香辛料中去甲烏藥堿含量分析

鄭小敏，尤曉惠，王 瑋，王美鋒，向鵬宇

（重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶 408000）

去甲烏藥堿（Higenamine，HG）屬于芐基異喹啉類生物堿，是一種β受體激動劑類藥物，它能夠增加動物心肌收縮力，改善收縮和舒張功能，并具有興奮心肌細胞、刺激β-腎上腺素受體、舒張血管的作用，因此在臨床上可被用作強心劑[1-4]。自2017年起，去甲烏藥堿就被國際反興奮劑組織（World Anti-Doping Agency，WADA）列為S3類（β-2激動劑類）違禁物質[5]。去甲烏藥堿主要存在于細辛、黃柏、地膚子[6]、花椒、胡椒、桂皮[7-8]等天然植物中，這些植物正是中藥材或日常食用香辛料中的組成部分。因此，運動員極有可能在日常飲食中攝入去甲烏藥堿而造成興奮劑檢測陽性檢出。本文通過各大香辛料批發市場、農貿市場、中藥材市場、商超及網絡平臺進行采樣，采用液色譜-串聯質譜法進行不同品種的香辛料中去甲烏藥堿的含量分析[8]。

1 材料與方法

1.1 采樣

以《天然香辛料 分類》（GB/T 21725—2017）為依據制定采樣方案，對重慶市各大香辛料批發市場、中藥材批發市場及網絡平臺進行采樣，共采集花椒、辣椒、白胡椒、桂皮、八角、孜然、多香果、草果、高良姜、月桂葉、丁香、蓽撥、三奈、香茅草、茴香、芫荽、甘草、砂仁、姜黃、白豆蔻、肉豆蔻、香豆蔻、百里香、芝麻、大蒜、白歐芥、調料九里香、香椿、芒果、楊桃、細葉芹、葫蘆巴、留蘭香、迷迭香、香莢蘭、羅晃子、歐芹、菖蒲、甘牛至、石榴、薄荷、辣根、洋蔥、姜、木姜子、小蔥、大蔥、甜羅勒、蒔蘿籽、葛縷子、小豆蔻、芹菜籽、龍蒿、牛至、藏紅花及大清桂56種香辛料。進行樣本分類，每個品種采樣量不少于200 g，每種樣品不少于3批次；并對含有去甲烏藥堿香辛料進行大量采集，覆蓋主要產地。

1.2 儀器與設備

Agilent1290-AB 4500 高效液相色譜聯用儀（美國AB 公司）；XPE204電子分析天平（梅特勒-托利多），VORTEX3渦旋儀（德國IKA公司），SR-2DS強力振蕩器（日本TAITEC公司），Multifuge XIR冷凍離心機（德國ThermoFisher公司），Milli-Q超純水系統（美國 Millipore 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標液配制

準確稱取去甲烏藥堿對照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液；用甲醇逐步稀釋成濃度為1 μg/mL的標準使用液；于-18 ℃冷凍保存。

稱取去甲烏藥堿-D4對照品1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為100 μg/mL的內標標準儲備液；精密吸取甲烏藥堿-D4內標標準儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成1 μg/mL去甲烏藥堿-D4內標標準使用液；于-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品前處理

本實驗采用內標法進行定量分析。樣品粉碎均勻，過60目篩，稱取試樣1.0 g（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入去甲烏藥堿-D4標準使用 液 100 μL（1 μg/mL）， 加 入 19 mL 0.5% 甲 酸 乙醇/水（80+20）溶液，振蕩30 min，8 000 r/min離心5 min；提取液轉移至20 mL比色管中，用5%氨水調節pH值至8.5±0.5，加水定容至20 mL，混勻。

PBA固相萃取小柱依次用3 mL乙腈、3 mL 0.5%甲酸水、3 mL 0.2 mol/L乙酸銨（pH為8.5）活化。取5 mL上述提取溶液，上柱，依次用3 mL 0.2mol/L乙酸銨（pH為8.5）淋洗、3 mL水淋洗；2 mL 0.5%甲酸甲醇洗脫，抽干小柱，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 0.5%甲酸水復溶，0.22 μm濾膜過濾，上機分析。采用液相色譜-串聯質譜法經Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分離，電噴霧正離子掃描，多反應監測模式檢測，同位素內標法定量測定。

1.3.3 儀器條件

（1）液相條件。柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相A：0.1%甲酸乙腈，流動相B：0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（MRM）模式；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；霧化氣壓力（GS1）：55 psi；輔助氣壓力（GS2）：55 psi；氣簾氣壓力（CUR）：35 psi；碰撞氣體（CAD）：Medium；離子源溫度（TEM）：550 ℃。

去甲烏藥堿定量離子對：272.0/107.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：26 V；去甲烏藥堿定性離子對：272.0/255.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：20 V；去甲烏藥堿-D4離子對：276.0/259.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：21 V。

2 結果與分析

2.1 檢出限和定量限的測定

將去甲烏藥堿標準儲備液用甲醇稀釋至一定濃度，再分別取適量于10 mL容量瓶中，分別加入適量去甲烏藥堿-D4內標標準使用液，甲醇稀釋成一定梯度的系列標準溶液按照1.3.3儀器條件進行測定，以去甲烏藥堿的濃度與去甲烏藥堿-D4濃度比值作為橫坐標，以去甲烏藥堿定量離子峰面積與去甲烏藥堿-D4峰面積比值為縱坐標進行回歸分析，去甲烏藥堿濃度在0.25～100.00 ng/mL關系良好，相關系數r大于0.999。當S/N≥3作為方法的檢出限；S/N≥10作為方法的定量限。各品種方法檢出限為1 μg/kg，定量限為 3 μg/kg。

2.2 精密度實驗

根據香辛料的使用部位不同，將香辛料分為葉類、果實類、根莖類及花類等，選取甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香及芹菜籽等7種有代表性的不同類型樣品進行精密度實驗，并分別添加3個不同濃度的標準溶液，每個加標水平設置6個平行樣，以考察方法的精密度和回收率，以試劑溶液配制標準曲線，內標法定量。如表2所示，平均回收率范圍為92.8%～108.2%，相對標準偏差范圍為1.9%～5.6%。

表2 8個不同品種的平均加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.3 檢測結果

由檢測結果可知，花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子等6種香辛料中檢出了去甲烏藥堿，其中，木姜子和月桂葉中去甲烏藥堿含量偏高，見表3。

表3 6種香辛料中去甲烏藥堿含量范圍（單位：μg/kg）

2.4 花椒中去甲烏藥堿的含量分析

本研究中檢出去甲烏藥堿的其他5個品種產地比較集中，且產量少；而花椒是生活中最常見的食物，是我國主要香辛料之一，也是我國優勢特色農產品，產量大，使用范圍廣，在我國大部分地區都有種植，因此本研究對陜西、四川、重慶、云南和甘肅產地花椒進行采樣，共采集樣品52批次，分析結果見表4。

表4 同一品種不同產地香辛料中去甲烏藥堿含量范圍（單位：μg/kg）

各產區主產品種分別是四川（紅花椒）、陜西（紅花椒）、重慶（青花椒）、云南（青花椒）。通過Excel分別對去甲烏藥堿含量進行t檢驗分析，結果表明，青花椒和紅花椒中去甲烏藥堿的含量具有顯著性差異，紅花椒中去甲烏藥堿的含量明顯高于青花椒。

3 討論

對56種香辛料中去甲烏藥堿進行篩查，其花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子6種香辛料中檢出去甲烏藥堿，月桂葉和木姜子中含量較高。其中桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子在我國的產地相對比較集中。而花椒作為主要的香辛料之一，在我國被廣泛種植，各產區主產品種又各不相同，通過采樣分析，紅花椒的含量明顯高于青花椒。

香辛料中去甲烏藥堿的篩查和含量測定，對56種香辛料中去甲烏藥堿含量有了一個初步了解，本次分析主要針對重慶市各大香辛料批發市場、農貿市場、中藥材市場、商超及網絡平臺進行采樣，對香辛料進行摸底，采用液相色譜串聯質譜法檢測，內標法定量分析測定。其中，6種常用香辛料中檢出去甲烏藥堿，其余均未檢出，提示運動員和心血管患者需特別慎用。