復方板藍根顆粒HPLC指紋圖譜研究

陳 丹 戚建中 符國成 陳海剛 楊一棟 李 柯

1.湘潭醫衛職業技術學院，湖南 湘潭 411102；2.華潤三九(郴州)制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410013

復方板藍根顆粒由板藍根600 g、大青葉900 g組成，具有清熱解毒、涼血的功效，臨床用于溫病發熱、出斑、風熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎、肝炎、腮腺炎，使用廣泛，療效明確。經國家食品藥品監督管理局網站查證，全國共有150家生產企業。復方板藍根顆粒質量標準收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑第十二冊(標準號：WS3-B-2377-97[1])。依據2011年《已上市中藥變更研究技術指導原則(一)》、2017年《已上市中藥生產工藝變更研究技術指導原則》、2019年《已上市中藥藥學變更研究技術指導原則》(征求意見稿)等技術指導原則，本品變更了藥品處方中已有藥用要求的輔料，改變了影響藥品質量的生產工藝，為更系統、全面地評價工藝變更后產品的質量，研究建立了本品指紋圖譜檢測方法[2-3]，采用2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統對10批成品進行相似度評價，所建立的方法穩定、可靠、重復性好，能夠更好地控制復方板藍根顆粒的質量。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；梅特勒-托利多XS204電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)；KQ5200DA 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 鳥苷對照品(111977-201501，含量93.6%)，尿苷對照品(110887-201803，含量99.5%)，腺苷對照品(110879-200202，含量100%)，R,S-告依春對照品(111753-201706，含量100%)均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，色譜級]；其他試劑均為分析級。

1.3 樣品 復方板藍根顆粒[批號：1908001、1908002、1908003、1908004、1908005、1908006、1908007、1908008、1908009、19080010，華潤三九(郴州)制藥有限公司]。

2 方法與結果[4-8]

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫(0～2 min，3%A；2～20 min，3%→6% A；20～25 min，6%→9% A；25～33 min，9% A；33～40 min，9%→20% A；40～50 min，20% A；50～85 min，20%→60% A；85～90 min，60%→3% A；90～95 min，3% A)；檢測波長為254 nm，流速為0.8 mL·min-1；柱溫為25 ℃，進樣體積10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取尿苷對照品、鳥苷對照品、(R，S) -告依春對照品和腺苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每1mL 含尿苷20 μg、鳥苷20 μg、(R，S)-告依春20 μg和腺苷25 μg 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加5%甲醇10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理( 功率500 W，頻率40 kHz) 5 min使溶解，放冷，再稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適應性試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件操作，記錄色譜圖。如圖1所示。

2.3.2 精密度考察 取復方板藍根顆粒(批號1908001)，按確定的方法制備供試品溶液，連續進樣6次，指紋圖譜方法的精密度結果相似度>0.9，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD<3%。結果表明，儀器精密度良好。

2.3.3 重復性考察 取復方板藍根顆粒(批號1908001)，按確定的方法平行制備6份供試品溶液，測定指紋圖譜，指紋圖譜的重復性結果相似度>0.9，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD<3%。結果表明：方法重復性良好。

2.3.4 穩定性考察 取復方板藍根顆粒(批號1908001)，按確定的方法制備供試品溶液，分別在約0、3、6、9、12、21、27、30、38、46、50、56 h進樣，指紋圖譜方法的精密度結果相似度>0.9，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD<3%。結果表明：供試品溶液在56h內測定穩定。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立與共有峰的標定

2.4.1 指紋圖譜的建立 取各批復方板藍根顆粒，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，進樣10 μL，得到10批復方板藍根顆粒HPLC指紋圖譜，基于直觀法和指紋特征圖譜選擇要求(若峰數多于10個，且最大峰面積超過總峰面積的70%，或峰數多于20個，且最大峰面積超過總峰面積的60%，應考慮去除該色譜峰)，擬定本品指紋圖譜特征峰個數為10個。并以分離效果好且具代表性的尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷作為參照峰。如圖2、圖3所示。

2.4.2 共有指紋峰的標定 復方板藍根顆粒HPLC指紋圖譜中，共有色譜峰10個，以4號峰(R，S) -告依春為參照峰(S)，計算各色譜峰保留時間和保留峰面積與同一圖譜中S峰的保留時間和保留峰面積比值。見表1、表2。

表1 10批復方板藍根顆粒指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批復方板藍根顆粒指紋圖譜共有峰的相對峰面積

2.5 相似度評價 取復方板藍根顆粒樣品，共計10批，按照擬定供試品溶液制備方法制備，色譜條件測定，記錄色譜圖，色譜圖扣除0～3.0 min(溶劑峰)，采用2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，以R色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度設定0.1 min，用平均數法生成各自對照指紋圖譜圖，同時計算相似度。色譜峰見圖4，計算結果見表3，結果表明：大生產樣品相似度均在0.95以上，說明按現有工藝能試制，批間差異小，樣品質量穩定。

3 討論

3.1 參照峰的選擇 參照文獻[9]分別收集處方中各藥味對應的指標成分對照品，配制相應的對照品溶液，照指紋圖譜檢測方法檢測，在UV圖譜中無靛藍和靛玉紅的對應的色譜峰，且該兩成分的色譜峰疊加在一起。氨基酸類成分(精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸)無紫外吸收，而尿苷、鳥苷、腺苷、(R，S)-告依春均能良好的分離，且保留時間及峰面積大小適中，前后無干擾峰，因此確定尿苷、鳥苷、腺苷、(R，S)-告依春作為指紋圖譜參照物。

3.2 不同品牌色譜柱考察 分別考察Waters-Xselect-C18、Kromasil 100-5-C18和Agilent ZOR BAX-C18三種色譜柱對指紋圖譜的影響。該色譜條件下，Agilent ZOR BAX-C18色譜柱供試品中各色譜峰成分分離效果明顯較差，Waters-Xselect-C18、Kromasil 100-5-C18均能較好的分離各個色譜峰，但Waters-Xselect-C18總峰數少于Kromasil 100-5-C18，故本試驗采用Kromasil 100-5-C18色譜柱，同時建議后續實驗使用同款色譜柱。

3.3 柱溫的考察 按擬定的方法對不同柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃)進行考察，結果柱溫的變化會對四個成分的保留時間造成影響，25 ℃時指紋圖譜整體分離效果最好，因此明確本方法柱溫為25 ℃。

3.4 不同流速的考察 按照初步確定的色譜條件，微調流速，考察不同流速(0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)。結果不同流速對色譜峰的保留時間有所影響，流速0.8 mL/min指紋圖譜整體分離效果最好，因此流速定為0.8 mL/min。

4 結論

本研究建立了復方板藍根顆粒的HPLC指紋圖譜方法，方法學考察，色譜峰相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%。采用建立的指紋圖譜檢測方法對10批復方板藍根顆粒進行測定，大生產樣品相似度均在0.95以上，表明采用指紋圖譜對樣品質量進行控制，方法簡便、穩定、專屬性強、重復性好，能輔助含量測定方法全方位地保證藥品質量的穩定均一，對復方板藍根顆粒臨床安全合理用藥具有重要意義。