基于JAK/STAT信號通路研究納米氧化鈦致卵巢損傷的分子機(jī)制＊

文/高國棟，馬增力，余興火，鐘師，黃林鳳

前期研究者研究了納米氧化鈦顆粒暴露致卵巢損傷和基因表達(dá)譜的改變，并且對納米氧化鈦暴露導(dǎo)致卵巢損傷的機(jī)制做了初步研究。在前期的研究基礎(chǔ)上我們需要從JAK/STAT信號通路進(jìn)一步研究納米氧化鈦暴露致小鼠卵巢損傷的機(jī)制。現(xiàn)列舉SPF級ICR小鼠96只進(jìn)行分組討論。具體報(bào)告如下：

1 資料及方法

1.1 一般資料

采購上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司的SPF級ICR小鼠96只，其隨機(jī)分為兩組，包括0、2. 5、5、10mg/kg納米化鈦實(shí)驗(yàn)組和0、2. 5、5、10mg/kg納米氧化鈦+JAK阻斷劑實(shí)驗(yàn)組。前組小鼠周齡為（7.52±0.26）周，后組小鼠周齡為（7.56±0.25）周；前組小鼠體重為（32.25±2.55）g，后組小鼠體重為（32.25±2.55）g，上述兩組小鼠的組間差距無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。具體內(nèi)容如表1。

表1 一般資料比較[±s]

1.2 方法

將重點(diǎn)基于JAK/STAT信號通路研究納米氧化鈦暴露致小鼠卵巢損傷的機(jī)制。比較分析JAK抑制劑處理小鼠與未用抑制劑處理小鼠在5mg/L納米氧化鈦暴露90d后小鼠血清生殖性激素AMH以及JAK/STAT信號通路SOCS3基因表達(dá)水平。同時(shí)，雌性小鼠于5毫克/千克的納米氧化鈦胃內(nèi)連續(xù)給藥90d，分析其卵巢炎癥發(fā)生率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠卵巢中功能JAK/STAT信號通路基因表達(dá)水平

在納米氧化鈦（5nm）灌胃處理90d后，納米氧化鈦在卵巢聚集，導(dǎo)致卵巢萎縮、元素分布失衡、性激素紊亂、生殖功能障礙，雌性小鼠的生育力和懷孕率下降。微陣列分析顯示：與納米化鈦實(shí)驗(yàn)組相比，納米氧化鈦處理的小鼠卵巢中功能JAK/STAT信號通路基因表達(dá)水平顯著改變。具體情況見下圖1。

圖1 小鼠卵巢中功能JAK/STAT信號通路基因表達(dá)水平

2.2 納米氧化鈦（5nm）在小鼠卵巢中的作用

為了更好地了解納米氧化鈦（5nm）如何在小鼠卵巢中的作用，雌性小鼠于5毫克/千克的納米氧化鈦胃內(nèi)連續(xù)給藥90d，結(jié)果顯示納米氧化鈦暴露可導(dǎo)致卵巢指數(shù)下降、卵泡閉鎖，卵巢生殖功能障礙，卵巢炎癥反應(yīng)發(fā)生。其中，納米化鈦實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)生卵巢炎癥率高于納米氧化鈦+JAK阻斷劑實(shí)驗(yàn)組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體情況見下表2：

表2 兩組小鼠發(fā)生卵巢炎癥率比較[n，%]

2.3 納米氧化鈦（5nm）導(dǎo)致小鼠血液AMH下降

納米氧化鈦（5nm）暴露90d后引起小鼠血液AMH下降，暴露30d、60d、90d后卵巢組織AMH水平呈不同程度下降，暴露90d后AMH下降尤其明顯，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明納米氧化鈦暴露造成小鼠卵巢儲備功能下降。將其強(qiáng)表達(dá)設(shè)置為3，正常表達(dá)設(shè)置為2，低表達(dá)設(shè)置為1。具體情況見表3。

表3 納米氧化鈦對于小鼠AMH含量變化比較[±s]

2.4 納米氧化鈦（5nm）導(dǎo)致小鼠卵巢SOCS3下降

納米氧化鈦（5nm）暴露30、60、90d后導(dǎo)致卵巢組織SOCS3蛋白濃度降低，暴露90d后SOCS3下降明顯組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體情況見表4。

表4 納米氧化鈦對于小鼠SOCS3mRNA相對定量變化比較[±s]

3 討論

JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路在動物中高度保守。JAK-STAT的名稱是由兩個(gè)基因組成：激酶Janus（Janus kinase）和轉(zhuǎn)錄因子STAT（signal transducer and activator of transcription），它們共同參與細(xì)胞對各類細(xì)胞因子和生長因子的應(yīng)答作用。應(yīng)答類型涉及細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞存活等。對于多細(xì)胞動物來說，細(xì)胞之間的有效溝通對于發(fā)育、組織和生物體的體內(nèi)平衡以及宿主防御至關(guān)重要。進(jìn)化為這個(gè)問題提供了許多解決方案，但其中JAK-STAT途徑是結(jié)構(gòu)上最簡單的范例之一。JAK-STAT是一個(gè)非常簡單的通路，以極少的中間步驟將胞外信號從跨膜受體傳遞到細(xì)胞核。最初，科學(xué)家是在干擾素信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)現(xiàn)該通路，后續(xù)則發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子、集落刺激因子和激素都可以通過JAK-STAT通路傳遞信號。

隨著納米材料的廣泛應(yīng)用，納米氧化鈦潛在衛(wèi)生安全越來越受到人們的高度關(guān)注。納米氧化鈦顆粒的直徑小于100nm。納米氧化鈦顆粒具有很大的表面積和表面原子數(shù)，表面積和表面張力隨著粒徑的下降急劇增加。納米氧化鈦由于其獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)等導(dǎo)致納米微粒的熱、磁、光、敏感特性以及表面穩(wěn)定性等不同于常規(guī)粒子。納米氧化鈦顆粒可通過皮膚、消化道和呼吸道等與包括產(chǎn)業(yè)工人在內(nèi)的人體直接接觸，各種數(shù)量級的納米氧化鈦直接或者隨產(chǎn)品以各種不同的途徑進(jìn)入體內(nèi)某些特定的部位富集，并產(chǎn)生內(nèi)在毒性效應(yīng)，其生物毒理學(xué)已引起科學(xué)界的極大關(guān)注。近年來的研究，不僅證實(shí)口服納米氧化鈦顆粒可以造成生物毒性，而且對納米氧化鈦引起動物肝、肺、腎、腦、脾等的損傷進(jìn)行了研究，并且闡明了相應(yīng)的損傷機(jī)制。高國棟在文獻(xiàn)中闡述，納米氧化鈦染毒大鼠睪丸組織發(fā)生明顯的病理學(xué)改變，納米氧化鈦對雄性大鼠有生殖毒性效應(yīng)，并且納米氧化鈦的生殖毒性效應(yīng)明顯強(qiáng)于納米氧化硅。納米二氧化鈦可以抑制睪丸支持細(xì)胞TM4的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是納米氧化鈦對動物卵巢毒性的研究鮮有報(bào)道。

卵巢的生殖功能主要是合成并且分泌性激素和產(chǎn)生卵子并且排卵。抗繆勒氏管激素（AMH）比尿促卵泡素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）等更早地反映原始卵泡池中卵泡數(shù)量，更早期、準(zhǔn)確反映卵巢功能狀態(tài)，并且AMH不受下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控，在月經(jīng)周期中水平恒定,無周期性變化，可在月經(jīng)周期中任一d抽血檢測。此文獻(xiàn)提出基于JAK/STAT信號通路研究納米氧化鈦暴露致小鼠卵巢生殖毒性的機(jī)制，并且利用JAK抑制劑進(jìn)一步研究納米氧化鈦暴露后導(dǎo)致卵巢損傷的機(jī)制，從而進(jìn)一步理解納米氧化鈦顆粒暴露后導(dǎo)致卵巢生殖毒性的分子機(jī)制，為預(yù)防納米氧化鈦顆粒暴露后卵巢毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在納米氧化鈦（5nm）灌胃處理90d后，納米氧化鈦在卵巢聚集，導(dǎo)致卵巢萎縮、元素分布失衡、性激素紊亂、生殖功能障礙，雌性小鼠的生育力和懷孕率下降。雌性小鼠于2.5、5和10毫克/千克的納米氧化鈦胃內(nèi)連續(xù)給藥90d，結(jié)果顯示納米氧化鈦暴露可導(dǎo)致卵巢指數(shù)下降、卵泡閉鎖，卵巢生殖功能障礙，卵巢炎癥反應(yīng)發(fā)生。納米氧化鈦（5nm）暴露90d后引起小鼠血液AMH下降，暴露30d、60d、90d后卵巢組織AMH水平呈不同程度下降，暴露90d后AMH下降尤其明顯，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明納米氧化鈦暴露造成小鼠卵巢儲備功能下降。納米氧化鈦（5nm）暴露30、60、90d后導(dǎo)致卵巢組織SOCS3蛋白濃度降低，暴露90d后SOCS3下降明顯組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，文章通過分析納米氧化鈦暴露后卵巢組織中J AK/STAT信號通路研究、納米氧化鈦暴露后對卵巢 JAK/STAT信號通路的改變、JAK抑制劑分析納米氧化鈦對卵巢損傷以及體外研究實(shí)驗(yàn)，顯示納米氧化鈦暴露可導(dǎo)致卵巢指數(shù)下降、卵泡閉鎖，卵巢生殖功能障礙，卵巢炎癥反應(yīng)發(fā)生，證明基于JAK/STAT信號通路由于納米氧化鈦引起卵巢損傷，闡明J AK/STAT信號通路在納米氧化鈦對卵巢損傷中機(jī)制及作用。