響應面法優化替考拉寧發酵培養基及其擴大培養

郄麗萍?姜明星?葛鹍鵬?隨子華?趙鵬鵬?馬婕?張雪霞?吳達

摘要：目的 通過響應面法，優化替考拉寧發酵培養基，并對發酵工藝參數進行優化，來提高其發酵產量。方法 以游動放線菌TC19-3p-103為試驗菌株，采用單因素試驗確定發酵培養基考察因素的參考范圍；利用最陡爬坡試驗確定響應面試驗的中心區域；利用Box-Behnken響應面法，確定了發酵培養基中的有機氮源最佳濃度組合；并對起始攪拌轉速與通氣量這兩個發酵工藝參數進行單因素考察；在發酵過程中，采用流加技術控制碳源濃度。結果 經優化的發酵培養基，其搖瓶產量提高了31.6%；50L罐發酵工藝參數優化后，發酵水平達到8558 mg/L。 結論 優化后的發酵工藝，顯著提高了替考拉寧的產量，為其工業化生產奠定了基礎。

關鍵詞：替考拉寧；響應面法；發酵工藝；

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Response surface methodology to optimize the fermentation medium

of teicoplanin and its expanded culture

Qie Li-ping1， Jiang Ming-xing2， Ge Kun-peng1， Sui Zi-hua2， Zhao Peng-peng1， Ma Jie1， Zhang Xue-xia1， and Wu Da2

（1 National Engineering Research Center of Microbial Medicine， Hebei Industry Microbial Metabolic? ?Engineering & Technology Research Center， New Drug Research & Development Company of NCPC ， Shijiazhuang 050015;

2 Huasheng Company of NCPC， Shijiazhuang 050015）

Abstract Objective To optimize the fermentation medium of teicoplanin by response surface methodology and optimize the fermentation process parameters to increase its fermentation yield. Methods The Actinoplanes teichomyceticus TC19-3p-103 was used as the test strain. The single factor test was used to determine the reference range of the fermentation medium to investigate factors. The steepest climbing test was used to determine the central area of the response surface test. The Box-Behnken response surface method was used to determine the optimal concentration combination of organic nitrogen sources in the fermentation medium. The two fermentation process parameters， the initial stirring speed and aeration rate， were investigated by a single factor. The fed-batch technology was used to control the concentration of the carbon source in the fermentation process. Results The optimized fermentation medium increased the shake flask yield by 31.6%. After the optimization of the fermentation process parameters in the 50 L tank， the fermentation level reached 8，558 mg/L. Conclusion The optimized fermentation process has significantly increased the production of teicoplanin and laid the foundation for its industrial production.

Key word Teicoplanin; Response surface analysis; Fermentation process

替考拉寧是Parenti等在游動放線菌（Actinoplanes teichomyceticus）的發酵液中發現的發酵產物，是由結構十分相近的5個主要組分（TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5），以及另外一個活性組分（TA3-1）組成，主要組分的差異僅在于?；鶄孺湹牟煌?，都是替考拉寧的有效成分，其化學結構如圖1。替考拉寧分子中的部分氨基酸以乙酸鹽和酪氨酸為生物合成前體，而5個主要組分所差異的酰基側鏈則分別以亞油酸、L-纈氨酸、油酸、異亮氨酸和亮氨酸為前體衍生而來[1-3]。

替考拉寧是繼萬古霉素、去甲基萬古霉素后發現的另一種抗耐藥菌的糖肽類抗生素[4]，替考拉寧通過與D-丙氨酰D-丙氨酸殘基特異性結合，阻斷細菌細胞壁中肽聚糖的合成，從而抑制和殺滅細菌。Boast等[5]指出，替考拉寧與萬古霉素的抗菌譜相似，但腎毒性風險比較低，其導致紅人綜合征極為罕見，這些優勢也促進了其在兒科的應用。

培養基優化是提高產量的重要手段之一。王德森等[6]采用單因素和正交試驗研究發酵培養基組成，探討了搖瓶發酵的主要影響因子，優化后的發酵水平較原工藝提高40%；鄒昆等[7]通過響應面CCD方法優化替考拉寧發酵培養基，產量提高23.3%。本研究是針對本實驗室誘變獲得的新高產突變菌進行培養基及發酵工藝優化，解決發酵培養基放大中存在的問題，提高發酵水平，降低生產成本，實現放大生產的目的。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株：游動放線菌（Actinoplanestei chomyceticus）TC19-3p-103 本實驗室保存

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基（g/L）

可溶性淀粉10，K2HPO4 1， MgSO4·7H2O 1， NaCl 1，（NH4）2SO4 2，CaCO3 2 ，FeSO4·7H2O 0.001，MnCl2.7H2O 0.001，瓊脂16，pH 7.2。

1.2.2 種子培養基（g/L）

淀粉20，葡萄糖5，蛋白胨10，玉米漿5，KH2PO4 0.2，CaCO3 3，pH 7.2。

1.2.3 發酵培養基（g/L）

淀粉40，葡萄糖10，棉籽餅粉6，酵母粉10，玉米漿10，纈氨酸0.5，KH2PO4 0.2，CaCO3 3，pH 6.5。

1.3 培養方法

1.3.1 斜面培養

取0.1 mL經過快速解凍的甘油管保藏的孢子懸液于中管斜面上，涂布均勻，28℃培養，8～10 d。

1.3.2 種子瓶培養

從中管斜面上挖取成熟培養物接入250 mL三角瓶中，裝料量40 mL；搖床轉速220 r/min，培養2 d。

1.3.3 發酵瓶培養

從種子瓶中吸取2～3 mL培養成熟的種子液接入250 mL三角瓶中，裝料量40 mL，搖床轉速220 r/min，培養7～8 d。

1.3.4 50 L罐發酵培養

50 L發酵罐（上海國強生化工程裝備有限公司）。采用二級發酵，中管斜面菌種挖塊半支，接種于種子培養基中（150 mL/1000 mL三角瓶），28℃，220 r/min振蕩培養48 h。發酵罐裝料量為30 L，接種量為5%，培養溫度28℃，培養周期8 d。

1.4 分析方法

1.4.1 產物檢測采用HPLC分析方法

取5 mL發酵液，加入等體積的無水乙醇搖勻浸泡1 h，3000 r/min離心10 min，取上清，純化水稀釋至適當濃度，進行HPLC分析。

色譜條件：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱;流動相A為0.02 mol/L乙酸銨；流動相B為純乙腈；梯度洗脫：流動相A 0～9 min 82%→68%，9～9.5 min 68%～82%，9.5～15 min 82%；檢測波長254 nm；柱溫40℃；進樣量10 μL，進樣速度1 mL/min。

1.4.2 菌濃測定

取10 mL發酵液置于離心管中，3000 r/min離心10 min，計算固形物體積占發酵液的比例。

1.4.3 殘總糖測定

殘總糖測定采用斐林試劑法。

1.4.4 氨氮測定

氨氮測定采用甲醛法。

1.5 培養條件優化方法

1.5.1 單因素試驗優化

單因子包括酵母粉、棉籽餅粉和玉米漿。采用單因素試驗，考察各因素對發酵水平的影響，以確定各因素適合替考拉寧合成的參考范圍。

1.5.2 最陡爬坡法及Box-Behnken設計法優化

在單因素的基礎上，對3種有機氮源采用最陡爬坡法進行優化；并應用基于Box-Behnken設計的響應曲面法進行試驗，以有效提高配方優化的效率。BBD法優點是應用于因素數在3～7個內的試驗；試驗次數為15～62次，在因素數相同時比中心復合設計所需的試驗次數少。

1.5.3 50 L罐發酵工藝優化方法

采用單因素法對攪拌轉速、通氣量進行考察。對碳源采用流加的方法，控制其在亞適量范圍，提高發酵產量。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 單因素考察有機氮源含量對發酵的影響

對原基礎配方中3種氮源，酵母粉、棉籽餅粉、玉米漿進行單因素搖瓶實驗，考查其對替考拉寧發酵的產量的影響。每個實驗組設置3個平行，取平均值。結果見圖2。

由圖2可知，原基礎配方中逐步增加酵母粉含量，替考拉寧發酵水平提高最顯著；3種氮源對發酵影響顯著性的順序為：酵母粉>棉籽餅粉>玉米漿。酵母粉組菌絲量達到35%；棉籽餅粉組菌絲量達到28%；玉米漿組菌絲量達到26%。搖瓶放瓶菌絲量也是酵母粉組最高。

2.1.2 最陡爬坡試驗確定各因子的濃度范圍

響應面擬合方程只有在考察的臨近區域里才能充分近似真實情況，通過爬坡試驗來實現逼近具有最大值的響應區域。根據“2.1.1”單因素考察的結果，確定酵母粉、棉籽餅粉和玉米漿3個因素取值范圍和變化步長，做最陡爬坡實驗。結果見表1。酵母粉逐漸增大，棉籽餅粉和玉米漿逐漸減少，替考拉寧的產量沿著1到3的路徑增加，第3組到達最高點7509 mg/L，然后沿著4至5的路徑下降，即較好水平在試驗3附近。因此，以第3組各因素水平為中心值作為BBD的中心點進行RSM試驗設計。

2.1.3 響應面Box-Behnken實驗設計

根據單因素和最陡爬坡試驗結果，采用響應面BBD對顯著影響產量的3個有機氮源因素（酵母粉，棉籽餅粉，玉米漿）的最佳水平及相互作用進行考察，X1、X2、X3為酵母粉、棉籽餅粉、玉米漿的編碼。表2～3為BBD實驗設計及其結果。

經Design-Expert12軟件擬合，各因素對替考拉寧產量的編碼值回歸方程如下：

替考拉寧產量=7730+345.75X1+259.25 X2+173.00X3-209.00 X1X2+78X1X3+73.50X2X3-337.75X12-502.75X22-396.75X32。回歸方程的校正系數R2為0.9539，說明方程的擬合度良好，可有效預測替考拉寧產量的最優組合。

方差分析表見表4，一次項，二次項的P值<0.05，說明該模型顯著；失擬項P值為0.0948，說明模型失擬項不顯著，殘差是隨機誤差所引起。

2.1.4 響應面交互作用分析

利用Origin2018軟件繪制響應面曲線，通過分析相關變量之間的交互作用，從而確定最優解。酵母粉、棉籽餅粉、玉米漿的三維響應面及對應等高線如圖3所示。X1X2、X1X3和X2X3的交互作用的響應面都是開口向下的凸面，說明試驗濃度范圍內響應值存在最優解。交叉項X1X2等高線呈橢圓形，則說明它們的交互作用對響應值影響顯著[8]。交叉項X2X3，X1X3等高線接近圓形，說明其交互作用不明顯，這與表4中P>0.05結果一致。

2.1.5 驗證試驗

通過進一步搖瓶實驗對軟件預測最優解進行驗證。根據模擬方程，軟件預測給出的最優解為7844 mg/L。各因素的取值分別為：酵母粉22.833 g/L、棉籽餅粉10.257 g/L、玉米漿10.601 g/L，發酵其他條件不變，共進行3批搖瓶試驗。試驗結果分別為7792、7880和7613 mg/L，均值為7761 mg/L。誤差在1.0%，說明模型可靠，證明用單因素、最陡爬坡、響應面法優化替考拉寧的培養基方法可行。對比優化前后的發酵水平，提高幅度為31.6%。

2.2 發酵罐工藝優化

2.2.1 攪拌轉速、通氣量對發酵工藝的影響

采用單因素對起始攪拌轉速、通氣量進行實驗考查。本實驗分別設置100、150、200和300 r/min作為初始轉速，發酵中后期采用控制溶氧達到30%～60%，控制轉速；分別設置30、33、36和39 L/min通氣量進行單因素試驗。實驗結果見圖4～5。

從圖4可以看出，發酵起始攪拌轉速對替考拉寧發酵產量影響顯著，隨著起始攪拌轉速的降低，發酵單位顯著提高。在初始轉速300 r/min時90 h罐上起沫嚴重。鏡檢菌絲狀態發現，在高轉速情況下發酵罐里菌絲狀態是分散的菌絲，與搖瓶里的結微球狀態不同。在100和150 r/min時菌絲生長為微球，與搖瓶狀態一致。本實驗表明替考拉寧產生菌在生長初期對攪拌的剪切力敏感，低攪拌轉速可以減少剪切力對菌絲生長的影響，菌絲可以生長為微球狀態。發酵中期因溶氧的需求提高攪拌轉速，菌絲球受剪切力的影響變小，仍能保持自身狀態。

由圖5可以看出通氣量對替考拉寧發酵產量同樣影響顯著，通氣量30 L/min時效果最差，通氣量36 L/min時，替考拉寧產量達到最高7284 mg/L，可作為優選條件。通氣量也是改善發酵罐內溶氧的有效手段，其對菌絲狀態影響小。攪拌和通氣兩者相輔相成為發酵過程提供一個適宜的溶氧環境。

2.2.2 碳源流加對發酵產量的影響

對發酵組分中的碳源采取流加技術，當還原糖的濃度低于12 g/L時，間歇性補入30%葡萄糖，控制還原糖的濃度在5～10 g/L。由圖6可以看出，隨著菌體生長到對數期后期，替考拉寧開始產生。菌絲生長進入平臺初期，溶氧到達底部，替考拉寧已經開始大量合成。流加碳源，維持菌體生長的平臺期，也就是維持替考拉寧的高效合成期，達到高產的目的。50 L發酵罐182 h放罐時替考拉寧產量達到8558 mg/L，進一步提高了17.5%。

發酵過程營養成分的濃度，對發酵進入次級代謝有顯著地影響。營養成分濃度過高不僅對菌體的生長有一定抑制作用[9]，還會延遲發酵進入次級代謝的進程。采用流加技術控制營養成分在亞適量范圍，更有效地提高了后期菌體活力不足和產能下降的問題[10-14]。

3 結論

本研究基于搖瓶工藝的發酵培養基，對新菌種發酵放大進行研究。新菌種用原發酵培養基在發酵罐放大培養中表現為發酵中后期菌絲量下降、產抗能力后勁不足?？紤]可能是原培養基氮源不足造成的發酵后期營養不足，造成菌體生長受限，菌體活性降低；同時菌球裂解，菌濃降低；從而嚴重影響到產物合成能力。經用單因素、最陡爬坡、響應面法對發酵培養基進行了優化，新培養基搖瓶產量提高了31.6%。由圖6可以看出，新培養基在50 L罐上發酵中后期維持了適度的菌體濃度，分泌期延長，新菌種在生命的后期最大限度的合成和分泌次級代謝產物。

在發酵培養的不同時期，微生物對溶氧要求是不同的。往往在發酵中期，微生物處于旺盛生長時間，對氧的需要量較高；而在發酵初期和發酵后期微生物的需氧量較低。在發酵罐工藝優化中，發現替考拉寧產生菌對發酵罐剪切力敏感，降低初始攪拌轉速對菌絲初期生長階段的結球有利，同時對發酵產能有利。這與金志華[15]報道替考拉寧產生菌Actinoplanes teichomyceticus對剪切力較敏感一致通過對初始攪拌轉速及通氣量的優化，50 L罐發酵水平達到7284 mg/L。

采用流加技術控制碳源含量在亞適量范圍，更有效地提高菌體的生物量和產量，50 L發酵罐的發酵水平達到了8558 mg/L，又提高了17.5%，取得良好的效果。50 L罐工藝開發的成功為替考拉寧進一步放大生產奠定了堅實的基礎。

參 考 文 獻

Malabarba A， Strazzolini P， Depaoli A， et al. Teicoplanin， antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. Ⅵ. chemical degradation： Physicochemical and biological properties of acid hydrolysis products[J]. J Antibiot， 1984， 37（9）： 988-999.

Ackermann B L， Regg B T， Colombo L， et al. Rapid analysis of antibiotic-containing mixtures from fermentation broths by using liquid chromatography-electrospray ionizationmass spectrometry anmatrixassisted laser desorption ionization time of fligh massspectrometry[J]. J Am Soc Mass Spectr， 1996， 7： 1227-1237.

Jin Z， Wang M， Cen P. Production of teicoplanin by valin analogue-resisitant mutant strain of Actionplanes teichomyceticus[J]. Appl Microbiol Biot， 2002， 58（1）： 63-66.

吳亞銘. 新一代抗生素——替考拉寧[J]. 中國抗生素雜志， 1999， 24（增刊）： 51.

Boast A， Gwee A， Gwee A. Teicoplanin should we be doing routine therapeutic drug monitoring in children[J]. Pediatr Infect Dis J， 2017， 36（ 11）： 1110.

王德森， 張祝蘭， 唐文力， 等. 替考拉寧產生菌A .teichomycoticus FIM-37 發酵條件優化[J]. 藥物生物技術， 2017， 24（4）： 310-314.

鄒昆， 張奇， 夏永登. 響應面法優化替考拉寧發酵培養基的研究[J]. 中國抗生素雜志， 2011， 36（9）： 671-675.

Bhattacharjee K， Joshi S R. A selective medium for recovery and enumeration of endolithic bacteria[J]. J Microbiol Meth， 2016， 129： 44-54．

熊宗貴.發酵工藝原理[M]. 北京： 中國醫藥科技出版， 2003： 148-149.

徐瑤， 吳濤， 郭美錦， 等. 氮源對阿維菌素合成的影響及基于二氧化碳釋放速率的阿維菌素發酵調控[J]. 生物工程學報， 2020， 36（2）： 287-294.

陳凝， 王永紅， 儲炬， 等. 培養基成分和補料對阿維菌素發酵過程中除蟲鏈霉菌菌絲形態的影響[J]. 華中農業大學學報， 2007， 26（4）： 496-501.

李瑜， 李一萌， 楊麗， 等. 5 L發酵罐高密度培養番茄紅素工程菌及其發酵調價優化[J]. 現代食品科技， 2020， 36（6）： 137-146.

劉景陽， 劉云鵬， 徐慶陽. 谷氨酸全營養流加發酵新工藝[J]. 食品與發酵工業， 2021， 47（7）： 14-20.

吳江， 洪文榮， 蘇敏， 等. 釀酒酵母XM2-9流加發酵生產甲基硒代半胱氨酸[J]. 食品與生物技術學報， 2021， 40（7）： 103-111.

金志華. 抗生素發酵的若干微生物及工程問題研究[D]. 杭州： 浙江大學， 2001.

收稿日期：2021-06-25

基金項目：河北省科技研發平臺建設專項（No. 199676154H）

作者簡介：郄麗萍，女，生于1974年，高級工程師，從事生物制藥研究， E-mail： qieliping1993@163.com

*通訊作者，E-mail： wu-da@126.com