高效液相色譜法測定鴨肉中土霉素、四環素、金霉素及強力霉素殘留量的研究

閑少玲

（肇慶市食品檢驗所，廣東肇慶 526000）

四環素類抗生素是一種由放線菌產生的廣譜性抗生素，有良好的殺菌抑菌作用[1]。一些養殖場為追求利益，作為飼料添加劑給禽畜進食，降低禽畜發病率，改善產品質量，長期大量不合理使用四環素類藥物，會導致動物源性產品體內殘留，從而危害人體健康。因此需嚴格監控動物源性食品中四環素類藥物殘留量以維護人體健康。目前，四環素類抗生素殘留量的檢測方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3-5]、液質聯用法[6-7]等多種方法。本次研究采用通過高效液相色譜法對鴨肉中土霉素、四環素、金霉素和強力霉素殘留量進行檢測，并對該方法進行了優化、分析檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素、四環素、金霉素和強力霉素標準品；HLB固相萃取柱；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

安捷倫1260高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器；全自動濃縮儀；電子天平；pH計；高速臺式冷凍離心機；全自動智能氮吹儀；多管漩渦混合器。

1.3 實驗方法

精密稱取粉碎混合5.0 g鴨肉樣品，置于50 mL離心管中，加入20 mL的Mcllvaine緩沖液，渦旋振蕩5 min，低于15 ℃條件下10 000 r/min轉速，離心5 min，移出上清液，在剩余殘渣中分別加入15 mL的Mcllvaine緩沖液重復提取兩次，合并3次上清液，并定容至50 mL，混勻。將提取液用快速濾紙過濾，收集過濾液，準確吸取10 mL濾液，濾液經HLB固相萃取柱凈化，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，35 ℃氮吹近干，用流動相溶解并定容至1 mL，0.45 μm濾膜過濾，濾液供上機測定。

1.3.1 溶液配制

（1）標準儲備液。稱取土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準品各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容100 mL，各抗生素濃度為100 μg/mL，于-18 ℃條件下存儲。

（2）混合標準溶液。用流動相將標準儲備液根據需要配制成適當濃度混合標準液。

（3）Mcllvaine緩沖液。稱取檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉27.6 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，用水溶解后稀釋并定容至1 000 mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18；流動相：A為草酸水溶液（0.01 mol/L），B為乙腈︰甲醇（1︰1）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：365 nm；進樣量：50 μL。流動相梯度洗脫見表1。

表1 流動相梯度洗脫

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

以4種抗生素的峰面積和分離度為指標，選用 Aielent5 TC C18、BIossmate psv C18、Shim-pack Veloxsp C18和Shim-pack GIST C18等不同色譜柱對鴨肉中土霉素、四環素、金霉素和強力霉素的分離效果，見圖1。結果表明，在1.3.2的色譜條件下Shim-pack GIST C18色譜柱，4種抗生素達到較好的分離效果，適合分析各目標物，且各目標物峰形良好。

圖1 樣品加標分離色譜圖

2.2 流動相的選擇

采用Shim-pack GIST C18作為分析色譜柱，分別選用甲醇∶乙腈（1∶1）-0.01 mol/L三氟乙酸，乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉，乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液等流動相作土霉素、四環素、金霉素和強力霉素的分離度及色譜響應效果的選擇。結果表明，采用甲醇∶乙腈（1∶1）-0.01 mol/L三氟乙酸，土霉素、四環素兩者完全不能分離。采用乙腈-0.01 mmol/L磷酸二氫鈉，土霉素、四環素兩者未徹底分離，峰形較扁平，出峰時間滯后。當采用乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液，土霉素、四環素兩者能完全分離，峰形尖銳。因此選擇乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液作為流動相，4種抗生素響應值較好，且經過梯度洗脫后具有更好的分離效果和靈敏度，再改變流動相比例縮短出峰時間。

2.3 提取溶劑的選擇

本實驗采用5%的高氯酸和Mcllvaine緩沖液作為樣品中4種抗生素提取溶劑，通過空白鴨肉加標回收實驗進行提取效果比較，采用Mcllvaine緩沖溶液時效果最好，回收率均高于5%高氯酸提取溶劑回收率。說明Mcllvaine緩沖溶液提取能力較強，因此選擇Mcllvaine緩沖液作為樣品提取溶劑最為合適，再結合與HLB固相萃取柱凈化，有效去除其雜質，回收率、重現性不易被影響。不同pH值提取溶劑對4種抗生素分離度均有一定影響，考慮到四環素類抗生素一般情況在弱酸條件下比較穩定，將Mcllvaine緩沖溶液設為pH值為3.5，可有效分離，且不會影響峰形。

2.4 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器進行測定，選檢測波長在350～365 nm對加標樣品進行檢測，隨著檢測波長增大，峰面積逐漸增大，在365 nm時吸收最大，干擾小，靈敏度高，因此選擇365 nm檢測波長為最佳吸收波長。

2.5 標準曲線與檢出限

在1.3.2的色譜條件下，繪制4種抗生素標準曲線，以3倍信噪比，準確計算檢出限。結果如表2所示。在實驗濃度范圍內，4種抗生素濃度、峰面積具備良好線性關系。

表2 線性參數與檢出限

2.6 加標回收率和精密度

實驗采用空白鴨肉樣品中分別加入4種抗生素混合標準溶液，使樣品溶液最終濃度為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、1.0 μg/mL，每個水平重復測定 6次，計算平均回收率和精密度，結果見表3。土霉素加標回收率為85.7%～89.3%，4環素回收率為83.2%～84.8%，金霉素回收率為92.4%～97.5%，強力霉素回收率為87.0%～90.7%，4種抗生素RSD為0.9%～3.0%，說明本實驗方法準確度高、精密度好。

表3 加標回收率和精密度（n=6）

3 結論

通過此次實驗研究，優化高效液相色譜法色譜條件，改進測定方法，可以更好地分離土霉素、四環素、金霉素和強力霉素，且使用本方法前處理簡單，靈敏度高，分離效果好，準確度高，可以滿足四環素類抗生素檢測要求，值得推廣應用。