左氧氟沙星不同注射時間治療實驗動物鼠疫療效觀察

張琪?何建?楊曉艷?辛有全?靳娟?李勝?熊浩明?楊建國?代瑞霞

摘要：目的 觀察左氧氟沙星不同注射時間治療實驗動物鼠疫的療效。方法 參照《中國藥典》成人劑量，用施新猷動物折算系數法計算豚鼠每日所需注射劑量。實驗設立24 h治療組和48 h治療組及對照組，每組10只豚鼠。30只實驗豚鼠均于鼠鼷部皮下注射菌量為1×107 cfu/mL鼠疫菌141株，24 h治療組和48 h治療組分別于染毒后24 h和48 h開始注射左氧氟沙星進行治療，12 mg/d，

1日1次，連續治療9日再觀察9日。結果 左氧氟沙星24 h、48 h治療組治愈率分別為100%和70%，對照組動物全死亡。結論 左氧氟沙星治療實驗動物鼠疫療效顯著，可用于鼠疫臨床一線治療。

關鍵詞：鼠疫；左氧氟沙星；治療；豚鼠；療效觀察

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Effect of levofloxacin injection time on plague in experimental animals

Zhang Qi1， He Jian1， Yang Xiao-yan1， Xin You-quan1， Jin Juan1， Li Sheng1， Xiong Hao-ming2，

Yang Jian-guo2， and Dai? Rui-xia1

（1 Specialized Laboratory of? Yersinia pestis， Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 811602;

2 Department of Plague， Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 811602）

Abstract Objective To observe the efficacy of levofloxacin in the treatment of experimental plague in guinea pigs. Methods According to China pharmacopoeia， the daily dose of levofloxacin were converted into the guinea pig dose by using the method of Shixinyou animal conversion coefficient. A 24 h treatment group， a 48 h treatment group， and a control group were set up， with 10 guinea pigs in each group. Thirty guinea pigs were injected subcutaneously with 141 strains of Yersinia pestis of 1×107 cfu/mL on the mouse surface. Levofloxacin was injected 12 mg/d at 24 h

and 48 h in the treatment group， respectively， once a day for nine consecutive days and nine days of observation. Results The cure rates of levofloxacin in 24 h and 48 h treatment groups were 100% and 70%， respectively， and all the animals in control group died. Conclusion Levofloxacin has a significant therapeutic effect on plague in experimental animals and can be used in the first-line clinical treatment of plague.

Key words Plague; Levofloxacin; Treatment; Guinea pigs; Clinical observation on

鼠疫（Plague）是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis，? ?Y. pestis）引起的一種自然疫源性傳染病，發病急、傳染性強且該傳染病死率極高，屬國際檢疫傳染病，是我國《中國傳染病防治法》第三條中規定的甲類傳染病之一。歷史上曾有過多次鼠疫大流行，感染者死亡總人數接近2億[1]。隨著青霉素及其他抗生素的廣泛應用，鼠疫全球性的大流行再未出現，也未造成病例的大量死亡[2]。但是最近幾年鼠疫卷土重來，其中比較嚴重的2017年非洲馬達加斯加鼠疫疫情，確診病例超過了2600例，超過半數病例為肺鼠疫[3]。我國自進入21世紀后，鼠疫疫情呈現局灶性與散發性分布，多發于西北部的青海省和西藏自治區，主要由于青壯年主動進入鼠疫疫區或者接觸了患有鼠疫的宿主動物，因此被鼠疫菌感染[4]。2019年我國北京市出現2例從內蒙古輸入的肺鼠疫病例[5]，之后內蒙古又出現2例腺鼠疫患者[6-7]，這一事件為我們敲響了警鐘，提示我國鼠疫防控形勢仍然嚴峻，防控工作不容松懈[8]。

目前國內外鼠疫的治療一線方案中仍一致選用鏈霉素，只是各國在選用的治療劑量上有所不同而已[9]，這與鼠疫菌種屬的遺傳特征和對抗生素的敏感性不同有關，但鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，其安全范圍窄，不良反應明顯，具有一定的耳毒性和腎毒性[10]。近年來陸續有鼠疫耐藥菌株的報道，其中馬達加斯加報道了一株多重耐藥性鼠疫菌，不僅耐鏈霉素而且對磺胺類藥物也出現耐藥[11-13]。氟喹諾酮類藥物在體外試驗中對鼠疫菌顯示良好的抗菌活性，在動物實驗中也取得了良好效果。目前美國FDA已經批準左氧氟沙星為鼠疫治療中的主要抗生素[14]，但是我國還未確定其為鼠疫患者一線治療藥物或替代治療藥物。本試驗旨在觀察左氧氟沙星不同注射時間治療感染鼠疫動物的療效，從而為是否能將左氧氟沙星作為替代藥物納入我國鼠疫的治療方案中提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、菌株、培養基及藥物

SPF級豚鼠30只，雌性，體重250～300 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供。鼠疫菌強毒株141及試驗用赫氏培養基（購自北京陸橋股份有限公司）均由青海省地方病預防控制所鼠疫菌專業實驗室提供。注射用甲磺酸左氧氟沙星，山東羅欣藥業集團有限公司，0.2 g，國藥準字H20051882。

1.2 主要儀器

意大利泰尼百斯公司動物負壓隔離籠，賽默飛世爾公司Ⅱ級B2型生物安全柜，美國紐埃爾公司換籠工作臺。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

將30只、體重為250～300 g的SPF級雌性豚鼠完全隨機地分配至24 h治療組、48 h治療組和對照組，每組10只，實驗前編號、稱重。

1.3.2 實驗感染

取強毒鼠疫菌141株37℃ 24 h培養物，比濁稀釋為濃度約為1×107 cfu/mL的菌懸液于豚鼠鼠鼷部，采用皮下注射方式感染，染毒劑量為1 mL/只。

1.3.3 治療

左氧氟沙星用量參照《中國藥典》成人劑量，用施新猷等[15-16]動物折算系數法換算豚鼠用藥劑量。左氧氟沙星為40 mg/kg/ d，豚鼠給藥量=40 mg/（kg·d） ×0.3 kg=12 mg/d，24 h和48 h治療組均通過皮下注射給藥，對照組不治療。

1.3.4 治愈標準

按常規量用左氧氟沙星治療感染動物9 d，經醫學觀察9 d未死亡，處死解剖，各臟器均未分離到鼠疫菌，同時具備上述兩項條件判定為豚鼠鼠疫治愈。如治療期間豚鼠死亡，解剖后取臟器壓印培養后如果分離到鼠疫菌則判定為鼠疫治療無效，動物屬特異性死亡。

1.3.5 觀察

對實驗期間死亡動物解剖后取材做壓印鼠疫細菌學培養，并觀察其組織臟器病理改變。存活動物于停藥后第9天全部處死，解剖取材后進行細菌學檢驗和組織臟器病理觀察。

1.3.6 實驗操作

涉及高生物安全風險的實驗步驟，例如鼠疫菌培養、動物染毒和解剖培養等均在青海省地方病預防控制所生物安全三級動物實驗室進行。

2 結果

2.1 治療組療效觀察

表1結果顯示，左氧氟沙星于感染后24 h開始治療的10只豚鼠全部治愈，治愈率為100%，于感染后48 h開始治療的10只豚鼠存活7只，治愈率為70%，動物死亡時間為感染后3～7 d。

2.2 對照組的觀察

未治療實驗豚鼠于染毒后第3天死亡3只，之后陸續死亡，第6天實驗動物全部死亡，解剖后剪取各臟器，用臟器切面壓印于培養基培養后均分離到鼠疫菌，屬于特異性死亡。

2.3 動物感染鼠疫后的觀察

染毒后的對照組動物表現為精神差，食欲不佳，食量驟減，不飲水或飲水較少，身體蜷縮在籠盒角落發抖，毛豎立狀，盜汗，行動遲緩或不活動，3～6 d陸續死亡，解剖后肉眼可見皮下有充血，鼠鼷部淋巴結均有腫大，并且與周圍組織發生黏連，局部有個別化膿灶。24 h治療組和48 h治療組動物染毒后，起初精神萎靡，納食差，飲水少，活動量減少，隨著每日治療的進行，24 h治療組實驗動物于2 d后開始攝食，其活動量也逐漸增加，納食轉佳、毛逐漸順滑，恢復正常狀態，然而48 h治療組實驗動物則于4～5 d后才開始轉愈恢復正常狀態。治療動物停藥后觀察9 d，各方面狀況佳，體重有所增加，對照組豚鼠解剖后，肝臟輕微充血腫大呈紫褐色，表面有點狀壞死灶。脾臟明顯腫大發生充血，質地硬，表面有點狀壞死灶，雙肺也充血腫大狀態，顏色為暗紅色，分別將肝臟、脾臟、肺、心臟、淋巴腺切面壓印于培養基進行鼠疫細菌學檢驗，鏡下可見鼠疫菌，鼠疫菌裂解實驗陽性，屬特異性死亡。治療組豚鼠解剖后，肝、脾已逐漸恢復正常大小，其他各臟器無明顯病理改變，接受治療的動物死亡后臟器壓印培養后均未見鼠疫菌，詳見圖1。

3 討論

近些年來鼠疫時有發生，仍威脅著世界各國的公共衛生安全[17]，因此未來鼠疫治療研究方向中應著眼于研究有效安全的治療藥物，制定藥物敏感且藥物毒副作用小的治療方案。在我國鏈霉素仍然為鼠疫治療首選藥物，但在未來的臨床治療中不可避免的出現鼠疫菌耐鏈霉素狀況，這時候則需要果斷啟用鏈霉素替代治療方案。我國鼠疫菌的生物型別更豐富，所以在左氧氟沙星的使用劑量上，國內外治療方案會有差異，還需進一步進行實驗驗證。左氧氟沙星為第三代喹諾酮類藥物，其藥物作用機制是通過抑制細菌DNA的合成從而殺滅細菌。辛有全等體外抗菌活性試驗結果表明鼠疫菌對左氧氟沙星是敏感的，左氧氟沙星對我國1010株鼠疫菌的MIC范圍為0.03～0.25 μg/mL[18-19]，根據CLSI鼠疫耶爾森菌標準（敏感：≤0.25 μg/mL），因CLSI尚無鼠疫耶爾森菌耐藥中介及標準，參照一般細菌標準擬定左氧氟沙星的耐藥折點（耐受：≥8 μg/mL），但這些試驗均為體外實驗，其不能完全證明左氧氟沙星的療效，因此還需要通過動物實驗加以驗證。

本次實驗使用的染毒株141屬于鼠疫強毒株，其對豚鼠最小致死量（MLD）為50 cfu/mL[20]，本實驗攻擊劑量為1×107 cfu/mL，是其MLD 2×105倍，左氧氟沙星于感染后24 h接受治療的實驗豚鼠存活率為100%，48 h開始治療的存活率為70%，雖然48 h治療組較24 h治療組存活率低，但仍有大于半數的實驗豚鼠存活。這就說明了左氧氟沙星治療鼠疫療效顯著。因此，我們可以認為左氧氟沙星治療重癥鼠疫是可行的，如果在臨床治療中出現耐鏈霉素的患者，左氧氟沙星可替代鏈霉素進行臨床治療，但應遵循早診斷，早治療的原則，從而提高鼠疫患者的治愈率。任何藥物初期使用階段都是敏感有效的，但是在長期使用過程中可能會不可避免的出現抗藥，因此在左氧氟沙星臨床治療過程中，應盡量做到規范用藥，并且定期做藥物耐藥性監測，使之成為一種可持續發展的治療方案。本研究對我國鼠疫治療方案的更新具有現實意義，也將進一步提高了我國鼠疫防控工作的防治水平。

參 考 文 獻

黎文鴻， 王夢迪， 尹家祥. 自然環境改變對鼠疫發生的影響[J]. 中國熱帶醫學， 2021， 21（10）： 1013-1016.DOI：10.13604/j.cnki.46-1064/r.2021.10.20.

Gage K L， Kosoy M Y. Natural history of plague： Perspectives from more than acentury of research[J]. Annu Rev Entomol， 2005， 50： 505-528.

李碩， 張云輝， 王永怡， 等. 2017年全球傳染病熱點回顧 [J]. 傳染病信息， 2018， 31（1）： 5-10.

向鎖玉， 孫希， 吳忠道. 中國鼠疫的疫情及防治進展[J]. 中國熱帶醫學， 2020， 20（5）： 486-490.

內蒙古錫林郭勒盟衛生健康委、北京市朝陽區衛生健康委. 錫林郭勒盟確診兩例鼠疫病例[EB/OL]. （2019-11-13）[2019-11-18]. http ： // www.chinacdc.cn/jkzt/crb/jl/sy/gzdt/201911/t20191118_206911.html.

內蒙古自治區衛生健康委員會. 內蒙古自治區四子王旗確診1例腺鼠疫病例[EB/OL]. （2019-11-28）[2019-12-28].http：//www.chinacdc. cn/jkzt/crb/jl/sy/gzdt/201911/t20191128_207187.html.

內蒙古自治區衛生健康委員會. 錫林郭勒盟一患者在化德縣被確診為腺鼠疫自治區采取切實措施加大防控力度 [EB/OL]. （2019-11-17）[2019-11-18].http：//www.chinacdc.cn/jkzt/crb/jl/ sy/gzdt/201911/t20191118_206913.html.

蘇麗瓊， 梁云， 吳鶴松， 等. 云南省1986—2014年人間鼠疫流行病學特征分析[J]. 中國媒介生物學及控制雜志， 2016， 27（4）： 386-388.

陳沖， 葛子若， 王琳， 等. 國內外鼠疫抗菌治療方案辨析及前瞻[J]. 中國藥物戒， 2020， 17（1）： 1-5， 22.

李海龍， 馬英， 鄭誼. 鼠疫治療研究進展[J]. 中國地方病防治雜志， 2009， 24（1）： 32-33.

Wong J D， Barash J R， Sandfort R F， et al. Susceptibilities of Yersinia pestis strains to 12 antimicrobial agents[J]. Anti-microb Agents Chemother， 2000， 44（7）： 1995-1996.

Galimand M， Guiyoule A， Gerbaud G et al. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferable plasmid[J]. N Engl J Med， 1997， 337（10）： 677-680.

Welch T J， Fricke W F， McDermott P F， et al. Multiple antimicrobial resistance in plague： An emerging public health risk[J]. PLoS one， 2007， 2（3）： e309.

佚名. 左氧氟沙星獲批用于治療鼠疫[J]. 中國食品藥品監管， 2012， （6）： 5.

秦川， 魏泓. 實驗動物學[M]. 北京： 人民衛生出版社， 2010. 298.

施新猷. 醫用實驗動物學[M]. 陜西： 陜西科學技術出版社， 1989. 421.

WHO. Weekly bulletins on outbreaks and other emergencies[EB/OL].[2018-02-27]. http：//apps.who.int/iris/bitstream/10665/259809/1/ OEW1-2018.pdf

辛有全， 何建， 楊曉艷， 等. 左氧氟沙星和莫西沙星對鼠疫耶爾森菌最低抑菌濃度的測定[J]. 現代預防醫學， 2020， 47（22）： 4148-4150.

CDC. Diagnosis and Treatment[EB/OL]. [2018-11-17].https：//www. cdc. gov/ plague/ healthcare/ clinicians. html.

戴瑞霞， 李敏， 楊曉艷， 等. 小白鼠及豚鼠和家兔對鼠疫菌敏感性實驗比較[J]. 中國地方病學雜志， 2006， 25（3）： 347.

收稿日期：2021-03-05

基金項目：青海省科技廳基礎研究計劃項目（No. 2019-ZJ-7074）；國家衛生健康委鼠疫防治研究重點實驗室 （共建）（No. 2019PT310004）；

青海省鼠疫防控及研究重點實驗室（No. 2021-ZJ-Y15）

作者簡介：張琪，女，生于1988年，主管醫師，主要從事鼠疫防治及鼠疫菌種鑒定，E-mail： 449132626@qq.com

*通訊作者，E-mail： drx200907@163.com