利多卡因預處理減輕阿霉素引起的小鼠急性心肌損傷的效果及機制研究

劉海波，劉岳鵬，朱 霞，劉文濤，程 月，何學明*

(1.蚌埠醫學院附屬連云港東方醫院老年科，江蘇 連云港 222042;2.蚌埠醫學院附屬連云港東方醫院轉化醫學中心，江蘇 連云港 222042；3.南京醫科大學藥理學實驗室，江蘇 南京 211100；4.南京醫科大學康達學院，江蘇 連云港 222000)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種臨床上常用的化療藥物，對于多種癌癥(如肺癌、乳腺癌等)有比較好的療效，但其心臟毒性嚴重限制了其在臨床上的應用。DOX心損傷的機制不明，目前最流行的假說是氧化應激假說[1]。然而，已經有研究者提出，氧化應激可能不是DOX引起的心臟損傷的核心，因為鐵螯合劑，如右丙亞胺，應該可以減少氧化應激，但有研究表明其治療效果仍存在爭議[2]。此外DOX可引起心臟傳導異常，導致心律失常。目前機制尚不明確。心律失常的兩個分支，包括心臟起搏和傳導的異常，這可能在阿霉素誘導的心臟病中同時存在。在DOX心肌損傷小鼠模型中，引起的急性心臟毒性表現為異常傳導，包括心動過緩、QT間期延長[3]。磷酸化縫隙連接蛋白43(phosphorylated connexin 43，p-Cx43)是完整的膜蛋白，在心肌細胞間形成間隙連接，介導相鄰細胞之間的信息和物質交換，心臟動作電位的傳播和規則搏動節律的維持是由縫隙連接參與介導的[4]。目前已有研究表明在阿霉素心臟毒性模型中p-Cx43明顯升高，這將導致其構象改變，并隨之產生電和化學解偶聯，使細胞間的縫隙連接通訊中斷，并最終引起心率及心功能異常[5]。此外炎癥反應也參與在阿霉素心肌損傷，近期文獻報道在阿霉素心肌損傷模型中白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子明顯升高[6]。因此，調節Cx43磷酸化水平以及減輕炎癥反應可能是改善DOX引起的傳導異常及心臟損傷的潛在策略。利多卡因(lidocaine，LIDO)是一種臨床上常用的局部麻醉藥，對心臟缺血再灌注損傷具有保護作用[7]，本研究的預實驗發現LIDO具有保護DOX引起的心臟損傷的作用。本實驗首先觀察LIDO預處理對DOX引起的心臟毒性的影響，進而通過觀察心肌組織中磷酸化磷酸腺苷活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine phosphate activated protein kinase，p-AMPK)以及p-Cx43在DOX導致的小鼠心肌損傷模型中的變化及LIDO對其影響，來探究LIDO保護心肌損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 體重 20～23 g，6 周齡，雄性，SPF 級 ICR 小鼠，購買自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。小鼠可以自由獲取食物和水，環境溫度21～25 ℃，相對適度50%～60%，每籠 5～6只，下有柔軟的墊層。實驗中小鼠飼養及取材均符合相關規定。30 只小鼠隨機分為3組(n=10)，分別為對照組、DOX 組、DOX+LIDO 組。

1.2主要試劑和儀器 鹽酸多柔比星(即DOX)購自深圳萬樂藥業有限公司(生產批號1912E1)，LIDO購自湖北天藥藥業股份有限公司(生產批號D32001021)，p-AMPK 抗體購自Abcam公司，p-Cx43抗體購自CST公司，酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Western 一抗稀釋液購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號 P0023A)Western 二抗稀釋液購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號P0023D)小鼠cTn-T檢測試劑盒購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司公司(貨號H149-4)，小動物心電圖機購自成都泰盟軟件有限公司(型號 BL-420S)。

1.3模型建立 30只小鼠隨機分為3組，每組10只，分別為對照組(單次腹腔注射生理鹽水1 mL/100 g)、DOX組(單次腹腔注射 DOX 10 mg/kg建立模型)、DOX+LIDO組(尾靜脈注射 LIDO 6 mg/kg，間隔30 min后腹腔注射DOX 10 mg/kg，然后每24 h尾靜脈注射一次LIDO，連續7 d)LIDO給藥劑量參照文獻[8]。每天觀測小鼠體重及病死率并記錄。

1.4心電圖檢測 分別于小鼠注射DOX前2 h和注射后7 d用氣麻機麻醉小鼠(麻藥是七氟烷)后進行心電圖心率分析。將電極置于右后肢、右前肢和左后肢的皮膚下，使用小動物心電圖機器記錄結果，待小鼠心率穩定后開始記錄，每次記錄的持續時間至少為2 min。

1.5心肌細胞損傷評估 7 d提取小鼠中血液樣本，制備成血漿并儲存在 80 ℃下以供進一步分析。按照使用說明書分別準備試劑、樣品和標準品，加入準備好的樣品和標準品及生物素抗原，37 ℃孵育30 min，洗滌5次；再加入親和素繼續孵育30 min，最后洗滌加入顯色液及中止液并于10 min之內讀取OD值。制作標曲計算出cTn-T值。

1.6ELISA試劑盒 檢測血漿IL-1β、IL-6、TNF-α分泌量7 d提取小鼠血液樣本并制備成血漿待用。按照ELISA試劑盒說明書完成檢測步驟。最終通過標曲計算出血漿IL-1β、IL-6、TNF-α分泌量。

1.7Western blot 法 測定心肌組織中蛋白的表達7 d提取樣品(心臟組織)在放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitationassay，RIPA)裂解緩沖液中進行裂解。蛋白質濃度由 BCA 蛋白質測定法測定。裝載蛋白質并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后在電泳轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上。膜在室溫下用 5%牛血清白蛋白封閉 2 h，在 4 ℃下用一級抗體孵育過夜，洗滌3次每次10 min，使用的主要抗體包括p-AMPK(1∶1 000)、p-Cx43(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)；然后用辣根過氧化物酶偶聯的二級抗體孵育。洗膜3次，加增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色，并進行圖像采集。用ImageJ軟件對進行灰度分析并統計。

1.8統計學方法 應用SPSS25.0軟件處理數據。計量資料采用單因素方差分析、Tukey法和重復測量方差分析；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠體重及存活率比較 三組小鼠7 d內體重的差異。DOX組和DOX+LIDO組較對照組體重均呈逐漸降低趨勢，但是DOX組降低的更多，組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.01)，接受不同的處理措施的小鼠在體重上存在差異。采用Tukey校正的兩兩比較中，DOX組小鼠體重比對照組小鼠體重低4.50 g，差異有統計學意義(t=8.066,P<0.01)；DOX+LIDO組小鼠體重比DOX組小鼠體重高1.50 g，差異有統計學意義(t=2.689,P=0.050)，見表1。造模后7 d，DOX 組死亡5只小鼠，DOX+LIDO 組死亡1只，對照組無死亡。LIDO 預處理后小鼠體重及存活率顯著改善(P<0.01)，見表 2。

表1 造模后7 d時各組小鼠體重

表2 造模后7 d各組小鼠存活情況

2.2造模后7 d各組小鼠心率比較 心電圖顯示 DOX 降低了小鼠的心功能，表現為心率明顯減慢，與對照組相比DOX組心率降低(P<0.01)；而用 LIDO 預處理有效地防止了 DOX 誘導的心率減慢，與DOX組相比心率增加(P<0.01)，見圖1，表 3。

圖1 各組小鼠典型心電圖比較

表3 造模后7 d小鼠心率比較

2.3各組小鼠cTn-T變化血漿 cTn-T結果顯示 DOX 明顯損害小鼠心肌細胞，與對照組相比DOX組cTn-T明顯增高(P<0.01)；而用 LIDO 預處理有效地防止了 DOX 誘導的心肌損害，與DOX組相比血漿cTn-T降低(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠cTn-T變化

2.4各組小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α變化血漿 IL-1β、IL-6、TNF-α結果顯示 DOX 明顯增加小鼠血漿中炎癥因子分泌，與對照組相比DOX組IL-1β、IL-6、TNF-α明顯增高(P<0.01)；而用 LIDO 預處理有效地防止了 DOX 誘導的炎癥因子升高，與DOX組相比血漿IL-1β、IL-6、TNF-α降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α變化

2.5心肌組織中p-AMPK和p-Cx43表達水平比較 DOX組p-AMPK表達量明顯較其他組明顯降低(P<0.01)而LIDO預處理后明顯升高(P<0.05)而p-Cx43表達量較對照組明顯增高(P<0.05)，LIDO預處理后明顯降低(P<0.05)，見圖2，表6。

圖2 各組心肌組織中p-AMPK、p-Cx43表達水平

表6 各組小鼠心肌組織中p-AMPK、p-Cx43表達水平比較

3 討 論

在目前癌癥的臨床治療中，盡管各組靶向藥物已經廣泛應用，但化療仍占有重要地位。蒽環類化療藥物是一類重要的化療藥物，DOX是其中的代表藥物。是治療各種成人和兒童癌癥(乳腺癌、霍奇金病、淋巴母細胞白血病)的最有效藥物之一。然而，其嚴重的心臟毒性(如心律失常、充血性心力衰竭)嚴重限制其使用[9]。目前臨床上對于DOX心臟毒性仍沒有較好的藥物預防或者治療[10]，因此臨床上亟需一種藥物來預防或者治療DOX的心臟毒性。本研究首次報道了LIDO預處理可以預防DOX心臟毒性，為臨床化療過程中預防DOX心臟毒性提供了參考。

LIDO預處理可以預防DOX引起的心臟毒性。LIDO是一種臨床上常用的麻醉劑，有研究表明在心肌缺血和再灌注的動物模型中，利多卡因可以減少心肌梗死面積和肌鈣蛋白的釋放[11]。另一項研究報道利多卡因在缺血再灌注損傷模型中可以減少心肌細胞凋亡從而改善心肌功能[7]。此外，在本研究顯示LIDO預處理顯著提高了小鼠的存活率和體重，降低了血漿cTn-T、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及緩解小鼠緩慢性心律失常，表明LIDO能夠減輕DOX引起的心臟毒性。

LIDO預處理減輕DOX引起的心臟毒性的機制還不清楚。有報道提示DOX小鼠損傷模型中AMPK的活性被抑制[12]，而二甲雙胍激活AMPK已被證實對 DOX 心臟毒損傷具有保護作用[13]。最近研究證實 LIDO 可以激活AMPK對炎癥起到保護作用[14]。此外還有研究表明LIDO可以降低TNF-α等炎癥因子水平達到改善炎癥目的[8]。基于這些結果，認為LIDO減輕DOX心臟損傷的機制可能是LIDO預處理抑制了DOX對AMPK活性的抑制。作為證據支持，本實驗發現LIDO+DOX組的AMPK的活性高于DOX組。另外，Cx43是縫隙連接通道主要成分，縫隙連接是心臟細胞間直接電和分子信號傳輸的基礎，可確保同步心肌收縮[4]。縫隙連接的作用依賴于Cx43的磷酸化狀態，連接蛋白磷酸化是蛋白激酶和磷酸酶之間的相互作用，但確切的途徑尚不清楚[15]。刺激Cx43磷酸化可降低心肌細胞縫隙連接通透性，Cx43磷酸化改變也可能導致心力衰竭、傳導速度減慢和心律失常的縫隙連接功能障礙[3]。研究表明DOX化療可導致p-Cx43的上調，被認為是DOX引起心臟毒性的關鍵因素之一[16]。而DOX心肌損傷過程與高度保守的細胞內AMPK蛋白有關[12]。本實驗中觀察到，DOX可以引起p-Cx43表達的上調，而LIDO預處理可以減少p-Cx43表達的上調，提示抑制p-Cx43表達可能是LIDO預處理減輕DOX心臟毒性機制中重要的環節之一。此外DOX化療導致IL-1β、IL-6、TNF-α增加，已有研究表明炎癥因子參與心肌細胞的凋亡等反應，降低炎癥因子水平有助于改善心肌功能[17]。而LIDO預處理有效降低了血漿IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量，提示降低炎癥因子水平可能是LIDO改善心肌損傷的另一個重要環節。在人體內，靜脈注射利多卡因的常見不良反應包括低血壓和血管擴張，這兩種情況在腫瘤患者中都值得關注，雖然有證據表明低劑量利多卡因已被證明對無嚴重心臟病的患者是安全的[18]，但臨床上對于LIDO預處理方面的研究較少，仍需要近一步探究。

預處理可以改善DOX誘導的緩慢性心律失常等心臟毒性，其機制可能是LIDO預處理減輕了DOX對AMPK活性的抑制，進而減輕了DOX引起的 p-Cx43上調及降低IL-1β、IL-6、TNF-α來減輕DOX誘導的心臟毒性，所以，在應用DOX治療腫瘤之前進行LIDO預處理可能是一種有效緩解DOX心臟毒性的方法，但這種新的治療策略在臨床上的潛在價值有待進一步分析。