香連外洗液對氟康唑抗耐藥白念珠菌增效作用的轉錄組學研究*

王 平 范瑞強 柏彩英

近年來，隨著廣譜抗生素、激素等在臨床的廣泛使用，侵入性檢查和治療手段的廣泛開展，由白念珠菌導致的真菌感染性疾病不斷出現。究其原因，白念菌株對唑類藥物如氟康唑(Fluconazole，FCZ)可穩定遺傳的耐藥性是這一治療瓶頸的主要原因。從天然化合物中發現可以增強現有抗真菌藥物敏感性的藥物應用于臨床，是解決這一困境的可行之路。實驗研究和臨床實踐都證實[1-3]，由廣東省中醫院范瑞強教授的經驗方制成的香連外洗液具有抗菌、增效作用。

本研究就香連外洗液對氟康唑抗耐藥菌株的增效作用進行研究，并采用轉錄組測序的方法，對差異基因進行分析，為進一步研究香連外洗液對氟康唑抗耐藥菌株的增效機制打下基礎。

1 材料

1.1 藥物氟康唑原藥粉末：購自華邁科生物科技有限公司，有效期2022年12月，純度99%。香連外洗液：含生藥濃度100%，120 ml/瓶，批號190921，批準文號：粵藥制字Z20071446，原液濃度為1000 mg/ml，有效期至2020年9月18日

1.2 菌株克柔念珠菌ATCC6258、白念珠菌ATCC10231 (由廣東省中醫院贈送)。其中，ATCC6258為質控菌株。

1.3 培養基96孔板、SDA平板(均購自廣東省廣州市威佳科技有限公司)、RPM1640培養基(購自廣東省江門市凱琳貿易有限公司)。

1.4 儀器天根多酚試劑盒(TIANGEN公司)、Touch q-PCR System CFX96(BIO-RAD公司)、Novaseq 6000測序平臺(Illumina公司)等。

2 方法

2.1 質量控制以克柔念珠菌ATCC6258為質量控制菌株按照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的M27-A3方案，進行MIC值的判定。

2.2 氟康唑 香連外洗液對白念珠菌ATCC10231MIC值的測定采用微量液基稀釋法測定單一使用香連外洗液或氟康唑時，對白念珠菌ATCC10231的MIC。

2.3 氟康唑與香連外洗液聯合抗菌作用的研究采用棋盤微量稀釋法觀察氟康唑與香連外洗液的聯合抗菌作用。聯合應用的效果通過計算抑菌濃度分數指數(Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI)來確定。

2.4 結果判定按照CLSI的M27-A3方案進行。

2.5 白念珠菌總RNA的提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取白念珠菌的總RNA樣品。濃度、純度的檢測采用NanoPhotometer Spectrophotometer進行。完整性的檢測采用Agilent 2100 Bioanalyzer進行。

2.6 轉錄組測序及生物信息學分析通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾mRNA。之后，以被打斷的、片段化的mRNA為模版，合成cDNA第一條鏈，隨后以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，最終獲得文庫。文庫構建完成后，進行定量，并對文庫的insert size進行檢測。庫檢合格后，采用Novaseq 6000測序平臺進行測序，獲得主要包含測序片段的序列信息以及其對應的測序質量信息fastq格式文件。對原始數據進行過濾后，得到clean reads，并對clean data進行Q20、Q30和GC含量計算。從基因組網站下載參考基因組和基因模型注釋文件，采用HISAT2 V 2.0.5進行與參考基因組的比對及分析；根據基因的長度計算每個基因的FPKM，并計算映射到該基因的讀數。根據基因的表達量(FPKM)再計算該基因的差異表達倍數。對差異基因的分析采用edgeR(Robinson et al, 2010)進行，以表達倍數差異log2|fold change|>0，顯著性p-value<0.05作為篩選條件。差異基因GO富集分析和KEGG分析通過ClusterProfiler(3.4.4)軟件進行。

3 結果

3.1 香連外洗液 氟康唑對ATCC10231的MIC香連外洗液、氟康唑對白念珠菌ATCC10231的MIC值分別為15.63 mg/ml、64 μg/ml，表明菌株ATCC10231為氟康唑耐藥株。

3.2 氟康唑與香連外洗液聯合抗菌作用的研究聯合使用時，香連外洗液、氟康唑對白念珠菌ATCC10231的MIC值分別為3.906 mg/ml、4 μg/ml。據計算得出，FICI值為0.31，表明氟康唑與香連外洗液對耐藥白念珠菌ATCC10231有聯合抗菌作用。

3.3 白念珠菌ATCC10231總RNA提取的結果經NanoPhotometer、Spectrophotometer檢測，2種不同處理后， ATCC10231總RNA的濃度分別為754 ng/μl、1576 ng/μl; 經NanoPhotometer、Spectrophotometer檢測，兩種不同處理后，ATCC10231總RNA的OD260/280值分別為1.89、2.08，表明提取所得RNA純度高，污染小；經Agilent 2100 Bioanalyzer檢測，2種不同處理后，ATCC10231總RNA的RIN(RNA Integrity Number)值分別為7.40、8.30，表明樣品總RNA完整性好。

3.4 與參考基因組比對的結果將得到的clean reads與參考基因組進行比對，2種不同處理后，ATCC10231與參考基因組的比對結果分別為：90.75%、92.02%。說明所測物種與參考基因組一致，相關實驗無污染。

3.5 差異基因篩選以FPKM值作為基因表達量，進行差異基因的篩選。2種不同處理后相比較，香連外洗液+氟康唑作用后白念珠菌ATCC10231有547個基因的FPKM值的上調，963個基因的FPKM值下調。

3.6 差異基因富集分析

3.6.1 差異基因的GO分析GO分析是描述基因功能的綜合性數據庫，可分為生物過程(Biological Process，BP)和細胞組成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)3個部分。

2種不同處理后相比較，香連外洗液+氟康唑作用后ATCC10231差異表達基因的BP主要富集在跨膜轉運、碳水化合物代謝過程、刺激應答、生物合成過程的調控、蛋白代謝過程等。這些基因的CC主要富集在細胞膜、細胞膜的組成成分、細胞膜的固有成分、膜組件、細胞器等。這些基因的MF主要富集在跨膜轉運、氧化還原酶活性、ATP 結合活動、轉移酶活性、水解酶活性等。

3.6.2 差異基因的KEGG分析ATCC10231差異表達基因主要富集在MFS轉運蛋白家族、代謝途徑、次生代謝產物的合成、糖酵解與糖異生等。

4 qRT-PCR驗證基因表達量的變化

經采用qRT-PCR對挑選的5個差異基因進行檢測，與轉錄組測序分析結果基本一致(P<0.05)。見圖1。

圖1 5個差異基因qRT-PCR檢測結果

5 討論

GO(Gene Ontology)是國際標準化的基因功能分類體系。根據香連外洗液+氟康唑作用后ATCC10231差異表達基因富集的生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)等推測，香連外洗液作用下，細胞膜及細胞器成分發生了變化，其增效機制可能與代謝、轉運、酶活性增強等相關。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)又稱京都基因與基因組百科全書。根據香連外洗液+氟康唑作用后白念珠菌ATCC10231差異基因富集的信號通路及代謝途徑，推測香連外洗液引起了耐藥相關基因的下調表達,同時影響了細胞基礎物質代謝。

白念珠菌細胞膜成分的改變是白念珠菌耐藥的主要機制之一。其中，編碼細胞膜重要成分麥角甾醇相關基因ERG11的突變及過度表達是研究最多的，本研究發現，在香連外洗液+氟康唑作用后，ATCC10231轉變為氟康唑敏感株，轉錄組研究顯示，與類固醇生物合成這一通路相關的基因ERG24、ERG251均出現了下調表達。這一結果與Su等[4]研究是相同的。同時，未見其他類固醇生物合成相關基因包括ERG11的異常表達。

目前已知與藥物外排有關的多藥耐藥相關蛋白有2類:①ABC轉運蛋白。主要由CDR1和CDR2編碼，兩者的過度表達是由TAC1基因編碼的CDR基因轉錄激活因子l(Transcriptional Activator of CD Rgene l，Tac1)介導的。②易化載體超家族蛋白(Major Facilitator Superfamily，MFS)。MDR1又稱為CaMDR1，是白念珠菌最重要的MFS家族多藥耐藥相關基因。鋅簇家族中與MDR1轉錄調控相關的最主要的基因是多耐藥調節基因(Multidrug Resisitance Regular 1，MRR1)。MRR1出現的功能獲得性突變，可導致MDR1高表達引發MDR1外排功能上調出現耐藥[5]。本研究中，經氟康唑+香連外洗液作用，Tac1、MRR1出現了下調表達。此外，白念珠菌ABC轉運蛋白相關基因CDR1、CDR2出現了下調表達，未見其他ABC轉運蛋白相關基因的異常表達；MFS家族基因TPO3、TPO2、TPO4等均出現了下調表達，未見既往研究報道最多的MFS家族多藥耐藥相關基因MDR1的異常表達。

在白念珠菌的致病過程中，黏附功能起了關鍵的作用。白念珠菌黏附基因主要包括以下幾種：①菌絲壁蛋白相關基因：菌絲壁蛋白1(Hyphal wall protein l，Hwp1)及菌絲壁蛋白2(hyphal wall protein l，Hwp2)是白念珠菌重要的毒力因子，同時也與白念珠菌的黏附相關，其是由鋅簇轉錄因子Bcr1調控表達的[6]。本研究中，經香連外洗液+氟康唑作用后，氟康唑耐藥株轉變為敏感株，同時，發現Hwp1、Hwp2出現了下調表達。推測，經香連外洗液+氟康唑作用后，菌株恢復了對氟康唑的敏感性，Hwp1、Hwp2的下調表達可能是香連外洗液對氟康唑抗白念珠菌增效機制之一。除此以外，生物膜相關基因RBT1也出現了下調表達，這一點與以往的研究是相同的[7]。②聚苯乙烯黏附增強蛋白相關基因(Enhanced Adherence to Polystyrene 1,Eap1)Eap1p有助于生物膜形成，其不同區域介導了白念珠菌對上皮細胞、聚苯乙烯等不同底物的黏附。研究顯示，Eap1缺失的白念珠菌黏附力及持續時間明顯減少[8]。本研究中，經香連外洗液+氟康唑作用后，Eap1出現了下調表達，同時出現了YWP1的上調表達，后者認為與白念珠菌黏附能力的維持相關[8]。與黏附相關的基因Eap1下調表達，而與黏附維持相關的基因YWP1出現上調，這一結果與一項關于BDSF抗白念珠菌的研究是相同的[9]。

氧化應激是白念珠菌耐受藥物打擊的重要生理活動，過氧化物酶是一類氧化還原酶，它們能催化很多反應，是白念珠菌細胞中重要的抗氧化酶之一[10]。經香連外洗液+氟康唑作用后的菌株，與過氧化物酶相關的CTN1、PXP2、CTN3、IDP2、POX18、POT1基因均出現下調表達。其中，PXP2、IDP2、POX18、POT1基因功能尚未確定，可能與白念珠菌氧化應激所介導的耐藥機制有關。根據以上內容推斷，過氧化物酶通路相關基因也是香連外洗液作用的靶點之一。

綜上所述，香連外洗液對氟康唑抗耐藥白念珠菌的增效作用是一個多基因參與、多個生物過程協同調控的過程。其作用的靶點與既往文獻中出現的耐藥基因相關，但文獻報道最多的基因并沒有出現異常表達，有些甚至是文獻報道較少或功能尚未確定的，這說明香連外洗液有其獨特的作用機制和作用靶點。這一發現為香連外洗液良好的臨床療效提供了佐證，同時也為下一步的研究提供了方向。