植物蛋白飲料摻假鑒別技術研究進展

梁美丹，肖 劍，勞嘉倩，林秀敏，陳 楷，蔣佳希

（廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400）

植物蛋白飲料是以植物果仁、果肉及大豆為原料（如花生、杏仁、核桃仁和椰子等），經加工、調配后，再經高壓殺菌和無菌包裝制得的乳狀飲料，其不含或含較少的膽固醇，富含蛋白質、氨基酸及適量的不飽和脂肪酸，營養成分較全面，深受消費者歡迎，已成為飲料市場上不可或缺的產品[1]。統計數據顯示，2007年以來各飲料子行業增速最快的是植物蛋白飲料，2016年植物蛋白飲料行業收入為1 217.2億元，2020年植物蛋白飲料市場高速發展，增速高達800%，購買人數上升900%，銷量增速遠超其他飲料品類，在飲料市場中成長貢獻15.5%，排名第3。隨著植物蛋白質飲料原料價格的上漲，部分生產企業為降低生產成本，在飲料中摻入廉價的植物蛋白粉，或摻入成本低廉的非產品標識的植物原料，如央視在2018年“3·15”晚會中，曝光了多家企業在生產核桃露時未使用核桃漿，而使用成本遠低于核桃漿的花生醬或核桃香精代替，上述行為嚴重擾亂社會市場秩序，損害消費者的合法權益。目前，植物蛋白飲料市場摻雜使假情況比較嚴重，群眾關注度高，有研究表明市場上35%蛋白質飲料標識的植物源性成分未檢出，存在與產品標識成分及含量嚴重不符的情況[2]。因此，對于植物蛋白飲料摻假鑒別技術研究有重要的實際意義。

1 檢測技術

目前，植物蛋白飲料檢測的相關標準落后及不全面，采用定性檢測的方法無法對植物蛋白飲料的成分進行高通量快速鑒定及品質的準確定量，監管部門不能準確、快速認定產品是否具有摻假行為，給人們的生活質量和安全帶來不穩定的因素。目前，針對植物蛋白飲料中源性成分鑒偽的研究相對較少，主要集中于酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、色譜和質譜技術、電泳技術以及分子生物學技術。

1.1 ELISA檢測技術

賴心田等[3]用間接競爭ELISA檢測方法實現了對核桃制品中核桃含量的測定。方娟[4]建立了ELISA定量檢測核桃蛋白的方法并成功組裝了一款檢測試劑盒。基于抗原抗體免疫原理的ELISA，由于過敏原蛋白之間存在一定程度的同源性而極易出現交叉反應，加熱等加工工序會對植物蛋白飲料蛋白質及脂質的結構造成很大的影響，從而導致無法被抗體正確識別而出現假陰性，檢測結果易受植物蛋白飲料工業化加工流程的影響，同時存在操作較為煩瑣、檢測結果不準確等缺點，不適合應用于大批量樣品的檢測。

1.2 色譜和質譜技術

張敬敬[5]用氣相色譜法建立了核桃乳脂肪酸標準指紋圖譜，對核桃乳質量進行控制，并對核桃乳進行相似度分析，建立核桃乳摻假模型，定性鑒別核桃乳摻假。張淑霞等[6]采用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生源性成分，并初步建立了平行反應監測模式（Parallel Reaction Monitoring，PRM）檢測核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生特征肽段的方法。以蛋白質、脂質等物質為檢測對象的色譜和質譜技術雖然可在一定程度上檢測目標源性成分，但其檢測結果易受植物蛋白飲料工業化加工流程的影響，同時存在操作較為煩瑣、儀器設備昂貴等缺點。

1.3 電泳技術

王斌等[7]利用高效毛細管電泳技術獲得杏仁和巴旦木特征遷移峰，以特征峰相對遷移時間結合特征峰相對強度，實現了杏仁露中巴旦木摻假的半定量分析，半定量限為10%。孫克江等[8]建立十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定核桃、杏仁、花生和大豆中的蛋白成分，通過分析不同物種的蛋白質，確定核桃、花生、黃豆和杏仁的特征條帶，從而達到對食品中植物源性成分的鑒定。由于上述方法是以蛋白質為檢測對象，檢測結果易受到蛋白飲料深度加工的影響。

1.4 分子生物學技術

植物蛋白飲料實際生產中經常要進行一系列的高溫處理，會破壞蛋白質及脂質的結構，而經過長時間高溫高壓的處理后，植物DNA仍能保持完整。因此，在植物蛋白飲料源性成分檢測中，基因水平檢測方法較蛋白及脂質檢測方法更具優勢。目前，應用較為廣泛的分子生物學技術主要包括常規聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術、環介導等溫擴增技術和實時熒光PCR技術等。常規PCR技術靈敏度高、特異性好，DNA條形碼技術成本低、快速可靠，均被廣泛應用于食品中的定性檢測。環介導等溫擴增技術具有特異性強、靈敏度低、檢測成本低及所需的儀器設備簡單等優點，適用于致病菌、動植物源性成分等領域的定性分析。實時熒光PCR技術不僅可用于定性檢測，還可測定循環閾值和初始DNA模板濃度進行相對定量。這些技術各有其優點，但卻無法滿足精準定量分析的需求，尤其是對于經深加工、目標檢測物質豐度較低的植物蛋白飲料類終端類產品。數字PCR技術和微流控芯片技術是近年來應用于食品安全檢測領域的新技術，可以彌補或解決以上技術問題。

1.4.1 微滴數字PCR

近年來，微滴數字聚合酶鏈反應（Dropletdigital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是繼常規PCR和實時熒光PCR之后的第3代PCR技術，是基于單分子目標基因PCR擴增的絕對定量技術，可以直接計數樣品中靶分子和參考DNA分子的絕對數量，不依賴于檢測效率或外部校準設備。該技術具有準確性好、靈敏度高、無需任何校準物質以及可對樣品核酸進行絕對定量等優勢，目前已在轉基因食品檢測、微生物豐度檢測、病毒載量的絕對定量和食品中內源性成分鑒定等方面得到較廣泛的研究與應用[9-12]。ddPCR技術在植物源性食品真偽鑒別領域研究相對較少，郭楠楠等[13]建立了杏仁露中杏仁、花生源性成分ddPCR定量檢測體系，并對12個市售的杏仁露進行檢測發現存在著不同程度的摻假現象。目前，ddPCR技術在市場上并未形成完善的檢測體系，在動植物源性成分鑒定方面的應用相對較少。

1.4.2 微流控芯片

微流控芯片技術源于20世紀90年代MANZ等[14]提出的微型全分析系統的概念，主要是指采用微機電系統技術在方寸大小的芯片上加工微米至納米尺度的微通道網絡，通過微尺度下流體的精確操控，在芯片上實現樣品引入、前處理、混合、化學反應、分離和檢測等功能，其系統具有微量、高效、成本低、微型化、集成化、高通量和自動化等特點。隨著微流控芯片技術的發展，越來越多的檢測手段能夠與微流控芯片技術相結合，尤其是在生命科學領域，微流控芯片技術在核酸檢測方面得到了廣泛應用。以微流控環介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術及微流控液滴技術為代表的微流控PCR技術在微生物分離篩查、致病菌檢測、病毒檢測等方面的研究是當下的研究熱點之一，但在動植物成分鑒定、蛋白質飲料源性成分鑒定方面的研究較少[15-16]。微流控技術用于源性成分檢測將有助于實現實際樣品檢測過程中的高通量操作，進一步提高與分子生物學交叉的多學科研究成果用于食品檢測中的應用水平。

2 結語

鑒于目前植物蛋白飲料摻雜使假檢測技術現狀，急需建立植物蛋白飲料高通量定性檢測特征性植物源性成分及絕對定量一體化的檢測體系，實現多種蛋白質飲料目標成分高通量的快速檢測，對產品標明的成分含量實現絕對定量的檢測。依據現有的技術特點和檢測需求，可重點考慮微滴數字PCR（ddPCR）技術、微流控芯片技術的研究應用，通過這兩種技術手段構建一套成熟的特異性強、靈敏度高、絕對定量的蛋白飲料中植物源性成分高通量檢測體系，為植物蛋白飲料行業中摻雜使假等問題提供有效的鑒別手段，為國家食品安全監管監測及突發事件應急提供精準的檢測技術支撐。