以分子工具為鑰，解腸道菌群之密

李文博

腸道菌群是近年來(lái)微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、基因組學(xué)等領(lǐng)域引人關(guān)注的研究焦點(diǎn)。

人自出生后，外界的微生物就會(huì)逐漸進(jìn)入人體。在正常情況下，人體和共生菌群之間，以及共生菌群各細(xì)菌之間，會(huì)保持一定的生態(tài)平衡，如果平衡失調(diào)，就有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。其中，人體腸道內(nèi)有數(shù)萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌與人類(lèi)共生，它們廣泛參與和影響人體的代謝活動(dòng)、抵御感染和自體免疫疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，還能控制人體對(duì)一些癌癥治療藥物的反應(yīng)。但因?yàn)榛诿撗鹾颂呛怂幔―NA）測(cè)序、細(xì)菌分離培養(yǎng)、基因工程等方法的傳統(tǒng)研究思路在菌群復(fù)雜功能的深入研究中存在一些技術(shù)瓶頸，關(guān)于腸道菌群仍有諸多懸而未解的難題。

針對(duì)這一系列問(wèn)題，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院副研究員王煒認(rèn)為：化學(xué)的研究工具和思路有巨大的應(yīng)用空間和科學(xué)價(jià)值。他自博士階段即致力于針對(duì)與人類(lèi)健康密切相關(guān)的復(fù)雜細(xì)菌體系開(kāi)發(fā)新的化學(xué)研究工具與方法，竭盡全力，除人類(lèi)之病痛，助健康之完美。

心懷向往?堅(jiān)持不懈

王煒的母親是一位藥劑師，由于父母工作的原因，他自幼便生活在基層醫(yī)院的大院環(huán)境中。在王煒的感受中，醫(yī)院是溫情的。這里承載著他美好的童年，給予了他最初對(duì)醫(yī)生這一職業(yè)的美好向往。

2003年，非典暴發(fā)，彼時(shí)是王煒進(jìn)入山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)學(xué)習(xí)的第二個(gè)年頭。這是他親身經(jīng)歷過(guò)的第一件關(guān)乎全人類(lèi)生命健康安全的大事件，醫(yī)護(hù)人員在此時(shí)發(fā)揮的作用、作出的巨大貢獻(xiàn)、展現(xiàn)出的希波克拉底精神，使王煒產(chǎn)生了一種朦朧但強(qiáng)烈的責(zé)任感和使命感，自此加倍努力，精益求精。

“救死扶傷”是王煒給自己定下的終身目標(biāo)，但他卻并未在畢業(yè)后順勢(shì)成為一名臨床醫(yī)生，反而輾轉(zhuǎn)萬(wàn)里到美國(guó)密蘇里大學(xué)，拜入生物化學(xué)系托馬斯·馬維尼（Thomas?Mawhinney）教授的門(mén)下。他是這樣回答面試問(wèn)題的：“我希望能學(xué)一門(mén)新的知識(shí)，結(jié)合我的醫(yī)學(xué)教育背景，將來(lái)可以做些不一樣的，并且能真真切切幫助到廣大病人的研究?！笔聦?shí)上，當(dāng)時(shí)馬維尼教授已年逾70，早已數(shù)年不再招收新的學(xué)生，卻還是為了這樣一名心系人類(lèi)健康的淳樸學(xué)子而破例，招錄了王煒。

在美國(guó)密蘇里大學(xué)生物化學(xué)系學(xué)習(xí)和研究的6年，王煒打下了堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)，豐富了與臨床醫(yī)生的合作經(jīng)驗(yàn)，加深了對(duì)臨床病癥的認(rèn)識(shí)和對(duì)醫(yī)學(xué)事業(yè)的熱愛(ài)與執(zhí)著，這在很大程度上要?dú)w功于他的導(dǎo)師。跟隨導(dǎo)師進(jìn)行科學(xué)研究的日子里，王煒開(kāi)始致力于針對(duì)細(xì)菌生物膜研究開(kāi)發(fā)新的化學(xué)探針，幾乎沒(méi)有化學(xué)和微生物研究背景的他經(jīng)過(guò)幾年努力，逐漸取得了長(zhǎng)足進(jìn)步：“在實(shí)驗(yàn)室鍛煉幾年以后，我開(kāi)始敢于嘗試分子工具設(shè)計(jì)，獨(dú)立進(jìn)行探針?lè)肿雍铣闪??！卑凑胀鯚樧约旱脑拋?lái)說(shuō)，這種“不怕犯錯(cuò)，不懼失敗，敢闖敢拼”的精神是他在博士時(shí)期最重要的收獲之一。

在這一時(shí)期，王煒跟隨導(dǎo)師的步調(diào)，將囊性纖維化（cystic?fibrosis）導(dǎo)致的肺部長(zhǎng)期感染作為主要研究對(duì)象。這是一種涉及細(xì)菌感染的高致死率疾病，也是高加索人種之中最常見(jiàn)的遺傳性疾病之一。王煒也曾好奇過(guò)：導(dǎo)師為什么選擇這樣一種疾病作為研究對(duì)象呢？他是從旁人的只言片語(yǔ)中，逐漸拼湊出了導(dǎo)師研究經(jīng)歷：一位法醫(yī)病理學(xué)出身的年輕醫(yī)者，因?yàn)榻馄恃芯苛舜罅克烙谀倚岳w維化的兒童尸體而立志探究其致病原理，尋找醫(yī)治方法;自學(xué)合成化學(xué)，一手組建微生物和化學(xué)的交叉學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，在黑暗中摸索著前行，從青絲滿頭到鬢邊斑白……

與導(dǎo)師一同在實(shí)驗(yàn)室和臨床忙碌時(shí)，王煒也能從導(dǎo)師與病人接觸的點(diǎn)點(diǎn)滴滴中深刻感受到導(dǎo)師對(duì)病人的關(guān)切：“每周的教學(xué)工作要花去四十幾個(gè)小時(shí)，他就在額外的時(shí)間里來(lái)做基礎(chǔ)研究，不止對(duì)患者進(jìn)行精心治療，對(duì)患者家屬也照顧得十分周到?！边@位老者總是在盡最大可能減少患者和患者家屬的痛苦，他的堅(jiān)持、信念自然也對(duì)王煒產(chǎn)生了深刻的影響。每當(dāng)心有迷茫，王煒總會(huì)想起非典時(shí)期自己沸騰的熱血和那難以言說(shuō)的感動(dòng)，也會(huì)想起導(dǎo)師的諄諄教誨和偉大的醫(yī)者情懷。這些回憶即便不能幫助他攻關(guān)克難，但總能激起他一往無(wú)前的勇氣與決心。

目標(biāo)明確?奮力前行

自從在本科階段真正樹(shù)立了從醫(yī)理想后，王煒幾乎所有關(guān)于科研的重要選擇都帶有明確的目的：前往美國(guó)密蘇里大學(xué)是為了尋找更適合他的發(fā)展道路，完成“即使不在臨床也能救人”的心愿;前往北京大學(xué)是為了學(xué)習(xí)更多的分子探針技術(shù)以用于微生物學(xué)的研究;前往上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院是為了繼續(xù)基礎(chǔ)研究的同時(shí)能夠和臨床醫(yī)學(xué)問(wèn)題密切結(jié)合。

事實(shí)上，博士畢業(yè)回國(guó)并加入北京大學(xué)陳興教授課題組進(jìn)行化學(xué)生物學(xué)的博士后研究后，即便得到了來(lái)自陳興教授與團(tuán)隊(duì)的大力指導(dǎo)與幫助，王煒也會(huì)時(shí)常感到困惑。這是因?yàn)楫?dāng)時(shí)陳興教授課題組以真核細(xì)胞為主要研究對(duì)象，而王煒則正因囊性纖維化是白種人特有疾病而面臨方向轉(zhuǎn)變之困。經(jīng)歷了一段艱難的學(xué)習(xí)與摸索之后，他才最終探索出化學(xué)探針與腸道菌群相結(jié)合的研究方向。

2017年，王煒面臨博士后出站問(wèn)題，但此時(shí)此刻他已完全沉浸在新的研究方向之中，渴望進(jìn)行更進(jìn)一步的探索，因此主動(dòng)請(qǐng)求延遲一年出站。一年過(guò)去，王煒手頭的研究還未完成，但恰好此時(shí)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究院正在籌備成立，研究院的楊朝勇副院長(zhǎng)向王煒遞去了橄欖枝?！斑@應(yīng)該是國(guó)內(nèi)首個(gè)把化學(xué)科研機(jī)構(gòu)直接設(shè)置在醫(yī)院的研究所。這一方面是我感興趣的科研方向，一方面又圓了我少年時(shí)的醫(yī)生夢(mèng)想?！钡靡嬗谇捌诘某恋砼c楊朝勇教授和團(tuán)隊(duì)的大力支持，加入上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究院后，王煒迎來(lái)了科研成果的井噴期。

通過(guò)發(fā)展活體實(shí)時(shí)以及原位三維成像，解決了腸道菌群難以在體觀測(cè)的問(wèn)題;通過(guò)活體中的熒光D型氨基酸（fluorescent?D-amino?acid，F(xiàn)DAA）探針標(biāo)記加熒光原位雜交（FISH）聯(lián)用策略，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌腸道內(nèi)生長(zhǎng)分裂方式的成像觀察和生長(zhǎng)活性的直接定量……在面向腸道菌群進(jìn)行研究的過(guò)程中，王煒深刻體會(huì)到分子工具與化學(xué)研究策略在這一極為復(fù)雜的微生物體系中的應(yīng)用價(jià)值與潛力，因?yàn)橛辛恕拔淦鳌焙筒呗圆庞小皯?zhàn)斗”的資本。

刻苦鉆研?孜孜不倦

“菌群在宿主腸道中的微觀分布可直接影響其生理病理功能”這一認(rèn)識(shí)在近年來(lái)逐漸為人們所了解和認(rèn)可，但菌群在腸道黏膜表面的三維分布是怎樣的？菌群不同的分布會(huì)導(dǎo)致哪些對(duì)應(yīng)的結(jié)果？影響菌群分布的因素有哪些……一系列問(wèn)題仍舊是未解之謎。要想解開(kāi)這些謎題，科研人員必須先掃除來(lái)自觀察方面的重重障礙：到目前為止，由于腸道菌群生活環(huán)境較為特殊，且在這一構(gòu)成高度復(fù)雜的微生物體系（300～500種細(xì)菌）中，包含著數(shù)目驚人的各類(lèi)基因（500萬(wàn)～1000萬(wàn)）和極為繁復(fù)的生物、化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，大部分腸道細(xì)菌仍不能在體外單獨(dú)培養(yǎng)，這導(dǎo)致科研人員無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行研究;嚴(yán)重缺乏菌群成像的工具和手段，導(dǎo)致對(duì)腸道菌群的研究難以做到“眼見(jiàn)為實(shí)”;分析菌群組成的動(dòng)態(tài)變化時(shí)僅可依靠脫氧核糖核酸測(cè)序等間接手段，缺少可對(duì)細(xì)菌在腸道內(nèi)的生長(zhǎng)活性進(jìn)行直接判定的方法……

針對(duì)移植到小鼠體內(nèi)的外源菌群無(wú)法活體實(shí)時(shí)成像追蹤這一痛點(diǎn)，王煒與合作者利用D型炔丙基甘氨酸（D-propargylglycine）探針灌胃對(duì)小鼠菌群進(jìn)行原位代謝標(biāo)記，進(jìn)而可通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將篩選后的近紅外Ⅱ區(qū)（NIR-Ⅱ）小分子熒光染料共價(jià)偶聯(lián)到細(xì)菌表面。這一方法回避了腸道細(xì)菌的體外培養(yǎng)，得到的帶有近紅外Ⅱ區(qū)熒光的菌群在保證活性的同時(shí)仍可保持完整的組成結(jié)構(gòu)。以此作為供體菌群移植給受體小鼠后，通過(guò)銦鎵砷電荷耦合元件（CCD）探測(cè)器即可實(shí)現(xiàn)活體、無(wú)創(chuàng)的菌群實(shí)時(shí)成像追蹤。

針對(duì)固有菌群與宿主腸道微結(jié)構(gòu)的相對(duì)空間關(guān)系無(wú)法進(jìn)行三維成像研究這一瓶頸，王煒與合作者開(kāi)發(fā)了經(jīng)腹腔注射熒光D型氨基酸的腸道菌群在體標(biāo)記新方法。探針在經(jīng)膽汁分泌進(jìn)入腸道進(jìn)而高效標(biāo)記菌群的同時(shí)，也可使宿主組織的熒光吸附背景大為減弱。通過(guò)結(jié)合組織透明化（tissue?clearing）策略，他們首次實(shí)現(xiàn)了腸道固有菌群的原位、三維、單細(xì)菌分辨率熒光成像，能夠?yàn)檫M(jìn)一步理解腸道菌群的生理功能以及宿主和菌群在不同條件下的相互作用提供獨(dú)特的研究工具和視角。

針對(duì)腸道菌群中大部分細(xì)菌仍無(wú)法進(jìn)行體外單獨(dú)培養(yǎng)、難以進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究的問(wèn)題，王煒先是實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大部分腸道細(xì)菌的雙色序貫熒光標(biāo)記，繼而通過(guò)對(duì)這一菌群中不同種屬細(xì)菌分別進(jìn)行熒光原位雜交染色以實(shí)現(xiàn)對(duì)所感興趣種類(lèi)細(xì)菌進(jìn)行直接的成像觀察。這一研究策略巧妙地避免了細(xì)菌體外培養(yǎng)，利用細(xì)菌在腸道內(nèi)原位的生長(zhǎng)過(guò)程使其帶上具有時(shí)序信息的雙色標(biāo)記，配合熒光原位雜交染色所提供的物種信息，可以高效、方便、準(zhǔn)確地獲得各類(lèi)腸道細(xì)菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)分裂模式信息。利用這一方法，他和團(tuán)隊(duì)成功地對(duì)70多個(gè)種、屬細(xì)菌的生長(zhǎng)分裂情況進(jìn)行了高分辨熒光成像分析，其中包括了多個(gè)從未在體外進(jìn)行過(guò)單獨(dú)培養(yǎng)和研究的物種，由此得以窺見(jiàn)這些神秘細(xì)菌的“廬山真面目”。同時(shí)，也針對(duì)與宿主免疫系統(tǒng)有密切相互作用的分節(jié)絲狀菌（segmented?filamentous?bacteria，SFB）在宿主腸道內(nèi)的不同生長(zhǎng)分化階段進(jìn)行了細(xì)致的成像分析。作為首個(gè)可對(duì)腸道中的這部分“暗物質(zhì)”進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究的方法，這一研究策略將會(huì)為直觀觀察并深入理解各類(lèi)腸道細(xì)菌在宿主體內(nèi)的微生物活動(dòng)提供全新的研究角度。

在目前的菌群研究中，往往是通過(guò)脫氧核糖核酸測(cè)序得出的不同時(shí)間點(diǎn)各類(lèi)細(xì)菌相對(duì)豐度的變化，來(lái)推測(cè)相應(yīng)細(xì)菌的體內(nèi)活性變化，這導(dǎo)致了無(wú)法直觀、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝活性進(jìn)行定量的問(wèn)題。王煒先是推測(cè)并通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)證明了熒光D型氨基酸對(duì)體內(nèi)細(xì)菌的標(biāo)記強(qiáng)度與細(xì)菌生長(zhǎng)代謝速度具有很高的正相關(guān)性，其后結(jié)合熒光原位雜交所得到的細(xì)菌種屬信息，成功地通過(guò)流式細(xì)胞分析定量測(cè)得不同細(xì)菌在腸道內(nèi)的生長(zhǎng)代謝水平。據(jù)此，他開(kāi)發(fā)了首個(gè)能夠直觀、準(zhǔn)確地對(duì)各類(lèi)細(xì)菌在腸道中的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)進(jìn)行定量研究的化學(xué)生物學(xué)方法，為真正揭示菌群在體內(nèi)受各種內(nèi)外源因素影響時(shí)的動(dòng)態(tài)變化情況提供了有力的技術(shù)支撐。受這一細(xì)菌活性定量方法的啟發(fā)，最近王煒又和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的臨床醫(yī)生合作，將這一新方法應(yīng)用到病原菌的快速抗生素藥敏檢測(cè)之中。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析肺泡灌洗液等臨床樣品中的病原菌在受不同抗生素影響時(shí)的代謝活性變化趨勢(shì)，可以快速、準(zhǔn)確地給出藥物敏感性信息。這一新方法在國(guó)際上首次解決了臨床獲得性肺炎病人診斷用藥耗時(shí)長(zhǎng)而導(dǎo)致病死率高這一難題。

隨著研究的不斷推進(jìn)，王煒?biāo)l(fā)展的這一獨(dú)立于傳統(tǒng)測(cè)序手段的菌群研究新方法，也越來(lái)越為國(guó)內(nèi)國(guó)際領(lǐng)域同行所關(guān)注和認(rèn)可。2022年，王煒關(guān)于腸道菌群化學(xué)生物學(xué)的研究正式獲批立項(xiàng)，他將在為期3年的研究時(shí)間里著重開(kāi)發(fā)選擇性菌群在體標(biāo)記探針，發(fā)展基于各類(lèi)化學(xué)工具的菌群研究新平臺(tái)與成像新方法，并通過(guò)這些新工具對(duì)不同內(nèi)外源因素如何影響各類(lèi)腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)、菌群移位到腸外器官的過(guò)程和活性的變化情況等重要科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研究。他期待著開(kāi)拓化學(xué)工具在腸道菌群研究中的進(jìn)一步應(yīng)用，為深入理解這一重要微生物體系提供新的化學(xué)生物學(xué)解決方案。

走過(guò)十幾年科研探索的風(fēng)雨之路，歷經(jīng)無(wú)數(shù)次研究失敗與成功之后，王煒依舊牢記并踐行著曾經(jīng)的莊重誓言——獻(xiàn)身醫(yī)學(xué)，刻苦鉆研，孜孜不倦。

（責(zé)編：袁園）