黃 劍,李書藝,祝振洲,熊光權,吳文錦,石 柳,何靜仁,丁安子,喬 宇,汪 蘭,*
(1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所,湖北 武漢 430064;2.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北 武漢 430023)
肌肉中的蛋白質按照各自溶解性的不同可主要分為3 類:水溶性的肌漿蛋白、不溶性的基質蛋白以及鹽溶性的肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)[1],其中MP含量最高,占肌肉蛋白含量的50%~55%左右[2],它對于蛋白質品質的影響非常顯著,也直接決定了肉品的風味特性、營養價值和加工性能[3-4]。但MP在加工貯藏過程中又極易發生氧化變質,對蛋白性質和肉品品質產生不利影響。一直以來,對于蛋白質氧化的研究大多關注于蛋白質氧化過程與人體衰老、疾病等方面的聯系[5-6],而對于食品體系中蛋白質氧化所產生的影響研究較少。這一方面是因為蛋白質氧化的機理相當復雜,對它的研究需要一個相對漫長的過程;另一方面是因為過去研究手段的不足和落后,以及消費者對于食品安全問題的不重視。然而近年來科技迅猛發展,人們生活水平不斷提高,消費者也對于食品安全問題越發關注,這使得對于食品體系中蛋白質氧化的研究成為熱點。一般來說,氧化對于MP的影響有氨基酸側鏈修飾、肽鏈骨架斷裂、蛋白質交聯聚集、空間構象改變、內部基團暴露以及功能性質改變等[7-8]。而同時MP的氧化也會對肉制品加工性能產生一系列不利影響[9-11],如肌肉嫩度降低[12]、肉色穩定性變差[13]、持水力下降[14]以及消化性降低[15]等。并且有研究發現,蛋白質氧化對其功能性質的改變受氧化程度的影響,氧化程度較低時,蛋白質氧化會增強自身功能性質(如凝膠特性),而氧化程度較高時則會對蛋白結構和功能性質產生不利影響,破壞肉品的口感和營養價值,甚至可能產生有害物質,進而影響肉品品質,威脅消費者的身體健康[16-17]。
在食品工業中,為了延緩蛋白質氧化進程,常見做法是加入抗氧化劑。但合成的抗氧化劑具有毒性以及各種弊端,再加上近年來消費者對于食品安全和營養健康等方面越發重視[18],對于天然抗氧化劑的研究成為熱點,尤其是多酚。多酚不僅是天然的植物提取物,還具有良好的抗氧化能力,并且在食品中添加的香辛料等物質中也常含有多酚[17],因此,它成為理想的合成抗氧化劑代替物。多酚與MP的相互作用不僅會改變MP的氧化進程,也會對多酚的抗氧化活性、蛋白質結構和營養特性等方面產生影響。本文綜述了MP氧化機制、多酚與MP相互作用機制和多酚的構效關系;探討了多酚與MP相互作用對蛋白質結構、功能和營養特性的影響,旨在為食品工業中多酚在肉品保藏中的應用提供理論指導。
由于動物被屠宰后體內抗氧化系統逐漸崩潰,肌肉中又充滿著各種金屬離子、血紅素等氧化誘發劑,體內的酶也開始溶解細胞組織,這使得死后動物體內的MP氧化反應極易發生并且反應快速。需要說明的是,在活體動物體內也會發生蛋白質氧化,但生物體內自有一套完整的抗氧化系統來阻止氧化反應的發生。
根據Soladoye等[8]的研究,MP氧化是一個在活性氧(reactive oxygen species,ROS)誘導下的蛋白質共價修飾反應。ROS是在細胞中廣泛分布的、具有生理活性的一類代謝產物,它主要來源于線粒體,由分子氧產生[19-20],是一類含氧的具有生物活性的大分子的統稱。ROS主要包括羥自由基(?OH)、超氧陰離子自由基、過氧化氫自由基(ROO?)、一氧化氮自由基(NO?)以及烷氧自由基、烷過氧自由基等[11,21]。其中超氧陰離子分布最為廣泛[22],羥自由基(?OH)氧化活性最強,危害最大[23]。一般認為,羥自由基(?OH)可由歧化反應和經典的芬頓反應(表1)產生[24-25]。

表1 芬頓反應歷程Table 1 Course of the Fenton reaction
研究表明,與肉制品中脂質氧化反應類似,MP的氧化也是一個自由基鏈式反應過程[26](表2)。首先,ROS奪取MP分子(PH)上的一個氫原子,使其成為碳中心自由基(P?)(第一階段)。在有氧環境下,P?會進一步反應生成POO?(第二階段)。POO?可從別的PH上奪取一個氫原子,或是與Fe2+發生氧化還原反應,亦或是被質子化的超過氧化自由基攻擊,最終都會生成烷基過氧化物POOH(第三階段)。POOH可繼續和過氧化自由基HO2?、Fe2+等反應生成烷氧自由基PO?(第四階段),此烷氧自由基PO?還可與HO2?、Fe2+等發生反應并最終生成羥基衍生物POH(第五階段)[16,27]。

表2 MP氧化過程Table 2 Course of myofibrillar protein oxidation
在工業生產中,通常加抗氧化劑來抑制MP的氧化,多酚是一種植物次生代謝產物,是公認的天然抗氧化劑,抗氧化效果顯著[28]。多酚來源廣泛,幾乎存在于所有植物中,并且蔬菜、水果、茶葉以及谷物中的多酚含量最高[29-30]。
多酚是多羥基酚類化合物的總稱,其共同特征是具有典型的酚環結構,即至少含有一個芳香環以及一個或多個羥基取代基[31-32]。目前已知的植物多酚就有8 000多種,關于多酚的分類也眾說紛紜,Singla等[30]將多酚簡單地分為黃酮類和非黃酮類,再根據其分子結構內的苯酚單元的數量、取代基團和/或苯酚單元之間的連接類型進行細分;錢敏[33]將植物多酚分為5 類,包括酚酸、黃酮類、單寧、芪類及木脂素;此外,Camelia等[34]將多酚分為3大類若干小類(表3),這種分類方式最為詳細具體,能讓人充分了解多酚的結構特點。
盡管多酚種類繁多,但對于MP氧化反應均表現出抗氧化活性,這些抗氧化效果由于多酚結構、濃度、pH值、溫度等環境條件的差異而不盡相同。張慧蕓等[35]采用羥自由基氧化體系研究不同多酚對于豬MP氧化的影響,結果表明,添加0.05%鞣酸和0.25%沒食子酸可顯著抑制MP中羰基與二聚酪氨酸含量的增加,抗氧化效果顯著。Rysman等[36]發現蘋果中的酚類化合物(綠原酸、表兒茶素、根內苷以及蘋果皮提取物)能夠在10 d內抑制MP中的蛋白質氧化。但Tine等[37]以乳化型香腸蛋白為研究對象,卻發現蘋果多酚與蛋白的共價作用能增加其羰基含量,同時導致巰基損失量顯著增加。賈娜等[38]研究發現添加兒茶素能減少MP羰基化合物的產生,但添加過量會促進MP氧化。Li Xuepeng等[39]研究發現低濃度的茶多酚對于MP具有很好的抗氧化效果,而高濃度時卻會促進氧化,這與Estévez等[40]的研究結果類似,即多酚對于MP的抗氧化作用與多酚濃度有關。袁圣亮等[41]研究了海藻多酚后,認為海藻多酚抗氧化活性與多酚濃度、提取工藝以及多酚結構都有關。Xu Mingfeng等[42]則認為酚類化合物的濃度、結構以及氧化條件都會影響其抗氧化效果。
多酚類物質的抗氧化作用主要包括3種機制[43]:螯合過渡金屬離子[44-45]、淬滅單線態氧[46-47]和清除自由基[48],除此之外還有抑制氧化酶等作用[49]。然而,有研究表明,不同的多酚會因為各自結構上的差異而導致它們在抗氧化活性上各有特點[50]。Xiao Jianbo等[32]認為黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的主要多酚類物質,其分子結構的多樣性是由中心吡喃環的羥基化模式和氧化狀態的變化引起的。2004年,Li Binghui等[51]研究了15種黃酮類化合物對動物脂肪酸合成酶的抑制作用,發現B環含2 個羥基、A環含5,7-羥基并結合C-2,3雙鍵的黃酮類化合物抑制效果最好。2005年,Li Binghui等[52]又發現在此抑制作用中,A環和B環起著重要作用,而C環不是必需的。Ahmadi等[53]研究了木犀草素與兒茶素的構效關系,發現兒茶素中的3-OH基團對于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的清除作用優于木犀草素中的1,4-吡喃酮部分。同樣,鐵離子還原法實驗表明,兒茶素在將單電子轉移到接受電子的自由基方面比木犀草素有更高的效力。Vu等[54]發現普洱茶多酚中茶黃素結構多樣性主要由其9 個-OH基團的變化引起,不同的3D構象被茶多酚系統內相互作用的復雜網絡所穩定,并且這種強化性和穩定性與自由基清除能力相結合。Kumaran等[55]研究表明多酚的抗氧化活性同自由基反應后形成的半醌自由基的穩定性及苯環上羥基的數量有關。Estévez等[40]研究了不同酚類物質(沒食子酸、花色苷、表兒茶素、綠原酸等)的構效關系,發現花青素的化學結構(黃酮陽離子)是其具有抗氧化能力的主要原因,因為B環中的3’,4’-二羥基(兒茶酚結構)提供了還原能力,而A和C環中的羥基和陽離子則使生成的自由基具有穩定性,并且C環上的3-糖基化增強了其自由基清除活性。染料木素B環上沒有兒茶酚結構也同樣具有相當的抗氧化活性,可能是因為異黃酮類物質由B環上的3’-羥基充當氫供體,而羰基與5’-羥基相互作用,形成穩定結構。此外,A環的5’-羥基與C環的4’-酮是異黃酮類化合物與金屬離子結合的關鍵結構。而沒食子酸的抗氧化活性則來源于其芳香環的3 個羥基(鄰苯三酚結構),并且其抗氧化活性明顯高于綠原酸。

表3 多酚的主要類別Table 3 Major categories of plant polyphenols
多酚的多羥基酚環結構決定了其具有獨特的抗氧化能力,這在肉制品加工保藏的應用中表現得尤為明顯。多酚對于肉品品質的提升主要體現在肉的嫩度、持水力以及肉色穩定性等方面[67]。嫩度主要由肌肉中結締組織、肌原纖維和肌漿蛋白含量與化學結構狀態決定,多酚可通過提高肌漿蛋白含量,改變肌纖維密度、直徑和橫截面積來提高肉的嫩度[68-69]。肌肉持水力是肌肉組織在加工貯藏過程中維持水分的能力,是評定肉質的重要指標,有研究表明添加多酚可顯著提高肌肉對水分的束縛能力[69-70]。肌肉中肌紅蛋白含量和存在狀態決定了肌肉肉色,而多酚可以一定程度上抑制肌紅蛋白氧化成高鐵蛋白,維持其肉色穩定性[71-72]。另外,多酚還能夠通過降低肌肉中丙二醛的含量來抑制脂肪氧化[73],這也有利于提升肉品品質。
多酚與MP之間的相互作用方式可分為兩種類型,即非共價相互作用與共價相互作用。這兩種作用在食品體系中可同時存在,并且前者占主要地位,一般可逆;而后者在食品體系中存在較少且不可逆[74]。
3.1.1 非共價相互作用
多酚與MP的非共價相互作用,主要包括疏水相互作用、范德華力、氫鍵、靜電相互作用等(圖1)。這些作用力通常較弱,因為它們不涉及共享電子對,并且總是可逆的[75-76]。其中,疏水相互作用和氫鍵是兩者非共價結合的主要作用力[77]。Jia Na等[78]研究了不同的兒茶素濃度對豬肉MP構象和凝膠特性的影響,發現兒茶素能使MP構象發生改變,低濃度時MP表面疏水性降低,高濃度時表面疏水性增加且巰基含量下降,推測這可能是由于兒茶素與MP非共價結合導致其疏水結構域暴露。呂衛金等[79]研究了茶多酚對冷藏大黃魚MP變性降解的影響,發現兩者的結合有疏水相互作用的參與,并且MP表面疏水性與結合時間呈顯著線性相關。有研究表明,非極性基團之間的疏水相互作用相對較強,它是由酚類物質的芳香環和蛋白質的疏水位點相互作用引起的[80-81]。Xie Wanlin等[82]的研究表明綠原酸與MP的結合依賴于范德華力和氫鍵,而槲皮素與MP的結合依賴于靜電相互作用。

圖1 多酚與肌原纖維蛋白非共價相互作用[17]Fig. 1 Non-covalent interaction between polyphenols and myofibrillar protein[17]
3.1.2 共價相互作用
一般來說,酚類化合物具有很高的生物活性,當氧、酚類化合物和多酚氧化酶同時存在時,酚類物質可被氧化成相應的半醌類和醌類,這些半醌和醌類能夠作為反應底物進一步與親核試劑發生共價反應,并且反應的先決條件是產生親電物質,由蛋白質提供親和側鏈進行親核加成[83]。很明顯的是,就酚類化合物的結構而言(小分子如酚酸,復雜分子如原花青素),結構越復雜,相應的反應產物也會越復雜。多酚與MP的共價作用就是通過前者氧化或親核加成形成醌或半醌自由基結構,從而與后者形成共價結構[84],具體來說,多酚與MP的結合主要有兩條路徑,其一是和MP的巰基反應形成“巰基-醌”加成產物,另一條路徑是和MP的氨基反應形成“氨基-醌”加成產物(圖2)。Rohn[85]、Rawel[86]和Kroll[87]等研究表明,在堿性條件和室溫下,不含多酚氧化酶時,可將蛋白質/酶與酚類和相關化合物進行衍生化,并且此衍生化反應是多酚與蛋白質共價結合的結果。Jongberg等[88-89]研究表明,酚類物質氧化形成醌與MP的巰基反應,使MP巰基和游離氨基水平顯著降低,并形成共價的巰基-醌加合物,此加合物的形成還受到不同加工條件的影響。Pan Jinfeng等[90]研究了不同劑量沒食子酸對氧化應激日本虹魚MP凝膠特性的影響,發現相比于單純的氧化MP,添加了高劑量沒食子酸的MP出現了一個較窄但強度較高的峰,說明高劑量的沒食子酸可與MP形成巰基-醌加合物,促進聚合。Chen Jinyu等[91]研究發現,(-)-表沒食子兒茶素和三聚磷酸鈉的添加均抑制了MP羰基的形成,但也促進了硫醇和游離胺基團的丟失,并且三聚磷酸鈉的存在增強了(-)-表沒食子兒茶素與MP的硫醇和游離胺之間的共價反應。Nie Xiaohua等[92]以葡萄籽原花青素和綠茶多酚為原料制備了MP膜,發現在結合膜中MP溶解度下降,蛋白質圖譜中主要蛋白條帶強度明顯下降,這表明苯酚與MP之間形成共價交聯。Nie Xiaohua等[93]還研究過以單寧酸和蘋果原花青素為原料制備MP膜,發現單寧與MP之間可通過非二硫共價鍵交聯,形成蛋白質-酚類-蛋白質聚合物。

圖2 多酚與肌原纖維蛋白共價相互作用[17]Fig. 2 Covalent interaction between polyphenols and myofibrillar protein[17]
早有研究表明,多酚與MP的相互作用會對MP的二、三級結構產生顯著影響,這些影響因多酚的濃度、化學結構等的不同而有差異[94]。MP的二級結構主要指的是α-螺旋和β-折疊,許多研究表明,加入多酚后,MP分子結構展開,會導致β-折疊含量的增加與α-螺旋含量的減少[95]。MP的三級結構主要通過其色氨酸熒光強度來表征,這是因為當MP處于折疊狀態時,色氨酸殘基通常位于核心的疏水環境,此時表現出較高的熒光強度,而多酚與MP結合之后,MP結構展開,色氨酸殘基暴露于親水環境中,導致熒光強度降低[96]。
Cheng Jingrong等[97]利用桑樹多酚來修飾MP并觀察MP構象的變化,結果發現槲皮素對MP二級結構影響不大,而咖啡酸使MP的α-螺旋結構轉變為β-螺旋結構,并且得到的蛋白在所有樣品中具有最強的熒光猝滅、溶解性和抗氧化活性。Zhang Yumeng等[98]的研究表明甲基-β-環糊精的加入可阻止表沒食子兒茶素沒食子酸酯引起的MP二級結構改變。李玲等[99]在研究氧化條件下茶多酚對豬肉MP理化和凝膠特性的影響時發現,茶多酚能夠很好地穩定MP的結構,推測可能是因為茶多酚與MP發生疏水相互作用,從而阻礙了溴酚藍與MP表面疏水基團的結合,導致疏水性降低。Li Xuepeng等[39]研究了不同濃度的茶多酚對于草魚MP理化性質和結構等方面的影響,結果表明,低濃度茶多酚能有效抑制羰基和二酪氨酸的形成、巰基和α-螺旋構象的消失以及羥自由基引起的MP三級結構的改變,各濃度茶多酚的存在降低了MP的表面疏水性。Pan Jinfeng等[90]研究了沒食子酸對氧化應激日本虹魚MP性質的影響,結果表明,沒食子酸抑制了羰基的生成,保護了游離胺,低濃度的沒食子酸穩定了巰基和二級結構,而高濃度時則會使巰基損失較大,α-螺旋結構含量減少。這說明多酚對于MP結構的影響還會受到前者濃度的影響。
3.3.1 多酚-肌原纖維蛋白相互作用對蛋白質功能特性的影響
多酚與MP之間的相互作用不僅會對MP結構造成影響,還會改變MP的功能特性(表4)。MP的功能特性主要包括蛋白溶解性、表面疏水性、凝膠性和乳化性[17]。MP的表面疏水性通常與其溶解度呈負相關,蛋白表面疏水性反映了疏水氨基酸殘基在蛋白表面的分布情況,當表面疏水性上升時,表明蛋白結構展開,更多的疏水性氨基酸暴露于蛋白表面,導致其溶解度下降;因此,MP溶解度的變化也可從側面反映表面疏水性的變化[16]。蛋白質的乳化能力指的是蛋白質溶液乳化脂肪的能力,反映其與脂肪的結合程度[100]。同時,有研究表明,較高的表面疏水性往往會導致界面張力的降低和乳化活性的增加[101]。另外,氧化的酚類化合物會阻止凝膠在油-水界面展開,從而有效地在油滴周圍形成一層膜,提高了凝膠的乳化穩定性[102]。
然而,上述這些影響并不是絕對的,有些研究表明多酚的加入對于MP的影響表現出復雜性,這些影響不僅與多酚結構和濃度有關,還與pH值、溫度和離子強度等環境條件有關,因此,在分析多酚對于MP的修飾效果時,應當結合各種條件,運用多種分析方法綜合分析判斷。

表4 多酚-肌原纖維蛋白相互作用對蛋白質功能性質的影響Table 4 Effects of interaction with polyphenols on functional properties of myofibrillar proteins
3.3.2 多酚-肌原纖維蛋白相互作用對蛋白質消化率的影響
大量研究表明,消化道中的多酚類物質對蛋白質的消化率有著不同程度的影響,一方面,通過與蛋白質結合,多酚可能潛在地影響某些氨基酸的可用性,也可能改變蛋白結構,從而影響蛋白質消化率和營養價值[108];另一方面,食品體系中的多酚與蛋白質的相互作用會影響復合物的溶解性,從而對蛋白質的生物利用度造成影響[109]。體外研究表明,多酚可以與消化酶相互作用,改變其活性位點的化學環境從而抑制酶活力[110]。另外還有研究發現,茶多酚添加量在0.12%以下時對消化酶活力影響不大,而當添加量進一步增加時,胃蛋白酶活力驟減[111],因此多酚與消化酶的相互作用還受到多酚濃度的影響。總的來說,多酚與蛋白質的共價作用會抑制消化酶活力以及形成不可消化的蛋白質,從而降低蛋白質的營養價值。
關于多酚對于MP消化率影響的研究主要集中在兩個方面,即多酚-蛋白相互作用對生蛋白消化率的影響以及對蛋白凝膠消化率的影響[16]。Xu Mingfeng等[42]研究了表兒茶素處理對豬MP消化率的影響,結果表明胃消化30、60 min和腸消化90 min時的蛋白質消化率均有差異,但在腸消化120 min和180 min時卻未觀察到明顯變化。說明表兒茶素與MP相互作用只會影響消化過程中的蛋白消化率,而消化過程結束之后的消化率沒有顯著變化。Cao Yungang等[103]研究發現,經胃蛋白酶-胰酶消化后,所有熱誘導MP凝膠的消化率均在94%以上,說明MP凝膠易于消化。盡管在沒食子酸結合的MP凝膠中形成了更多的二硫鍵和其他共價鍵,但總體而言,沒食子酸處理對MP凝膠消化沒有表現出明顯的抑制或者促進作用。一般來說,消化率顯著降低與酶靶向氨基酸殘基的廣泛聚集或者實質性破壞有關,而在此研究中并沒有發現這些現象。Chen Jinyu等[91]研究表明,10 μmol/g表沒食子兒茶素的添加對MP消化率無顯著影響,而提高了其消化速度。但當含量為100 μmol/g時,消化率和消化速度均顯著降低,這可能是因為低含量的酚類化合物可以提高蛋白質的表面疏水性,從而暴露了胃蛋白酶的可用切割位點,而高含量時會引起MP過度聚集,屏蔽之前的展開效應,導致蛋白水解敏感性降低。在MP與多酚的相互作用中,賴氨酸與精氨酸具有最高的加成量和反應效率,并且這些氨基酸殘基更容易與多酚中的醌基發生共價反應,這解釋了多酚對于MP體外消化的巨大影響。
MP在加工貯藏過程中極易發生過度氧化導致肉制品品質下降。有研究表明MP氧化與脂質氧化類似,也是一個ROS誘導下的自由基鏈式反應過程。多酚因具有清除自由基等能力而可以有效地抑制氧化反應的進行,此抑制作用受到多酚結構、種類、pH值以及離子強度等條件的影響。多酚與MP主要通過兩種方式進行相互作用,即疏水相互作用、靜電相互作用、范德華力和氫鍵等非共價相互作用以及“巰基-醌”和“氨基-醌”加成反應等共價相互作用。多酚-MP相互作用會對MP的二、三級結構以及MP的溶解度、表面疏水性、凝膠特性和乳化性等功能特性和消化性等營養特性產生顯著影響。
就目前而言,對于多酚-MP相互作用的研究已經較為深入,但在一些領域仍然存在不足,需要繼續深入探索。首先,雖然研究表明這兩者相互作用會產生影響,但由于多酚種類、蛋白結構的不同,以及離子強度、pH值和溫度等環境條件的差異,也因為研究者們各自研究目的與手段的不同,這些影響往往紛繁復雜,很難統一整理,甚至有時還會互相矛盾。其次,多酚對于MP消化率影響的研究雖然也有,但總的來說還不夠深入。目前研究較多的是蛋白質作為載體通過與多酚相互作用阻止多酚在消化過程中抗氧化活性下降,而此過程中蛋白質消化率的變化卻少有研究。此外,多酚與MP相互作用對于MP消化性的影響機制尚不明確,很多研究結果互相矛盾,這可能是由多酚結構與其他反應條件的不同導致的;因此,關于多酚與MP相互作用對于MP消化性的影響的理論體系還有待完善。最后,關于多酚和蛋白對于腸道菌群的影響方面的研究也較為廣泛,但是研究這兩者相互作用的復合物對腸道菌群影響的文章卻少見報道。復合物是否會影響腸道菌群,會如何影響腸道菌群,還需深入研究。
除以上這些問題,通過添加多酚來增強MP膜的各項性能,以及對于多糖-多酚-MP三元復合物的研究也將是未來的研究方向。另外,雖然說將多酚作為天然抗氧化劑用于肉品保藏的研究已較為廣泛,但就目前研究成果來看,對于多酚在較高劑量下的生物毒性研究還需深入,而且自然界還有很大一部分多酚類物質沒有被開發利用,繼續開發新的具有抗氧化能力的多酚類化合物也是熱門的研究方向。