QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS測定蜂蜜中4種硝基咪唑藥物殘留

王 華，劉虹虹，羅達龍

（梧州市食品藥品檢驗所，廣西梧州 543000）

蜂蜜中富含糖類、維生素、氨基酸和多種礦物質等，蜂蜜具有護肝、潤肺、增強人體免疫的功能[1]。蜂蜜不僅作為一種營養食品，因其具有一定的藥理作用，也被稱作醫家良藥，在臨床上用于消化系統、創傷治療等疾病的治療[2-3]。因此蜂蜜也成了消費者追捧的產品，在蜂業養殖中為避免蜂群受到疾病感染，會出現抗生素濫用的情況。塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑為《中國藥典》2020年版收錄的4個具有5-硝基咪唑基本結構的藥物，該藥物具有抗原蟲、抗厭氧菌的作用。在養殖蜜蜂時，養蜂人為避免蜂群出現疾病感染，會使用此類抗生素。由于硝基咪唑類藥物具細胞誘變性，有潛在致畸、致癌和致突變的作用，甚至有遺傳毒性[5-8]。該類藥物在蜂蜜樣品中的殘留會對食品安全構成直接威脅，且上述4種藥物，在藥房易于購買獲得，因此需加強檢測。

蜂蜜在食品工業與藥用輔料中有著不可或缺的地位，為保障食品與藥用安全，有必要建立一種前處理簡單、檢測快速、檢測限低、定性與定量準確的測試方法。目前，硝基咪唑類藥物的相關檢測方法為試劑盒快速檢測方法、液相色譜法和氣相色譜質譜等方法[4]。蜂蜜中存在約70%～80%的糖，糖的去除是實驗中的難點。如在前處理中不對糖進行去除，糖會隨著流動相帶入色譜系統與質譜系統，在色譜系統中會導致進樣針與色譜柱的堵塞，也會影響質譜電噴霧過程，使測定的目標物受到基質干擾，產生基質增強或抑制效應，進而導致檢測結果不準確。本方法使用了Na2EDTA-磷酸鹽緩沖液作為提取溶劑，以QuEChERS dSPE EMR-Lipid為凈化劑，SOULAB-ST C18色譜柱為分離手段，運用UPLCMS/MS中的多反應監測模式對蜂蜜樣品中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色譜純乙腈、甲醇購自于歐姆尼公司；分析純試劑無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽購自于上海麥克林生化科技有限公司；凈化劑QuEChERS dSPE EMR-Lipid購買于安捷倫科技有限公司。實驗用水為密理博純水機制備的去離子水；塞克硝唑、甲硝唑、奧硝唑和替硝唑購自中國食品藥品檢定研究院，含量均不小于99.0%。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀Agilent LC1290，液質聯用儀 Agilent-QQQ-6470（Agilent Technologies），超純水儀（Millipore）；渦旋振蕩儀（Thermo Fisher Scientific）；超聲波清洗儀（ELMA）；冷凍離心機（SIGMA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

（1）提取溶劑的配制。取65 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸二氫鈉溶液與435 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液進行混合后，向混合溶液中加入18.6 g乙二胺四乙酸二鈉鹽試劑，經超聲波清洗儀超聲溶解后混勻即得Na2EDTA-磷酸鹽緩沖溶液。

（2）標準儲備液的配制。精密稱取標準物質塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑25 mg至4個25 mL容量瓶中，用色譜級甲醇試劑將標準物質溶解，配制得到1 mg/mL的儲備液，避光保存于2～8 ℃冰箱。

（3）混合標準液的配制。分別吸取塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑及奧硝唑儲備液各25 μL到同一個25 mL容量瓶，用色譜純甲醇試劑進行稀釋得到質量濃度為1.0 μg/mL的混合標準液，存放于2～8 ℃冰箱避光保存。

（4）基質標準工作溶液的配制。吸取混合標準液，用陰性樣品經前處理后所得到的溶液對混合標準液進行稀釋，配制得到的基質標準工作溶液S1～S5濃 度 分 別 為 0.04 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL和5.0 ng/mL，現配現用。

1.3.2 前處理方法

（1）樣品制備。若蜂蜜樣品中不含有結晶，將其攪拌均勻，備用。如蜂蜜樣品中含有結晶，在保證其包裝為密封狀態下，將樣品放置于60 ℃以下的水浴中加熱、振蕩，等蜂蜜樣品全部融化后再把樣品攪拌均勻，冷卻至室溫，即可使用。

（2）樣品的提取。稱取蜂蜜樣品5.00 g到100 mL離心管中，精密加入提取溶劑10 mL，渦旋混合2 min，備用。

（3）樣品的凈化。吸取提取液5.00 mL至EMRLipid凈化管中渦旋混合2 min，精密加入色譜級乙腈試劑5 mL，渦旋混合5 min，在4 ℃下以8 000 r/min離心5 min，吸取上清液0.50 mL到2 mL離心管中，向離心管加入0.50 mL超純水混合均勻，溶液用0.2 μm有機濾膜過濾，待測定。

1.3.3 測試條件

（1）色譜參數。自動進樣器進樣量：3 μL；柱溫箱恒溫溫度：35.0 ℃；色譜柱規格：SOULAB-ST C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相組成：甲醇與0.2%甲酸水溶液；流動相流速：0.35 mL/min；液相色譜流動相梯度：0～0.5 min，10%的甲醇保持0.5 min；0.5～3.5 min，甲醇由10%變化至90%；3.5～4.5 min，90%的甲醇保持1 min；以10%的甲醇比例后運行1.5 min。

（2）質譜參數。正離子模式下噴射流離子源（AJS ESI+），干燥氮氣溫度（150 ℃）；干燥氮氣流速（10 L/min）；鞘氣溫度（325 ℃）；鞘氣流速（10 L/min）；正模式噴嘴電壓（＋500 V）；正模式毛細管電壓（＋4 000 V）；霧化器壓力（30 Psi）。質譜參數見表1。

表1 化合物質譜參數

2 結果與分析

2.1 實驗條件優化

2.1.1 提取及凈化方法的選擇

蜂蜜中的主要成分是糖分，約占蜂蜜的70%～80%，前處理中需使用凈化方法去除糖。如去除糖不完全，會導致色譜柱壽命下降，離子源噴霧針中積累碳化物，同時也會影響待測組分的離子化效率，影響檢測方法的靈敏度。硝基咪唑類化合物在弱堿條件下以游離分子的形式存在，故本實驗采用偏堿性的Na2EDTA-磷酸緩沖溶液對蜂蜜樣品進行提取，使樣品得到更好的分散性以提高目標物的提取效率，提取溶劑中含有Na2EDTA、磷酸鹽，Na2EDTA在提取液中可與樣品中含有的金屬離子進行螯合，減少金屬離子催化導致待測組分的降解。糖溶解于磷酸鹽水溶液中，樣品經EMR-Lipid凈化后使用乙腈把待測組分萃取到乙腈層，使目標物與糖分別在不同的溶劑層，以達到凈化效果。

2.1.2 稀釋溶劑優化

液相色譜在分離過程中會存在一定的溶劑效應，如上機溶液選擇不合適，會影響物質的保留與色譜峰的峰形，進而影響物質在質譜的響應強度?；诖?，本研究用陰性樣品經前處理后得到的乙腈層溶液進行稀釋，制成含80%乙腈、50%乙腈的水溶液。分別使用乙腈、80%乙腈的水溶液、50%乙腈的水溶液將混合標準溶液配制成待測組分的濃度為5 ng/mL的標準液，上機測試，記錄色譜峰的拖尾因子。在使用乙腈、80%乙腈配制的標準液中，甲硝唑與替硝唑色譜峰產生前沿峰，拖尾因子為0.90～0.93；而使用50%乙腈水溶液配制的標準液中，所得物質的色譜峰峰形對稱且尖銳，拖尾因子為1.01～1.03，符合拖尾因子0.95～1.05的要求。待測組分溶于乙腈體系中與流動相極性相差較大，產生溶劑效應，進而使待測組分的峰形受到影響。對此為消除溶劑效應，本方法中使用含50%乙腈的空白基質提取液作為標準溶液的稀釋液。

2.1.3 色譜條件優化

（1）色譜柱選擇。色譜柱在實驗中對于樣品的分離非常重要，為確保待測組分在色譜柱上有較好的保留與分離效果，比較了柱1 SOULAB-SH C1（8150 mm×4.6 mm，3 μm）、柱 2 SOULAB-AM C18（150 mm×3.0 mm，3 μm）、 柱 3 SOULAB-ST C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）3種色譜柱對4個待測組分的分離效果。使用柱1與柱2這兩款色譜柱所需的流動相流量較大，與質譜電噴霧離子化方式不匹配，物質離子化效率較低，所得的質譜響應強度較低。相對于柱1、柱2，使用柱3能使化合物具有更好的分離效果及峰形，小粒徑色譜柱具有高柱效且能節省溶劑，適用于UPLC儀器。綜合考慮物質保留時間、色譜峰峰形與檢測靈敏度，選擇柱3作為本實驗分析柱。

（2）流動相選擇。本文分別比較了使用有機溶劑甲醇、乙腈作為流動相時對所測定的4種化合物分離效果的影響。結果顯示，當使用甲醇作為流動相時，化合物在色譜柱上的保留與分離效果優于乙腈?？紤]到待測組分需要與雜質進一步分離，故選擇甲醇作為該實驗中的有機相。由于4個化合物均采用正模式下的電噴霧離子化，在水中加入一定濃度的酸可以促進化合物的電離。故本研究通過比較在水溶液中加入0.1%～0.5%的甲酸，考察對4個化合物的影響。結果顯示，隨著流動相中甲酸濃度的增大，4種化合物在質譜測定中得到的峰面積略有增大，但基線噪聲也明顯提高。綜合不同濃度的甲酸作為流動相下所測得物質的信噪比與色譜柱pH的耐受性考慮，選擇0.2%甲酸作為水相，化合物的色譜圖見圖1。

圖1 4種化合物色譜圖

2.2 檢出限、定量限與線性關系考察

取S1～S5基質標準工作溶液，按測試條件進行測定，通過儀器測試得到各化合物定量離子的峰面積。以配制的基質標準工作溶液濃度（x）為橫坐標，化合物峰面積（y）為縱坐標，得出回歸方程；通過在空白樣品中加入標準溶液后對樣品進行提取、凈化來進行確認本方法所能達到的檢出限與定量限，使用工作站對信噪比進行計算，當目標峰峰高與基線噪聲的比值≥10，即為定量限；當目標峰峰高與基線噪聲的比值≥3，即得出檢出限。結果表明，4個化合物檢出量在0.2～25.0 μg/kg線性良好，相關系數均大于0.995，檢出限均為0.06 μg/kg，定量限均為0.2 μg/kg。化合物回歸方程與相關系數見表2。

表2 4種化合物回歸方程及相關系數

2.3 回收率實驗

取空白基質樣品進行加標，通過調節標準溶液的加入體積，使添加量達到 0.2 μg/kg、1.0 μg/kg、10.0 μg/kg，每個加標級別進行6份平行加標實驗，并同步進行空白測試，使用基質標準工作曲線對4個待測組分進行定量分析，結果見表3。4個化合物的加標回收率為86.2%～97.0%，相對標準偏差為2.4%～6.5%，均小于10%，表明本方法具有較好的回收率與重現性，可滿足蜂蜜中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑的測定。

表3 4種基質加標回收率結果（n=6）

2.4 樣品的測定

通過購買市場上銷售的蜂蜜樣品共20批次，按建立的方法進行前處理并測試，結果20批樣品中均未檢出塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑。

3 結論

本研究建立了QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS方法測定蜂蜜中塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑，EMR-Lipid凈化劑能有效去除蜂蜜樣品中的糖類，用SOULAB-ST C18色譜柱對塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑進行色譜分離，通過質譜聯用儀的MRM模式進行檢測。方法中使用了空白基質提取液配制標準曲線，相比使用內標物的方法，節省了購買內標物的費用，部分物質的內標物也不容易獲得。該方法具有操作簡單、快速、定性與定量準確、靈敏度高等特點。本方法使用的凈化劑對糖、脂質具有高選擇性，能有效去除樣品基質中的糖分。糖分的去除能提高待測組分在質譜儀上的離子化效率，減少分析過程中的基質干擾，以提高測試結果的穩定性與可靠性，減少了色譜與質譜的維護成本。