磁性納米顆粒在小鼠巨噬細胞體外MRI中的應用

宋江，戈銳，朱凱，孫杰，宋美娜，趙薇，馬宏寧，王志軍*

作者單位：1.寧夏醫科大學總醫院放射科，銀川 750004；2.寧夏回族自治區人民醫院中心實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫科大學基礎醫學院，銀川 750004

巨噬細胞趨化是其發揮吞噬功能的前提[1]，在腫瘤免疫耐受的進程中，腫瘤細胞常常通過控制遷移來“馴化”巨噬細胞實現免疫逃逸[2-3]。細胞標記技術是了解細胞在體內遷移路徑的重要手段[4-5]。超微超順磁性氧化鐵納米顆粒(ultra-micro superparamagnetic iron oxide nanoparticle，USPIO)作為小分子(直徑5～40 nm)的磁性納米顆粒，因具有良好的生物相容性及多能性，被越來越多地應用于細胞標記[6-7]。高濃度的USPIO 有助于優質細胞MRI 圖像的獲取，然而研究表明，USPIO 對細胞也具有一定的毒性作用[8-9]。Ohki等[10]使用USPIO 標記臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)，發現標記濃度為100 μg/mL 時細胞的增殖能力顯著降低。然而對于巨噬細胞RAW264.7 的USPIO 標記濃度的研究目前尚無相關文獻報道，因此在開展巨噬細胞活體示蹤前，有必要優化USPIO的標記濃度。本實驗檢測了既能獲得較好MRI 圖像又能使巨噬細胞毒性作用最小的最佳USPIO標記濃度，也探討了不同MRI 成像序列檢測USPIO 標記細胞的信號變化的敏感度，為進一步開展基于USPIO標記的細胞活體示蹤提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫，高糖DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)購自以色列BI 公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco 公司，USPIO (粒徑5 nm，貨號：725331)購自美國Sigma-Aldrich 公司，CCK-8 試劑盒購自江蘇凱基生物公司，普魯士藍染液購自北京雷根生物公司，酶標儀購自美國Bio-Rad 公司，正倒置一體熒光顯微鏡購自美國Echo-labs公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

小鼠巨噬細胞株RAW264.7 用含10% FBS 的DMEM培養液常規培養，待細胞覆蓋率至80%～90%時傳代。

1.2.2 細胞存活率與IC50計算

制備細胞懸液，按每孔103個細胞接種于96 孔板，每孔加入100 μL 培養液，次日各孔加入USPIO 至終濃度分別為25、50、75、100、125 μg/mL，以0 μg/mL孔作為對照組，培養基-無細胞組作為空白對照，各組設3 個復孔，常規培養24 h。按CCK-8 試劑盒說明，加入CCK-8液，37 ℃孵育1 h，用酶標儀測定波長為450 nm 處細胞的吸光度(absorbance，OD)，計算細胞存活率及IC50。細胞存活率=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%。IC50即細胞存活率為50%時對應的USPIO濃度。

1.2.3 細胞吞噬效果評價

對USPIO 終濃度為0 μg/mL 與25 μg/mL 的細胞按試劑盒說明分別行普魯士藍染色。根據是否出現藍染細胞(含有Fe3+的細胞被染成藍色，而正常細胞被普魯士藍染液染成紅色)及藍染細胞的比例評價細胞吞噬效果。

1.2.4 細胞MRI體外成像

將巨噬細胞消化后計數，按每孔105個細胞接種于6 孔板，并加入2 mL 培養液，次日加入USPIO 至終濃度分別為0、25、50、75、100、125 μg/mL，繼續培養24 h。消化收集細胞，每孔取106個細胞，固定于含2 mL 煮沸的1%瓊脂糖凝膠的EP 管中混勻，待凝固后行MRI掃描。

1.3 MRI設備與掃描參數

使用美國GE公司SIGNA HDxt 3.0 T超導MR掃描儀和48通道AIR頭部線圈行冠狀位掃描。掃描序列為Magic 序列，層厚5 mm，層間距0.2 mm，矩陣320×320，FOV 24 mm×24mm；T1WI：TR 500 ms，TE 10 ms；T2WI：TR 4500 ms，TE 100 ms。掃描完成后，由一名經驗豐富的高年資主任技師以盲法使用MAGIC軟件在獲得的圖像上分別沿各管內徑勾畫感興趣區，每個掃描序列選取3個層面分別測量弛豫時間與弛豫率，最終數據取平均值，重復測量3次。計算弛豫時間降低率=(對照組弛豫時間-實驗組弛豫時間)/對照組弛豫時間×100%評價不同掃描序列的敏感度。

1.4 統計學方法

使用SPSS 23.0軟件進行統計分析，測得的數據計量資料用±s 表示。不同USPIO 濃度下細胞存活率、弛豫時間變化分別與對照組的比較采用Dunnett-t檢驗；相同USPIO濃度下,弛豫時間降低率的比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RAW267.4細胞存活率與USPIO濃度反相關

與對照組相比，當USPIO 濃度≥50 μg/mL 時，RAW264.7 細胞CCK-8 檢測的吸光度值隨USPIO 濃度增加而顯著減低，提示細胞存活率與USPIO濃度反相關，差異有統計學意義(P均＜0.01) (表1，圖1)。USPIO 對巨噬細胞的IC50為(186.5±7.2) μg/mL，提示細胞在低于該濃度范圍的USPIO中耐受性較好。

表1 不同濃度USPIO作用下細胞的吸光度變化(n=3)Tab.1 Absorbance changes of cells under the action of different concentrations of USPIO(n=3)

2.2 50 μg/mL的USPIO可引起細胞形態學改變

與對照組相比，光學顯微鏡下觀察發現，當USPIO 濃度為25 μg/mL 時，細胞形態無明顯改變；而當USPIO 濃度≥50 μg/mL 時，細胞明顯皺縮、透光度減低(圖2)。表明USPIO 濃度≥50 μg/mL 時，對細胞即有毒性作用。

圖2 不同濃度USPIO對細胞形態學的影響(×100)。 圖3 普魯士藍染色鑒定細胞對USPIO的吞噬作用(×100)。Fig.2 Effect of USPIO with different concentrations on cell morphology(×100).Fig.3 Identification of USPIO uptake by cells RAW264.7 using Prussian blue staining(×100).

2.3 細胞對USPIO的吞噬作用鑒定

與對照組相比，USPIO 濃度為25 μg/mL 時光鏡下可見大量藍染細胞，即普魯士藍染色陽性(圖3)。提示細胞在USPIO 濃度為25 μg/ml 時仍具有強大的吞噬能力。

2.4 T2序列更適用于基于USPIO的細胞MRI

3.0 T MRI 顯示，USPIO 濃度為25 μg/mL 時，細胞即見顯著T1 高信號與T2 低信號；USPIO 濃度越高，信號改變越顯著(圖4)；隨USPIO 濃度增加，T1 和T2 弛豫時間均明顯縮短(P均＜0.01) (表2)，對應弛豫率R1 和R2 均呈逐漸上升趨勢(圖5)。在相同USPIO 濃度下，T2 弛豫時間降低率明顯高于T1 弛豫時間變化率(P均＜0.001) (圖6)，提示T2WI序列對基于USPIO的細胞MRI更敏感。

表2 不同USPIO濃度下弛豫時間變化(n=3)Tab.2 Changes in relaxation time at different concentrations of USPIO(n=3)

圖4 不同USPIO 濃度(μg/mL)下細胞MRI 掃描成像。 圖5 MRI 掃描T1 和T2 序列弛豫率比較。 圖6 MRI 掃描T1 和T2 序列弛豫時間變化率比較(***：P＜0.001)。Fig. 4 MRI imaging of cells treated with different concentrations (μg/mL) of USPIO. Fig. 5 Comparison of relaxation rates between T1 and T2 of MRI.Fig.6 Comparison of the change rates of relaxation time(***:P＜0.001).

3 討論

本研究首先觀察了USPIO 濃度對細胞存活率與形態的影響，證實了25 μg/mL 為USPIO 標記小鼠巨噬細胞的安全濃度。普魯士藍染色顯示該安全濃度下細胞仍能夠吞噬大量的USPIO 顆粒，且細胞體外MRI掃描可見顯著信號。鑒于高濃度USPIO對細胞的毒性作用，因此確定USPIO 標記巨噬細胞行MRI 的最佳濃度為25 μg/mL。同時本研究首次采用弛豫時間的變化率來評價MRI 掃描不同序列的敏感度，證實T2WI 序列對USPIO 信號檢測的敏感度高于T1WI。不同細胞類型對磁性納米顆粒的攝取能力和毒性反應濃度均不相同[10-11]。本研究首次從成像效果和細胞活性兩方面評價了USPIO標記巨噬細胞的最佳濃度，研究說明開展磁性顆粒標記的細胞示蹤研究時，不應為追求高質量MRI 圖像而忽略了標記物對細胞的毒性作用。上述結果為后續利用MRI 實時監測巨噬細胞的體內趨化軌跡和評價其免疫活性提供了重要的實驗參考。

3.1 USPIO標記小鼠巨噬細胞毒性作用探討

巨噬細胞作為造血系統中可塑性最強的細胞類型，廣泛存在于各種組織器官中，參與了發育、穩態維持、組織修復和免疫防御等過程[12-13]。在免疫防御過程中，巨噬細胞作為體內重要的抗原呈遞細胞，能夠趨化、識別和吞噬“非己”物質，如病原體和腫瘤細胞等，將其加工為特異性抗原，呈遞給T淋巴細胞，誘導活化[14-15]。然而大量研究發現，部分腫瘤細胞或病原體能夠“馴化”巨噬細胞，抑制其遷移和吞噬成功實現免疫逃逸[2-3]。因此，監測吞噬細胞的遷移路徑及趨化方向對于評價巨噬細胞的活性具有重要的意義。

USPIO對細胞毒性作用受到細胞類型、USPIO標記濃度和標記時間等多方面因素的影響[16]。和其他類型的細胞相比，巨噬細胞因具有卓越的吞噬能力[17]，因而對生物標記物的毒性反應更敏感。應用USPIO標記巨噬細胞時，在評價其成像效果時，必須兼顧其細胞毒性作用。以往文獻大多通過臺盼藍染色評價損傷細胞比例或基于四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)的細胞增殖實驗通過IC50評價藥物的細胞毒性作用[18-20]。前者的結果易受鏡下視野的選擇和染色劑作用時間等因素的影響，而后者得出的安全濃度遠高于實際安全濃度。本研究計算出的USPIO 對巨噬細胞的IC50為186.5 μg/mL，理論上最大的用藥濃度不得超過1/2 IC50(93 μg/mL)。而光學顯微鏡下可見USPIO 濃度高于25 μg/mL 時，細胞即出現明顯皺縮、透光度減低等毒性作用征象。因此，本研究顯示，制備有活性的磁性顆粒標記細胞必須同時兼顧IC50和細胞形態學檢測。

25 μg/mL 是目前文獻報道中USPIO 標記細胞的較低濃度[10]。然而鑒于巨噬細胞強大的吞噬能力[17]，普魯士染色法顯示該USPIO濃度下細胞中可見大量的藍染顆粒，說明低濃度依然可以保證足夠的USPIO進入巨噬細胞，提示USPIO標記巨噬細胞模型制備成功。

3.2 USPIO標記巨噬細胞MRI效果評價

近年來活細胞體內示蹤這一分子影像學的熱點內容被廣泛應用于細胞趨化路徑的觀察和評價[21]，既往文獻對于細胞示蹤的研究大多是基于光學成像中的熒光蛋白、熒光染料等標記的體外成像[22-23]，存在著熒光穿透能力弱、特異性低、半衰期短等不足[24]，難以實現長時間動態觀察。巨噬細胞作為體內的清道夫細胞[25]，憑借其強大的吞噬和消化能力，熒光蛋白或染料被吞噬后極易發生降解而使信號衰減[24]，因此對其進行示蹤較為困難。磁性納米顆粒USPIO 為納米級的高分子材料，具有很好的生物相容性、半衰期長和可被機體降解吸收等優點，作為MRI 細胞示蹤劑具有很好的應用前景[6-7]。因此本研究首次利用MRI 技術對USPIO 標記的巨噬細胞進行成像觀察，結果顯示細胞均呈現短T1 短T2 信號，定量檢測也證實USPIO 能顯著縮短T1、T2 弛豫時間，升高弛豫率R1、R2，該結果也與已報道文獻相符[6-7]。雖然隨著USPIO 濃度逐漸升高，MRI 信號變化也越顯著，但是絕大部分研究僅限于原位觀察，未進行標記細胞活性評價，因此限制了這項技術的進一步應用。我們的研究發現，即使用較低濃度(25 μg/mL)的USPIO 標記，巨噬細胞也可出現顯著的信號改變，因此不應為追求標記效果而一味地選擇高濃度標記，細胞一旦損傷反而會影響后續體內細胞功能的觀察[26]。

USPIO 作為MRI 陰性對比劑[27]能顯著縮短T1 與T2弛豫時間，多數文獻直接研究了T2WI序列的圖像，而未給出T1WI 序列圖像[28-29]，二者對于USPIO 檢測MRI 信號變化敏感度高低尚未報道，因此本研究首次通過比較T1 與T2 弛豫時間降低率高低來間接判斷二者對于檢測USPIO 信號變化的敏感度，結果顯示T2 弛豫時間降低率均明顯高于T1 弛豫時間降低率。說明T2WI 序列在檢測USPIO 標記細胞后信號變化的敏感度優于T1WI序列。

3.3 本研究不足之處

(1)本研究只討論了24 h 后的USPIO 對巨噬細胞毒性作用，對于更長時間下的毒性作用變化尚需進一步驗證；(2)本研究旨在探討USPIO 標記巨噬細胞體外成像規律，尚未應用該細胞行活體內示蹤研究。今后將側重于USPIO 標記巨噬細胞細胞的活體內成像的研究。

綜上所述，本研究結果確定了USPIO標記小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞行MRI的最佳濃度為25 μg/mL；MRI 在檢測USPIO 標記細胞后信號變化的敏感度上T2WI序列優于T1WI序列。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。