傳統泡菜制作與乳酸菌的分離觀察

高悅皓

（廈門大學環境與生態學院，福建廈門 361000）

泡菜是一種獨特的乳酸發酵蔬菜制品，食用后會攝入乳酸菌及乳酸等代謝產物，有助于調節腸道微生態平衡，達到預防疾病和保健的目的[1-2]。我國泡菜歷史十分悠久，北魏賈思勰的《齊民要術》一書中，就有制作泡菜的敘述，可見至少1 400多年前，中國就有制作泡菜的歷史。在清朝，川南、川北民間還將泡菜作為嫁奩之一，足見泡菜在人們生活中所占地位[3]。本實驗通過制作傳統泡菜，測定泡菜的理化指標，對制作泡菜不同階段中的乳酸菌進行培養、計數與形態觀察，了解發酵過程中乳酸菌的數量變化，同時通過自然發酵與人工加入乳酸菌兩壇泡菜的對比，探究接種乳酸菌制作泡菜是否能提升制作速率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼白開、圓白菜、大蒜、花椒、干辣椒、生姜、冰糖、碘鹽、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸鈉、酵母提取物、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫80、溴甲酚紫、瓊脂、泡菜乳酸菌粉、NaCl、pH計緩沖液、革蘭氏染色液（結晶紫、碘液、95%乙醇、番紅）、芽孢染色液（孔雀綠染液、7.6%飽和孔雀綠水溶液、番紅水溶液）、3%過氧化氫溶液、放線菌酮。

1.2 儀器

SQP電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）］、培養皿、pH計、燒杯、厭氧培養袋、MGC-350BP-2光照培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、O2YMPVS CX21生物顯微鏡、接種環、C21-SDHCB06G電磁爐。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統泡菜的制作

購買新鮮的圓白菜，清洗，瀝干，切分，用電子天平稱取224.00 g裝入泡菜缸，同時加入13.86 g大蒜、4.62 g花椒、4.62 g干辣椒、4.62 g生姜、36.96 g冰糖和36.96 g碘鹽，最后向其中加入700 mL涼白開，封壇并做好標記存于陰涼處；取另一個泡菜缸，重復第一個的操作，并在封壇前向其中加入1包泡菜乳酸菌粉，做好標記同樣存放于陰涼處。

1.3.2 MRS培養基及生理鹽水的配制

稱取蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、葡萄糖 5 g、乙酸鈉0.5 g、酵母提取物0.5 g、檸檬酸二胺0.2 g、磷酸氫二鉀0.02 g、硫酸鎂0.02 g、吐溫80 0.1 g、溴甲酚紫 0.04 g及瓊脂 1.5～2.0 g，加蒸餾水至100 mL，用電磁爐煮至徹底融化后裝瓶備用。

稱取0.85 g氯化鈉固體，溶解于100 mL蒸餾水中，再通過梯度稀釋配制多種梯度的0.85%無菌生理鹽水。

1.3.3 乳酸菌pH值測定方法

用移液槍從泡菜缸內取5 mL泡菜液于燒杯中，對pH計進行校正后，對其進行pH測定。

1.3.4 乳酸菌培養方法

從泡菜缸中取泡菜液，估算合適的梯度，進行稀釋平板涂布，并將培養皿封入厭氧培養袋后放入37 ℃光照培養箱進行培養。

1.3.5 革蘭氏染色、芽孢染色和接觸酶測試方法

（1）革蘭氏染色。涂片、干燥，并在酒精燈火焰上過火固定，然后滴加結晶紫染色1～2 min，后用水沖洗，接著滴加碘液染色1 min后，用水沖洗，甩盡殘余水，再用95%乙醇沖洗30 s，嚴格控制時間和濃度，然后立即用水沖洗。接著用番紅覆蓋涂片進行復染，染3～5 min，水洗，晾干，最后先用低倍鏡觀察，后用高倍鏡觀察。

（2）接觸酶測試。先在載玻片上加1滴3%H2O2，然后用非金屬接種工具刮取斜面或平板上的培養物與其混合，再用肉眼或低倍鏡觀察其冒氣情況。

（3）芽孢染色。將培養24 h左右的菌體，進行涂片、干燥、固定，再滴加3～5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上，用飽和的孔雀綠水溶液（約7.6%）染10 min，然后傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止，再用番紅水溶液復染1 min，水洗，最后待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

1.3.6 乳酸菌形態、數量觀察

對培養的平板上的乳酸菌進行肉眼計數和放大鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 泡菜制作過程的觀察

經實驗觀察發現，泡菜第1 d是綠色，隨著時間的延長，其顏色逐漸變為黃色，泡菜液從澄清逐漸變渾濁，這是泡菜發酵過程中色素溶解、細菌代謝、乳酸菌演替所產生的正?，F象[4]。

2.2 泡菜液pH值

由圖1可知，未加乳酸菌的泡菜液的pH值隨著發酵天數的增加呈現出先升高后下降的趨勢，在第3 d左右開始逐漸趨于平緩[5]，最終pH值在3.22左右。pH值最開始升高是因為發酵剛開始時蔬菜表面還存在一些革蘭氏陰性好氧菌和一些氧化酵母菌，它們利用最初一段時間的有氧環境和乳酸菌產生的乳酸進行代謝，造成乳酸消耗，最終讓pH值有短暫的上升過程。

圖1 兩缸泡菜液的pH值隨時間的變化曲線圖

通過加入乳酸菌的泡菜液的pH值變化曲線可以看出，pH值從一開始便呈現出下降的趨勢，并且在第2 d左右就開始逐漸趨于平緩，最終pH值在3.10左右。這與未加乳酸菌不同的原因是加入大量乳酸菌后，從一開始乳酸菌就在泡菜中占據絕對優勢，產生大量乳酸，酵母菌等其他雜菌開始便難以生長，所以pH值從一開始便呈現出下降的趨勢。

通過兩者對比，可以看出加入乳酸菌的泡菜pH值趨于平緩的時間要早于未加乳酸菌的泡菜，說明加入乳酸菌可以加快泡菜的制作。最終到達的pH值也是加入乳酸菌的泡菜要略低于未加乳酸菌的泡菜，推測原因是乳酸菌數量多所產乳酸也較多，雖然經過一段時間的種群數量變化和乳酸動態變化會逐漸趨于一致，但是加入乳酸菌的泡菜最后酸性仍會略強一些。

2.3 乳酸菌優勢度檢驗

由圖2革蘭氏染色結果可以看出，未加乳酸菌粉泡菜液培養基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培養基中的菌株幾乎均被染為紫色，只有少量為紅色，說明絕大部分菌株都是以乳酸菌為代表的革蘭氏陽性菌。未加乳酸菌粉泡菜液培養基中的菌株少數呈現紅色的原因可能是有少量酵母菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌在培養第2 d還沒完全死亡或染色時番紅染液浸染時間過長[6]。

圖2 培養基菌株革蘭氏染色結果圖（10×100）

由圖3芽孢染色結果可知，未加乳酸菌粉泡菜液培養基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培養基中的菌株幾乎均被染為紅色，極少數為綠色，說明絕大部分都是菌體。極少數呈現綠色的原因可能是有少量枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌在培養第2 d天還沒完全死亡或染色時孔雀石綠染液浸染時間過長。

圖3 培養基菌株芽孢染色結果圖（10×40）

由圖4接觸酶測試可知，菌株與H2O2接觸時肉眼幾乎看不到任何變化，說明泡菜缸中的細菌幾乎不含產氣菌。

圖4 培養基菌株接觸酶測試結果圖

綜合以上3個檢測試驗，可以排除絕大部分革蘭氏陰性菌、芽孢桿菌和產氣菌，說明泡菜缸內的菌體幾乎全部為革蘭氏陽性菌、厭氧細菌——乳酸菌。

2.4 乳酸菌數量的觀察

從圖5可以看出，未加乳酸菌的泡菜缸內乳酸菌數量呈現先升高后降低的趨勢，在第4 d數量達到最多，且在第7 d后仍會降低，但推測會逐漸趨于平緩。推測原因是最開始乳酸菌數量還未達到飽和，鹽分使白菜中的可溶性物質進入泡菜液為乳酸菌提供營養，且逐漸形成的無氧環境會讓乳酸菌在與其他雜菌的競爭中占據優勢，從而加速增長，在第4 d數量由于資源的限制到達飽和值，且過多的乳酸抑制了乳酸菌的生長，其數量開始逐漸下降，但由于實驗天數有限，因此統計到第7 d后仍呈下降趨勢，但推測會逐漸趨于平緩，達到動態平衡[7-9]。加入乳酸菌的泡菜缸內乳酸菌數量呈現先下降后趨于平緩的趨勢，從第5 d開始乳酸菌數量基本保持不變。這可能是因為剛開始時乳酸菌是絕對的優勢種群，其數量超過了飽和值，因此會一直下降以達到動態平衡[10]。

圖5 兩缸泡菜液的乳酸菌數量隨時間的變化曲線圖

通過兩者對比，可以看出加入乳酸菌的泡菜缸內乳酸菌數量相較于未加乳酸菌會更快到達穩定值，且最后的穩定值要更高。

2.5 乳酸菌形態的觀察

如圖6所示，乳酸菌菌落大致有以下幾種形態特征：①邊緣整齊，表面光滑，中央有凸起或扁平的白色或乳白色菌落，菌落直徑在0.5～1.0 mm；②邊緣不整齊、表面粗糙無光澤、中央有凸起或中央扁平的褐色或乳黃色半透明菌落，直徑約為0.5～3.0 mm；③圓形、邊緣整齊、表面光滑、扁平隆起的灰白色菌落，菌落直徑在1.0～2.0 mm；④圓形、邊緣整齊、不透明、中心凸起的乳白色菌落，菌落直徑在1.0 mm左右；⑤圓形邊緣光滑半透明微凸起的白色菌落，菌落直徑在1.0 mm左右。

圖6 MRS培養基乳酸菌觀察圖

3 結論

通過本實驗的研究結果發現，自然發酵的傳統泡菜的pH值會呈現先升高后降低并在第3 d開始逐漸趨于平緩的趨勢，且最高值出現在第1～2 d，乳酸菌數量會呈現先升高后降低的趨勢，推測也會逐漸趨于平緩，最高值出現在第4 d左右，這是由于乳酸菌在逐漸無氧的內部環境里逐漸在與其他雜菌的競爭中占據優勢的原因。加入乳酸菌發酵的泡菜的pH值從一開始便會逐漸下降，在第2 d左右就會逐漸趨于平緩，乳酸菌數量一開始就下降并在第5 d開始逐漸趨于平緩，這是由于乳酸菌數量一開始就處于絕對優勢，超過了資源的可容納范圍，逐漸下降并最終達到與資源相適應的動態平衡。通過兩種泡菜對比分析，可以看出加入乳酸菌可以明顯加快泡菜的制作速度，且最后的pH和乳酸菌數量都會略多于自然發酵的泡菜。