MPP+對N2a細胞中CDR1as基因表達的影響

張小琴　王友翠　謝俊霞

[摘要]目的 探討1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP⁺）對N2a細胞中環狀RNA小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（CDR1as）基因表達的影響。方法 常規培養N2a神經母細胞瘤細胞，給予100 μmol/L的MPP⁺分別處理3、6、9和12 h。采用實時熒光定量PCR檢測 CDR1as基因的表達。結果 與用基礎培養液處理的對照組相比，經MPP⁺處理3、6、9和12 h的N2a細胞CDR1as基因表達明顯降低（F=10.010，q=7.003～8.609，P<0.05）。結論 MPP⁺能誘導N2a細胞中 CDR1as基因的表達顯著降低，提示 CDR1as基因可能參與帕金森病的發病。

[關鍵詞]RNA，環狀;CDR1as;1-甲基-4-苯基吡啶;N2a細胞;帕金森病

[中圖分類號]R338.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0333-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.121

EFFECT OF 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM ON EXPRESSION OF THE CEREBELLAR DEGENERATION-RELATED PROTEIN 1 ANTISENSE TRANSCRIPT GENE IN N2A CELLS

ZHANG Xiaoqin， WANG Youcui， XIE Junxia

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP⁺） on the expression of the cerebellar degeneration-related protein 1 antisense transcript （CDR1as） gene in N2a cells.Methods Neuroblastoma N2a cells were cultured with conventional methods and then treated with 100 μmol/L MPP⁺for 3， 6， 9， and 12 h. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of CDR1as.Results Compared with the control group treated with the basal medium， the N2a cells treated with MPP⁺for 3， 6， 9， and 12 h had a significant reduction in the mRNA expression of CDR1as （F=10.010，q=7.003-8.609，P<0.05）.Conclusion MPP⁺induces a significant reduction in the expression of the CDR1as gene in N2a cells， suggesting that the CDR1as gene may be involved in the pathogenesis of Parkinsons disease.

[KEY WORDS] RNA， circular; CDR1as; 1-methyl-4-phenylpyridinium; N2a cells; Parkinson disease

帕金森病（PD）是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經退行性疾病[1-9]。PD主要的病理特征是中腦黑質多巴胺（DA）能神經元大量變性丟失，導致紋狀體內DA含量減少，而變性丟失的 DA能神經元內均出現α-突觸核蛋白積聚[10-13]。環狀RNA是一類不具有5′末端帽子和3′末端 poly（A）尾巴、以共價鍵形成環形結構的RNA分子。由于呈閉合環狀結構，對核酸外切酶不敏感，因此環狀RNA比線性RNA更為穩定，且具有物種保守性、組織時序性及疾病表達特異性[14-20]。有文獻報道，環狀RNA小腦變性相關蛋白1反義轉錄物（CDR1as）可作為miR-7海綿調控miR-7靶基因的表達[21-22]。已有研究表明，α-突觸核蛋白基因的拷貝增加或點突變均可導致α-突觸核蛋白積聚，從而引發PD[23-24]。而miR-7可以與α-突觸核蛋白基因編碼 mRNA的3′UTR 區相互作用，從而抑制其翻譯[25-26]。這提示作為miR-7海綿的CDR1as基因可能參與了DA能神經元的變性丟失。因此，闡明CDR1as基因在PD中發揮的作用至關重要。本研究旨在探討經1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP⁺）處理的PD細胞模型中CDR1as基因的表達變化。

1材料與方法

1.1主要試劑及其來源

MPP⁺（M0896）由美國Sigma公司提供，用雙蒸水稀釋至10 mmol/L，分裝，-20 ℃避光保存;DMEM高糖基礎培養液（01-052-1ACS）購自BI公司;TRIzol購自ambion公司;PCR逆轉錄試劑盒（AG11711）和SYBR Green（AG11702）購自艾科瑞生物公司;胎牛血清（澳洲源，FND500）購自依科賽公司;青霉素和鏈霉素混合雙抗液（F1400）購自索萊寶公司。

1.2細胞培養

小鼠神經母細胞瘤N2a細胞培養于含體積分數0.05胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合雙抗的DMEM高糖培養液中，在37 ℃、體積分數0.05 CO₂條件下培養。

1.3四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞活力

將N2a細胞接種于96孔板中，每孔細胞懸液200 μL（細胞數為8×104個），培養24 h后，棄上清，對照組直接加入新鮮基礎培養液，MPP⁺組加入終濃度為100 μmol/L的MPP⁺，分別處理3、6、9和12 h。細胞處理結束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養4 h后取出培養板，棄上清，每孔加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min。用酶標儀檢測波長570 nm處的吸光度（A）值，計算細胞存活率。

1.4實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測CDR1as基因表達

將傳代N2a細胞接種于12孔板，分為對照組（A組）和100 μmol/L MPP⁺處理3、6、9、12 h組（B、C、D、E組）。采用TRIzol法冰上裂解各組細胞5 min。按照PCR逆轉錄試劑說明書操作，提取細胞總RNA。取1 μg的總RNA，加入1 μL gDNA Clean Reagent、2 μL 5×gDNA Clean Buffer，用RNA free water補至10 μL，42 ℃變性2 min;隨后向上述反應體系中加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×RTase Reaction Buffer Mix Ⅰ 4 μL、RNA free water 4 μL，37 ℃作用15 min，繼以85 ℃、5 s逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法相對定量測定CDR1as基因的表達。RT-PCR 檢測所用引物及其序列見表1。應用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。

1.5統計學處理

應用Graph Pad Prism 6軟件進行統計學處理。實驗所得計量資料結果以x±s形式表示，兩組均數比較采用t檢驗;多組均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA檢驗），繼以Tukey法進行進一步組間兩兩比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1MPP⁺作用不同時間對N2a細胞存活率影響

與對照組相比較，經100 μmol/L MPP⁺作用3、6、9和12 h的N2a細胞存活率均有明顯下降，差異具有統計學意義（t=2.283～11.430，P<0.05）。見表2。

2.2MPP⁺作用不同時間后N2a細胞中CDR1as基因的表達變化

RT-PCR檢測結果顯示，A、B、C、D、E組N2a細胞中CDR1as基因的表達水平分別為1.070±0.338、0.207±0.034、0.290±0.039、0.354±0.121和0.368±0.137（n=6）。與對照組比，經100 μmol/L MPP⁺作用3、6、9和12 h的N2a細胞CDR1as基因表達水平明顯降低，差異均具有顯著意義（F=10.010，q=7.003～8.609，P<0.05）。

3討論

PD是世界上第二大常見的神經退行性疾病，隨著人口老齡化加劇，發病人數逐年增加[1-9]。PD主要病理學特征是黑質區DA能神經元進行性丟失，紋狀體DA含量降低。臨床上主要表現為肌僵直、靜止性震顫、姿勢不穩、運動遲緩，影響了病人的生活質量[27]。左旋多巴是治療PD的常用藥物，但大多數病人長期服用左旋多巴后出現不自主運動、認知障礙、癡呆等副作用[28]。因此，尋找新的治療靶點具有重要的意義。近期研究發現，CDR1as參與PD的發病進程，但其確切的機制尚未闡明。

研究表明，CDR1as基因在人和小鼠腦組織中可有效地環化，而檢測不到線性CDR1as[29]。人源CDR1as基因序列含有74個miR-7結合位點，小鼠CDR1as基因序列含有130個miR-7結合位點，且在不同物種間高度保守[21-22，29]。CDR1as與miR-7共同高表達于腦組織神經元的胞體和突起，在小腦、中腦、海馬、嗅球神經元中均能檢測到CDR1as基因的表達[29-30]。研究發現，CDR1as基因在興奮性

神經元中表達水平較高，CDR1as基因敲除小鼠表現出興奮性突觸誘發電位功能障礙[29]。在斑馬魚胚胎中過表達人源CDR1as會導致中腦體積縮小，其表型與miR-7缺失相似，且通過補充miR-7前體可部分恢復中腦體積，提示CDR1as可能是通過與miR-7相互作用，即作為miR-7海綿吸附miR-7而發揮作用[19]。有文獻報道，在PD病人和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導的PD小鼠的中腦黑質區，miR-7的表達均顯著降低，在小鼠中腦黑質區敲低miR-7，則會導致α-突觸核蛋白積聚并伴有DA能神經元的變性丟失，同時紋狀體內DA含量顯著下降，提示miR-7可能在α-突觸核蛋白的轉錄后調節中發揮重要作用[31-32]。此外，miR-7在調節PD發病進程中的神經炎癥和DA能神經元死亡中具有重要作用[33-36]。因此，CDR1as可能通過調節miR-7-α-突觸核蛋白軸調控PD的發展。本研究應用濃度為100 μmol/L的MPP⁺處理N2a細胞構建PD細胞模型，并檢測了CDR1as在不同時間點的變化，結果顯示，N2a細胞經過MPP⁺處理3、6、9和12 h后CDR1as表達顯著降低，提示CDR1as基因可能間接參與了PD的發病。

有研究顯示，在CDR1as基因敲除小鼠大腦中，miR-7的表達減少而不是增加，這表明還有其他機制參與了miR-7表達的調節[29]。采用CLIP-Seq技術對miR-7-target RNA-Ago2嵌合體中的靶序列進行分析和排序發現，無論是在人類還是小鼠大腦中，排在第1位的都是CDR1as基因，排在第2位的是長鏈非編碼RNA Cyrano，提示Cyrano在中樞神經系統中對miR-7具有重要的調控作用[29]。Cyrano高表達于腦神經元的胞體和突起，含有1個與miR-7幾乎完全配對（除第9/10位外）的結合位點，且該位點高度保守[37]。然而，Cyrano是否通過miR-7在PD發病中發揮作用還需進一步探究。

研究表明，在人類和小鼠腦中，CDR1as基因也存在miR-671的結合位點，miR-671可以近乎完全與CDR1as基因互補配對，隨后與Ago2蛋白結合，最終實現對CDR1as基因的有效降解，且此相互作用在物種間高度保守，提示這種特異性的相互作用可能具有重要生物學功能[29，38]。本研究中，N2a細胞經過MPP⁺處理3、6、9和12 h后CDR1as基因表達顯著降低，這一現象是否與miR-671有關還需進一步研究。

綜上所述，N2a細胞經過MPP⁺處理3、6、9和12 h后CDR1as基因表達水平顯著降低，本文結果為研究CDR1as基因在PD發病中的作用提供了實驗依據。

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（本文編輯馬偉平）