dimensional structure of β-fructofuranosidase[41]

3.1.2 轉運系統

乳酸菌糖轉運系統主要有4種：PTS、腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）轉運系統、透性酶、同向轉運體[45]。就目前研究結果而言，蔗糖PTS和果糖/甘露糖PTS是參與乳酸菌代謝FOS和菊粉最常見的轉運系統，如L. plantarumWCFS1[25]、L. paracasei1195[23]、L. plantarumP14和L. plantarumP76[24]等；也有少數乳酸菌是通過ABC轉運系統和透性酶轉運FOS或其水解產物，如L. acidophilusNCFM[28]、B. breveUCC2003[30]等。PTS由磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）依賴性蛋白激酶I（PEP-dependent protein kinase enzyme I，EI）、組氨酸磷酸載體蛋白（histidine-phosphoryl protein，HPr）以及糖特異性酶II復合物（enzyme II，EII）組成，其中前兩者是無底物識別特異性的可溶性胞內蛋白，EII可特異性識別和轉運底物分子，并且包含4 個結構域（EIIA、EIIB、EIIC和EIID），但有的不含EIID[46]。PTS是一種需能量的可逆濃度運輸系統，碳源分子經過該系統轉運后會發生構象變化（被磷酸化）。一般PTS轉運過程為：HPr在EI的作用下接受來自磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基團被磷酸化，接著依次將磷酸基團傳遞給EIIA、EIIB，然后胞外碳源分子經EIIC、EIID轉運進胞內后接受磷酸基團成為磷酸化的碳源分子而被代謝[47]，其中EIIB的磷酸化和EIIC（EIID）的轉運是緊密相連的[48]。

乳酸菌在代謝FOS時參與的轉運系統可能不止1 個，如Chen Chen等[29]通過轉錄組分析和基因敲除實驗證明SacPTS1和SacPTS2編碼的蔗糖PTS轉運系統均參與L. plantarumST-III對FOS的轉運。Buntin等[24]發現L. plantarumP14、P76對菊粉的代謝有蔗糖PTS和果糖/甘露糖PTS轉運系統的共同參與。此外，從表2中可以看出，只要是先水解再轉運的菌株，其代謝過程中參與的轉運系統均有果糖/甘露糖PTS，從現有收集到的文獻推測，若乳酸菌在胞外水解FOS或菊粉，那么水解產物的轉運由果糖/甘露糖PTS轉運系統負責，如果是在胞內代謝FOS，那么參與的轉運系統可能為蔗糖PTS或ABC轉運或透性酶。

3.1.3 調控因子

目前已命名編碼參與FOS代謝調控因子的基因有MsmR、fosR、sacR、LacIfos。B. breveUCC2003中LacIfos產物的N端與GalR-LacI家族中和DNA結合的區域具有明顯相似性，即螺旋-轉角-螺旋結構，C端則是與糖結合區域[30]。此外，通過NCBI網站查詢到L. acidophilusNCFM、L. plantarumWCFS1、L. plantarumST-III調控因子是阻遏蛋白，分別為MsmR、SacR、SacR1；相反L. paracasei1195的調控因子FosR是轉錄激活蛋白。與FOS代謝相關的基因簇均受FOS或菊粉誘導，因此，探討乳酸菌代謝FOS/菊粉的機制離不開對其代謝調控方式的總結。

3.2 乳酸菌對FOS和菊粉的代謝調控

3.2.1 局部調控

局部調控即局部轉錄因子在有或無誘導物存在時，與操縱基因作用調控結構基因轉錄。Chen Chen等[49]在排除葡萄糖引起的全局調控情況下，通過基因敲除實驗證明編碼轉錄調控因子的sacR1和sacR2對L. plantarumST-III代謝FOS具有局部調控作用。Francke等[50]在植物乳桿菌WCFS1中發現了參與蔗糖或FOS代謝的局部轉錄調控因子Lp_0188（sacR）。因此，鑒于L. plantarumST-III和L. plantarumWCFS1在誘導物（FOS）存在時，基因簇被誘導表達，且基因簇中調控因子產物為阻遏蛋白，推測其局部調控方式屬于可誘導的負調控。即當FOS（誘導物）不存在時，阻遏蛋白與操縱基因結合，阻止結構基因轉錄；當FOS（誘導物）存在時，FOS與阻遏蛋白結合并從操縱基因上脫離，RNA聚合酶啟動結構基因的正常轉錄。而對L. paracasei1195而言，誘導物（FOS）存在時，基因簇同樣被誘導表達，但其基因簇中編碼調控因子fosR的產物是激活蛋白，推測其局部調控方式屬可誘導的正調控。即當FOS（誘導物）不存在時，激活蛋白以失活狀態存在，無法與操縱基因結合，因此結構基因不轉錄；當FOS（誘導物）存在時，激活蛋白被FOS激活，與操縱基因結合開啟結構基因的轉錄。此外Chen Chen等[49]通過電泳凝膠遷移實驗和染色質免疫沉淀技術證明了L. plantarumST-III的轉錄調控因子SacR1和SacR2能與啟動子區域的轉錄因子結合位點（transcription factor binding site，TFBS）以高親和力進行特異性結合。

3.2.2 全局調控

除局部調控外，乳酸菌對糖的代謝調控往往還有全局調控。全局調控是由易被宿主利用的糖（如葡萄糖）所誘導的代謝調控蛋白A（catabolite control protein A，CcpA）與代謝反應元件（catabolite response element，cre）結合完成的。CcpA對碳代謝物的調控可分為碳代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效應和碳代謝物激活（carbon catabolite activation，CCA）效應[51]。cre是CcpA介導CCR效應的重要順勢調控元件[52]。革蘭氏陽性菌中與CcpA結合的cre位點位置有所不同，有的位于啟動子區域，也有位于啟動子下游。有學者對L. plantarumST-III FOS代謝相關基因簇中潛在cre位點進行點突變并結合電泳凝膠遷移實驗證明CcpA與其4 個啟動子區域的6 個cre位點特異性結合[53-54]。這種直接與cre位點結合的方式為CcpA的直接調控，除此之外，CcpA還可通過間接調控來調控其他基因表達，即CcpA引起局部調控因子變化，從而使得受控于局部調控因子且啟動子區域不含cre位點的基因也因此而發生變化。如盧艷青[55]通過分析CcpA基因敲除前后利用FOS和葡萄糖的差異轉錄組發現，有些已確定發生了顯著變化的基因，其啟動子區域卻不含cre位點，推測這些基因可能受到CcpA間接調控。

在革蘭氏陽性菌中CcpA主要起負調控作用，即主要為CCR效應，也稱葡萄糖效應。比如L. paracasei1195在含低濃度葡萄糖的FOS環境生長時呈現典型二次生長現象，即葡萄糖先被利用，待葡萄糖利用完，FOS代謝相關基因才開始表達[23]。調控原理即：當葡萄糖等速效碳源存在時，胞內高水平ATP/Pi（ATP與無機磷酸比例）與葡萄糖代謝產物激活Hpr激酶/磷酸酯酶活性，將HPr的Ser46位點磷酸化，形成HPr-Ser46-P，然后HPr-Ser46-P與CcpA結合形成復合物，與非速效碳源（FOS）代謝基因簇啟動子區域cre位點結合，抑制轉錄；當葡萄糖不存在時，His15被HPr磷酸化，HPr-Ser46-P將失去磷酸化反應，FOS被正常利用，抑制效果消失[23,56]（圖3）。

圖3 CcpA介導的CCR效應Fig. 3 Mechanism of CcpA-mediated CCR effect in lactic acid bacteria

因此，乳酸菌對FOS（或菊粉，下同）的代謝調控（全局＋局部）大致可分為4種情況（以阻遏蛋白為例）：僅葡萄糖存在、僅FOS存在、葡萄糖和FOS均不存在、葡萄糖和FOS都存在（圖4）。只有葡萄糖時，局部調節基因產物（阻遏蛋白）與操縱基因結合，HPr-Ser46-P和CcpA結合形成復合物并與啟動子區域cre位點結合，阻止FOS代謝相關結構基因的表達；只有FOS時，結構基因的轉錄沒有CcpA復合物（即沒有CcpA復合物與啟動子區域的cre位點結合）抑制，阻遏蛋白與FOS（誘導劑）結合，從操縱基因上脫離，解除對FOS代謝相關基因的抑制；葡萄糖和FOS都不存在時，結構基因的轉錄同樣沒有CcpA復合物的抑制，阻遏蛋白與操縱基因結合抑制FOS代謝相關簇表達；葡萄糖和FOS都存在時，阻遏蛋白與FOS（誘導劑）結合，脫離結構基因，解除其對FOS相關基因簇啟動子區域的抑制，但是這時全局調節因子CcpA與啟動子區域cre位點結合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子結合，從而抑制FOS代謝相關基因的表達，即出現了CCR效應。乳酸菌對碳源的代謝調控非常復雜，有些基因只受局部調控因子作用，有的會受到全局調控和局部調控的雙重作用，同時有的局部調控因子還受到全局調控的作用，因此這背后復雜的調控網絡還亟待解析。

圖4 乳酸菌對FOS（或菊粉）的代謝調控Fig. 4 Metabolic regulation of FOS (or inulin) by lactic acid bacteria

總的來說，乳酸菌對FOS/菊粉的代謝機制為：在誘導物存在或者不存在的情況下，乳酸菌基因組中與碳代謝相關的調控蛋白啟動或抑制FOS/菊粉代謝相關基因簇的表達，即影響編碼水解酶和轉運蛋白基因的表達，進而實現對FOS或菊粉的代謝或不代謝。

4 低聚果糖或菊粉類合生元的應用

乳酸菌代謝菊粉或FOS的能力對于合生元（特別是協同性合生元）發揮生理作用起著重要作用。本文對近年來（2018ü2021年）關于菊粉/FOS合生元的報道進行了總結（表3）。研究表明菊粉/FOS合生元在對抗2型糖尿病的并發癥、調節免疫以及改善腸道健康方面具有積極的影響。Kanjan等[9]對協同性合生元進行了體外研究，發現將L. paracaseiI321（能降解菊粉）和菊粉同時應用到糞便菌群時，菊粉使得L. paracaseiI321在糞便菌群的競爭環境中存活并占優勢，同時其代謝過程分泌的胞外酶將菊粉水解為scFOS和果糖，刺激糞便中不能代謝菊粉但能代謝FOS的菌（乳桿菌和雙歧桿菌）的生長，使這些菌協同抑制沙門氏菌的生長。

表3 近年關于FOS/菊粉合生元的應用研究Table 3 Recent applications of synbiotics containing FOS/inulin

5 結 語

本文綜述了乳酸菌對FOS和菊粉的代謝能力差異，乳酸菌代謝FOS和菊粉的途徑、代謝機制以及FOS/菊粉類合生元的應用等。目前乳酸菌代謝FOS和菊粉的兩種途徑已較為明了，即先轉運再水解和先水解再轉運，但是更為深入、清楚的代謝機制，尤其是調控機制還亟待解析。新技術手段的發展，特別是基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學的發展，將為代謝機制的解析提供更好的手段。此外，雖然益生菌/益生元單獨使用均有益生效應，但是從實際應用以及長遠發展來看，合理利用代謝機制促進FOS或菊粉更有效地被乳酸菌利用、賦予乳酸菌與其他微生物競爭的優勢、開發科學健康的合生元（尤其是協同性合生元）產品將有望成為未來的熱門課題。