刺梨葉提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

劉 丹，丁小艷

（1.貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽 550004；2.貴州省材料產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，貴州貴陽 550016）

實驗中所用刺梨葉，被2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》收錄，是藥食同源植物，在貴州省等地分布較為廣泛，目前在貴州多地有種植基地，為貴州的優(yōu)勢經(jīng)濟作物[1-3]。近年來，刺梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展得到了貴州省委、省政府的高度重視，大力支持相關(guān)的科學(xué)研究。

刺梨葉中的成分對自由基有清除作用。刺梨中的多酚類、黃酮類成分，已被研究證明具有很好的抗氧化作用[4-6]。在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)刺梨葉有α-葡萄糖苷酶抑制活性，對2型糖尿病大鼠脂代謝也起一定的治療作用[7-11]，這都與刺梨葉的抗氧化機制相關(guān)，說明刺梨葉中的抗氧化活性物質(zhì)值得被深入研究，可制成茶葉等飲品，具有廣闊的食品、保健食品應(yīng)用前景。本實驗優(yōu)化刺梨葉活性成分提取工藝，再比較刺梨葉不同極性部位提取物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨葉樣品為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的干燥葉；Folin-Ciocalteu試劑（F-C試劑，自制）；沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201204）；蘆丁對照品（成都曼斯特生物有限公司，批號MUST-11040302）；水為去離子水；試劑均為分析純。

CARY100-Bio紫外-可見分光光度計（美國瓦里安中國有限公司）；DY-H4-型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；KQ-500DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ACCULAB型萬分之一電子天平（深圳市郎普電子科技有限公司）；高速中藥粉碎機（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；高效液相色譜儀（美國沃特世中國有限公司）；ALC-210.4電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；GZX-GFC-101-2-BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）；80-2臺式低速離心機（上海醫(yī)療器械集團有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液制備

（1）提取工藝優(yōu)化供試品溶液制備。刺梨葉干燥后粉碎，過篩，得刺梨葉供試品。稱取適量刺梨葉供試品，加入10倍量的石油醚浸泡達24 h脫色后，過濾，用石油醚洗滌，干燥后稱取1 g樣品于50 mL錐形瓶中，精密稱定，設(shè)置60%乙醇超聲提取，3 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋后待測。

（2）對照品溶液制備。①蘆丁標準溶液的配制。準確稱取蘆丁對照品116.84 mg置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋并定容至刻度，制得2.29 mg/mL對照品儲備液。精密吸取2.5 mL對照品儲備液于25 mL容量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，制得229.0 μg/mL蘆丁標準液[12]。②沒食子酸標準溶液配制。精密稱取沒食子酸對照品50.0 mg于50 mL容量瓶中，去離子水溶解定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為0.899 mg/mL沒食子酸儲備液。精密吸取該儲備液5 mL于50 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度，制得89.9 μg/mL的沒食子酸標準溶液[13]。

（3）抗氧化活性比較供試液制備。精密稱取1.2.1項下脫色并干燥后的刺梨粉20 g，60%乙醇溶液，料液比1∶10（g∶mL），超聲提取60 min，提取2次，過濾。精密吸取濾液50 mL，為醇層，其他濾液減壓蒸發(fā)回收乙醇，剩余水溶液分別采用極性增大的乙酸乙酯和水飽和正丁醇依次萃取，最后為水相部位。

1.2.2 正交實驗

根據(jù)前期的單因素實驗，各條件最佳點為液料比25∶1，超聲時間30 min，乙醇濃度60%。以各最佳點為中心設(shè)計正交實驗。以目標函數(shù)確定達到總黃酮和總多酚的最佳提取條件，選擇加權(quán)綜合評分法，以總黃酮和總多酚各占50%來確定最佳提取工藝[14]，因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.2.3 總抗氧化力和DPPH自由基清除率測定

（1）總抗氧化力測定。精密稱取不同極性部位提取物于25 mL容量瓶中，制成濃度為2.6 mg/mL的樣品液，將樣品液稀釋10倍，則制得待測液。分別加入待測液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL和4.5 mL于10 mL具塞試管中（空白不加樣液，以同體積超純水代替），加超純水至體積為1.5 mL，加 入0.6 mol/L的H2SO4溶 液1 mL，28 mmol/L的Na3PO4溶液1.5 mL，4 mmol/L的鉬酸銨溶液1.5 mL，再加超純水至總體積為10 mL，搖勻后置于95 ℃恒溫水浴中1.5 h，取出，冷至室溫，在695 nm波長處測定吸光度。每個樣品平行3次實驗。

（2）DPPH自由基清除率測定。將上述總抗氧化力測定中制成的樣品液稀釋100倍則制得待測液，分別取0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.6 mL、1.9 mL和2.2 mL待測液，加超純水至4 mL，再加0.25 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL，置暗箱中反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度。對照不加供試液。每個樣品平行3次實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實驗優(yōu)化

由表2可知，極差分析結(jié)果顯示，提取條件中對測定結(jié)果影響程度由大到小的順序為乙醇濃度、料液比、超聲時間；由k值得，最優(yōu)組合為A1B3C2，得分為664.20分，低于正交實驗表中的最佳組合A3B3C2（684.89分）。因此當(dāng)料液比1∶30、超聲時間60 min，乙醇濃度60%時，綜合評分最高，提取工藝最佳。

表2 正交實驗結(jié)果

2.2 刺梨葉不同極性部位抗氧化力比較

由表3可知，刺梨葉不同部位的抗氧化能力大小均為水飽和正丁醇層>乙酸乙酯層>醇層>水層。

表3 不同部位抗氧化能力測定

3 結(jié)論

刺梨葉的藥理活性與其抗氧化機制有關(guān)，可開發(fā)相關(guān)的保健食品。實驗前期研究中發(fā)現(xiàn)刺梨葉有很高的抗氧化活性，對刺梨葉的各個極性部位提取物的抗氧化活性進行對比，發(fā)現(xiàn)刺梨葉中起抗氧化作用的物質(zhì)主要在正丁醇層，其次乙酸乙酯層，研究結(jié)果表明有必要對抗氧化能力強的極性部位進行深入研究。