食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養基的優化

王 樂，陳 佳，秦 麗

（1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000；2.石家莊學院化工學院，河北石家莊 050035；3.河北省知識產權保護中心，河北石家莊 050000）

沙門氏菌（Salmonella）是一種最常見的、能引起人畜共患病的食源性致病菌，在人和動物體中有廣泛的寄主[1]。我國由沙門氏菌引起的食源性疾病居細菌性食源性疾病的首位[2]。在消費者食用被沙門氏菌污染的食物后，會出現腹瀉、腸胃炎、發熱和敗血癥等一系列癥狀[3]。

近年來，隨著生活水平的提高，人們對食品安全問題的重視日益增加。食品中富含各種營養物質，是食源性致病菌生長、繁殖的良好基質，而且食品在加工、包裝、配送及儲存等過程中也極易受到食源性致病菌污染[4]。因此，加強對食品中食源性致病菌的檢測就顯得十分重要。據世界衛生組織統計，沙門氏菌在食源性致病菌中排名第一，世界各國對于食品中沙門氏菌的檢測要求都十分嚴格，沙門氏菌污染一直是食品行業檢測的重要指標之一[5]。

目前，沙門氏菌的檢測方法主要有傳統培養方法、免疫學方法和PCR法[6-8]。隨著科學技術的發展，多重PCR法、實時熒光PCR法、側向流動檢測法等一系列新方法也逐步開始應用于食品中沙門氏菌的檢驗[9-11]。但傳統培養方法和現代檢測技術都必須以目標菌的富集為前提，從而進行后續的檢測[12]。前增菌過程可以實現目標菌的富集，是縮短增菌時間、降低背景干擾的有效手段[13]。沙門氏菌現行國家標準方法的前增菌是采用緩沖蛋白胨水培養基使樣品中菌體恢復并大量增殖的過程，此步驟對后續檢出率的影響至關重要，但其所需的檢測時間較長[14]。因此，本研究以緩沖蛋白胨水培養基為基礎，通過酵母添加量的優化，以期得到一種快速、特異性強的培養基，從而縮短前增菌時間，為我國食品安全的風險監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗所用的鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50976）購于中國醫學細菌保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器設備

酵母浸膏（Becton，Dickinson and Company）；磷酸鹽緩沖液、營養瓊脂、緩沖蛋白胨水、平板計數瓊脂（北京路橋技術股份有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×PCR Master Mix（天根生化科技北京有限公司）；引物及探針（生工生物工程上海股份有限公司）。

二級生物安全柜；多功能酶標儀（Synergy HTX）；恒溫培養箱（PHCbi）；電子天平（ME4002E）；Sigma 3K15冷凍離心機（德國Sigma公司）；LightCycler 480II實時熒光定量PCR儀（德國羅氏診斷有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

把-80 ℃保存的鼠傷寒沙門氏菌CMCC50976加入到無菌磷酸鹽緩沖液中，挑取菌懸液在營養瓊脂平板上劃線，36 ℃培養24 h，重復一次。挑取活化好的單菌落接種于磷酸鹽緩沖液中，振蕩均勻，將菌懸液的麥氏濁度控制在0.5～0.6。對上述菌懸液進行10倍梯度稀釋，吸取100 μL菌懸液接種于平板計數瓊脂上，36 ℃培養48 h后計數。菌懸液的濃度為 7.7×106CFU/mL。

1.3.2 酵母浸膏添加量的篩選

以緩沖蛋白胨水為基礎，分別添加終濃度為0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和11 g/L的酵母浸膏，每瓶分裝100 mL，高壓滅菌。對添加不同濃度酵母浸 膏（0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和 11 g/L）的改良緩沖蛋白胨水培養基接種1 mL 1.3.1中濃度為7.7×10-6CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌。空白培養基作為對照，與接種后的培養基同時放入36 ℃培養箱培養。

1.3.3 沙門氏菌OD550值的測定

沙門氏菌菌懸液培養2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后，分別用酶標儀測量550 nm波長下空白培養基和菌懸液的OD550值。以OD550值的大小衡量沙門氏菌生物量的多少，篩選出最佳酵母浸膏的添加量。

1.3.4 沙門氏菌平板計數法的驗證

同時吸取1 mL菌懸液，10倍梯度稀釋后接種在平板計數瓊脂上，36 ℃培養48 h后計數。

1.3.5 實時熒光PCR法的特異性驗證

采用試劑盒法對培養10 h后酵母浸膏濃度為9 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液進行DNA模板的提取，采用實時熒光PCR法驗證其特異性。試驗重復3次，設置陽性對照（沙門氏菌菌懸液基因組DNA），陰性對照（其他菌菌懸液基因組DNA）和空白對照（添加無菌水）。

實時熒光PCR法引物序列為P1：5'-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3'；P2：5'AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3'。實時熒光PCR法探針序列為“FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMARA”。最終反應體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL；上下游引物各 0.5 μL；探針 0.5 μL；DNA 模板 5 μL；雙蒸水補足25 μL。反應程序為：預變性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；65 ℃，30 s；40 個循環。

2 結果與分析

2.1 生長曲線測定結果

由圖1可知，沙門氏菌菌懸液OD550值隨生長時間增加呈現上升的趨勢，18 h后進入穩定期，培養24 h前沒有出現衰亡期。添加酵母浸膏的改良緩沖蛋白胨水菌懸液，培養2 h后均結束調整期，進入對數增長期；緩沖蛋白胨水菌懸液，培養4 h后，才結束調整期，進入對數增長期。從整體趨勢分析，改良緩沖蛋白胨水的增菌速度明顯高于緩沖蛋白胨水，沙門氏菌在添加酵母浸膏的培養基中能夠更快地恢復活性。隨著緩沖蛋白胨水培養基中酵母添加量的增加，對數期斜率和穩定期數值基本呈增大的趨勢。

圖1 沙門氏菌生長曲線

2.2 平板計數測定的驗證結果

由表1可知，不同酵母浸膏添加量的緩沖蛋白胨水菌懸液平板計數測定結果與OD550值的變化趨勢基本相同，沙門氏菌的數量隨時間增加呈現上升的趨勢，與2.1中OD550值的變化趨勢一致。

表1 不同酵母浸膏添加量平板計數結果

2.3 沙門氏菌第8 h和第18 h OD550值的比較

由圖2可知，在第8 h，緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值最低，酵母浸膏添加量為3 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值是其3倍。說明酵母浸膏的添加可以促進沙門氏菌的生長。隨著緩沖蛋白胨水培養基中酵母浸膏添加量的增加，菌懸液的OD550值呈緩慢增長趨勢，不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值沒有顯著差異。在第18 h，緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值最低，隨著緩沖蛋白胨水培養基中酵母浸膏添加量的增加，菌懸液的OD550值逐步增加，差異顯著。酵母浸膏添加量為11 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值達到0.38。《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）規定的預增菌時間為8～18 h。因此，增加緩沖蛋白胨水培養基中酵母浸膏的添加量可以使菌懸液提前達到所需的OD550值，從而縮短前增菌時間。

圖2 沙門氏菌第8 h和第18 h OD550值的比較

2.4 緩沖蛋白胨水培養基中酵母浸膏添加量的篩選結果

由于在第8 h不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值沒有顯著差異，而在第18 h不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值差異顯著。因此，根據第18 h菌懸液的OD550值篩選緩沖蛋白胨水培養基中酵母浸膏的添加量。由表2可知，第18 h緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值為0.11。酵母浸膏添加量為3 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第16 h可超過此OD550值；酵母浸膏添加量為5 g/L和7 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第12 h可超過此OD550值；酵母浸膏添加量為9 g/L和11 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第10 h可超過此OD550值。從經濟成本考慮，酵母浸膏的添加量為9 g/L是最佳培養基配比。該改良培養基能充分提供食品中沙門氏菌恢復、生長所需要的營養物質，使沙門氏菌的前增菌時間縮短到8～10 h。

表2 第10～18 h不同酵母浸膏添加量緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值

2.5 實時熒光PCR法的特異性驗證結果

如圖3所示，酵母浸膏添加量為9 g/L的改良緩沖蛋白胨水對食品中沙門氏菌特異性良好，可以實現食品中沙門氏菌的快速檢測。

圖3 實時熒光PCR法擴增曲線

3 結論與討論

食源性致病菌的檢測是食品安全監管的重要環節。沙門氏菌污染造成的食品安全事件時有發生，通常在感染沙門氏菌后12～72 h內出現臨床癥狀，主要包括惡心、頭痛、嘔吐、發燒、腹痛和腹瀉等[15-16]。因此，從食品生產、加工、運輸等各個環節加強對食源性致病菌的檢測顯得至關重要。

培養基為微生物生長提供了適合的環境條件和所需的營養物質，微生物前增菌是影響微生物檢測的重要因素[17]。目前，國內外許多學者已對培養基的優化開展了多種研究[18]。本研究以緩沖蛋白胨水培養基為基礎，通過添加酵母浸膏促進沙門氏菌的恢復和生長。研究表明，隨著緩沖蛋白胨水培養基中酵母添加量的增加，沙門氏菌的調整期縮短，對數期斜率和穩定期數值呈增大的趨勢。調整期縮短表示沙門氏菌在添加酵母浸膏情況下恢復能力增強，可以更快地適應環境；對數期斜率增大表示沙門氏菌的生物量的增速加大，該培養基的配比適合沙門氏菌的生長。吸光度法測定沙門氏菌的生長曲線沒有出現下降的趨勢，因為吸光度法只能測出細菌總數，而不是活菌數量。因此，本研究通過平板計數法與之對比，結果表明吸光度法和平板計數法測定的生長曲線基本一致，這說明培養基中營養比較豐富，沙門氏菌沒有達到衰亡期。食品中沙門氏菌在酵母浸膏添加量為9 g/L的改良緩沖蛋白胨培養基中培養10 h后，菌懸液的OD550值達到0.13，超過其在緩沖蛋白胨培養基中培養18 h后達到的OD550值，改良緩沖蛋白胨水培養基的前增菌時間縮短了8 h。通過實時熒光PCR法的驗證，確定該改良緩沖蛋白胨水培養基特異性良好，可以滿足目標菌的檢測要求。因此，食品中沙門氏菌的前增菌時間可以縮短到 8～ 10 h。

本研究優化了食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養基的配比，通過添加酵母浸膏縮短了前增菌所需的檢驗時間，滿足了快速檢測的需求，為我國食品檢驗工作提供了參考。在加工過程中，食品中的微生物可能會受到高溫或低溫的損傷，處于難培養或活的非可培養狀態（Viable but Non-Culturable，VBNC）[19]。當食源性致病菌進入這一狀態后，將無法采用傳統培養方法進行檢驗，但該致病菌仍能存活，這種現象會對食品安全構成潛在的威脅。因此，本研究下一步的研究方向將會探索培養基對微生物菌體損傷的修復能力，為食源性致病菌的檢測提供更可靠的依據。