牛妊娠相關(guān)蛋白19真核表達(dá)載體的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

董 媛，于鴻緒，陳國(guó)良，鮑東博，崔嘉芮，3，劉 磊，王會(huì)巖，4

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 132013；2.動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 136600；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130700；4.吉林醫(yī)藥學(xué)院抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 132013）

妊娠相關(guān)糖蛋白（pregnancy-associated glycoprotein，PAG）隸屬于天冬氨酸蛋白酶家族[1]，最初是在妊娠后母牛的胎盤(pán)中作為母體血液中的妊娠特異性抗原而被發(fā)現(xiàn)的。目前已從牛胎盤(pán)中克隆出21個(gè)不同的牛妊娠相關(guān)糖蛋白（bovine pregnancy-associated glycoproteins，BoPAGs） cDNA，核苷酸序列差異在5%[2]，不同BoPAGs的表達(dá)存在時(shí)空差異，如BoPAG1、BoPAG9和BoPAG21僅在滋養(yǎng)外胚層的雙核細(xì)胞中表達(dá)，BoPAG2、BoPAG8、BoPAG10、BoPAG11和BoPAG12則在整個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中產(chǎn)生[3]。BoPAGs基因編碼375～389個(gè)氨基酸（少數(shù)為258～342個(gè)氨基酸）的多肽鏈，結(jié)構(gòu)上與胃蛋白酶、凝乳酶等有50%的相似性，但因催化中心關(guān)鍵氨基酸突變，導(dǎo)致大多數(shù)BoPAGs失去了蛋白水解活性[4]。相對(duì)于傳統(tǒng)的妊娠診斷方法，BoPAGs作為一種妊娠動(dòng)物體液中能檢測(cè)出的特異性蛋白，因具有檢出率高、對(duì)檢測(cè)設(shè)備和方法要求不高等優(yōu)點(diǎn)而倍受人們的關(guān)注[5]。Frickep等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠21 d左右的母牛血液中能夠檢測(cè)到BoPAGs，分娩時(shí)達(dá)到高峰，受精27 d后的檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到93.7%，比超聲診斷法提前了幾天，這有利于及早且準(zhǔn)確地診斷牛的妊娠狀況，縮短出欄時(shí)間，降低養(yǎng)殖成本。目前對(duì)于BoPAGs的功能研究較少，推測(cè)其在胎盤(pán)-子宮界面潛在生長(zhǎng)因子的生化處理中起作用，同時(shí)參與了胎盤(pán)的發(fā)生、胎兒生長(zhǎng)、母嬰物質(zhì)傳遞等[7]，但PAG在維持妊娠時(shí)發(fā)揮的具體功能尚不清楚。限制BoPAGs研究的主要原因就是天然的BoPAGs濃度低、種類繁多，難于純化。通常多采用磷酸鉀緩沖液提取、飽和硫酸銨沉淀、離子交換層析等傳統(tǒng)方法從母畜胎盤(pán)子葉中分離純化天然PAG蛋白，但步驟繁瑣復(fù)雜，且大多數(shù)PAGs蛋白不穩(wěn)定，在純化過(guò)程中稍有不慎容易導(dǎo)致蛋白降解[8]。此外，成熟的BoPAGs要經(jīng)過(guò)糖基化等修飾過(guò)程，導(dǎo)致與BoPAGs前體差異較大[9]，所以人們常采用重組表達(dá)的方式獲得BoPAGs蛋白。早期妊娠檢測(cè)蛋白主要有PAG1、PAG4、PAG6、PAG9、PAG16、PAG18、PAG19等，目前BoPAG1[10-11]、BoPAG2[12]、BoPAG6[13]、BoPAG4[14]、BoPAG7、BoPAG8[15]、BoPAG9[16-17]和BoPAG16[18]表達(dá)載體的構(gòu)建已有報(bào)道，如楊亞軍等[12，15]先對(duì)PAG的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，后通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了高表達(dá)的PAG2、PAG7和PAG8蛋白，并分析了其生物信息學(xué)特征；劉長(zhǎng)彬等[10，17-18]在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并成功表達(dá)了PAG1、PAG9和PAG16蛋白；而B(niǎo)oPAG19蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究選取BoPAG19作為研究對(duì)象，通過(guò)其氨基酸序列體外合成核苷酸序列，用常規(guī)PCR獲得目的片段，構(gòu)建pcMV3-BoPAG19真核表達(dá)載體，并在真核細(xì)胞HEK-293F中誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組BoPAG19蛋白，分析其生物信息學(xué)特征，以期為研究BoPAG19的生物學(xué)功能和研發(fā)新的早期妊娠診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和載體 pcMV3-Entry Vector和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自上海易匯生物科技有限公司；人胚腎細(xì)胞HEK-293F購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒小提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購(gòu)自北京冬璞泰和科技有限責(zé)任公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、KpnⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自北京NEB生物科技有限公司；細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清均購(gòu)自北京同立海源生物科技有限公司。

組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠和磁性分離器均購(gòu)自蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司;JL-PZY96BT型PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自上海靳瀾儀器制造有限公司；D180-P型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找BoPAG19基因序列（NM_176628），于5′-端加入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，去掉原有信號(hào)肽序列加入增強(qiáng)分泌型信號(hào)肽和Kozak序列；于3′-端加入6個(gè)His序列和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。BoPAG19基因由南京金斯瑞基因公司合成。針對(duì)合成基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：上游引物：5′-GCCGCCACCAAGCTTGGTACCATGAAGTG-GCTGGTGGTGC-3′;下游引物：5′-TCGGCGGCC-GCTCTAGATTTAATGGTGATGATGGTGGTG-ATGGTGG-3′。引物由南京金斯瑞基因公司合成。

圖1 pcMV3-BoPAG19載體構(gòu)建圖Fig.1 Construction diagram of pcMV3-BoPAG19 vector

PCR反應(yīng)體系25 μL：10×ExTaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL，引物各0.5 μL，模板0.5 μL，ExTaq酶0.5 μL，ddH2O 19.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)鑒定正確的PCR產(chǎn)物與pcMV3表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切。 雙酶切反應(yīng)體系10 μL：目的片段/載體8 μL，KpnⅠ酶0.5 μL，XbaⅠ酶0.5 μL，10×Buffer 1 μL。膠回收雙酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)。

1.2.2 pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒鑒定 挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切反應(yīng)體系10 μL：質(zhì)粒8 μL，KpnⅠ酶0.5 μL，XbaⅠ酶0.5 μL，10×Buffer 1 μL。37 ℃酶切1 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pcMV3-BoPAG19瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及表達(dá) 37 ℃復(fù)蘇HEK-293F細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，加30 mL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中175 r/min振蕩培養(yǎng)約18 h；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×104/mL、細(xì)胞匯合度>95%時(shí)，以0.5×104/mL密度進(jìn)行傳代；當(dāng)細(xì)胞密度再次達(dá)到3.0×106/mL時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取30 μg pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒與120 μL Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置15 min，緩慢滴加到細(xì)胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中175 r/min振蕩培養(yǎng)，18～22 h后加入5%補(bǔ)料培養(yǎng)基Transpro feed 1。當(dāng)細(xì)胞匯合度<60%時(shí)停止培養(yǎng)（6 d），收集培養(yǎng)物并離心，取上清備用。

1.2.4 BoPAG19重組蛋白純化 將收集到的10 mL HEK-293F細(xì)胞上清，12 000 r/min離心30 min，備用。根據(jù)磁珠使用說(shuō)明，取10 mL磁珠懸液置于15 mL離心管中，置于磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，棄上清；將離心后的細(xì)胞上清加入含有磁珠的離心管中，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合1 h，置于磁性分離器上進(jìn)行磁性分離，棄上清；向磁珠中加入10 mL Washing Buffer（PBS緩沖液，pH 7.4）洗滌2次，再次磁性分離，分別采用20、100和200 mmol/L咪唑的Elution Buffer（2 mL）洗脫磁珠，磁性分離后，收集洗脫液；采用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾管將洗脫液濃縮50倍，SDS-PAGE和Western blotting法鑒定純化蛋白，并通過(guò)BCA法測(cè)定純化后的蛋白濃度[14]。

1.2.5 結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)分析 通過(guò)ProtParam在線軟件（https:∥web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白的理化性質(zhì)；通過(guò)SignalP 5.0 Server在線軟件（https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白的信號(hào)肽；通過(guò)TMHMM v.2.0 Server在線軟件（http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；通過(guò)YinOYang v.1.2 Server在線軟件（http:∥www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白糖基化位點(diǎn)；通過(guò)IEDB在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白的線性B細(xì)胞抗原表位；通過(guò)SOPMA（https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Phyre2（http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）等在線軟件預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)STRING在線工具（https:∥cn.string-db.org/）預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白-蛋白相互作用[15]。

2 結(jié) 果

2.1 pcMV3-BoPAG19載體鑒定

對(duì)構(gòu)建的重組載體pcMV3-BoPAG19進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，目的基因片段長(zhǎng)約1 200 bp，與預(yù)期大小一致；雙酶切后獲得2條線性片段，分別為目的基因和載體片段，其中目的基因片段大小與BoPAG19基因大小相符，且酶切條帶單一，表明重組載體構(gòu)建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1，BoPAG19基因PCR擴(kuò)增；M2，DL10000 DNA Marker；2，重組質(zhì)粒pcMV3-BoPAG19 PCR擴(kuò)增；3，重組質(zhì)粒pcMV3-BoPAG19雙酶切鑒定M1，DL2000 DNA Marker;1，PCR amplification of BoPAG19 gene;M2，DL10000 DNA Marker;2，PCR amplification of recombinant plasmid pcMV3-BoPAG19;3，Double digestion identification of recombinant plasmid pcMV3-BoPAG19圖2 BoPAG19基因PCR擴(kuò)增和pcMV3-BoPAG19雙酶切鑒定Fig.2 PCR amplification of BoPAG19 gene and double restriction digestion of pcMV3-BoPAG19

2.2 BoPAG19重組蛋白的純化

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后取HEK-293F細(xì)胞上清進(jìn)行磁珠純化，洗脫液濃縮50倍后經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，100 mmol/L咪唑洗脫時(shí)BoPAG19蛋白純度和濃度最高，BoPAG19蛋白分子質(zhì)量約60 ku（圖3），與預(yù)期大小相符。Gel-Pro Analyzer軟件灰度分析結(jié)果顯示，BoPAG19蛋白純度高達(dá)98.4%；BCA蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果顯示蛋白濃度為1.27 mg/mL；純化蛋白經(jīng)Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，能夠與抗PAG19抗體發(fā)生特異性結(jié)合（圖4）。

1,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2，純化前細(xì)胞上清；3，洗滌液；4～6，20、100及200 mmol/L咪唑1，Protein Marker;2，Cell supernatant;3，Washing buffer;4-6，20，100 and 200 mmol/L imidazole，respectively圖3 SDS-PAGE分析BoPAG19蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of BoPAG19 protein

1，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2，商用BoPAG19蛋白；3，純化BoPAG19蛋白1,Protein Marker;2，Commercial BoPAG19 protein；3，Purified BoPAG19 protein圖4 Western blotting分析BoPAG19蛋白Fig.4 Western blotting analysis of BoPAG19 protein

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì) 利用ProtParam軟件對(duì)BoPAG19蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子式為C1937H3028N524O532S15，分子質(zhì)量為41.8 ku，等電點(diǎn)為9.62，親水性平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.03，為兩性蛋白，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為40.75，在水中不穩(wěn)定；含有380個(gè)氨基酸，其中含量最高的是絲氨酸（9.2%），含量最低的是色氨酸（1.6%）（表1）。脂肪系數(shù)為91.53，消光系數(shù)為52 370 mol-1·cm-1，半衰期為30 h。

表1 BoPAG19蛋白的氨基酸組成Table 1 Animo acid composition of BoPAG19 protein

2.3.2 信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 經(jīng)SignalP 5.0 Server軟件對(duì)BoPAG19蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，該蛋白N-端前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽（圖5）。經(jīng)TMHMM v.2.0 Server軟件對(duì)BoPAG19蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，BoPAG19蛋白無(wú)跨膜區(qū)域（圖6）。

圖5 BoPAG19蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Signal peptide prediction of BoPAG19 protein

圖6 BoPAG19蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Transmembrane prediction of BoPAG19 protein

2.3.3 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 經(jīng)YinOYang 1.2 Server在線軟件對(duì)蛋白糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白共存在6處糖基化位點(diǎn)，分別為Ser92、Thr127、Thr154、Ser184、Ser185和Ser297（圖7）。

圖7 BoPAG19蛋白O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 O-glycosylation prediction of BoPAG19 protein

2.3.4 抗原表位預(yù)測(cè) 經(jīng)IEDB在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)BoPAG19蛋白的線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白共發(fā)現(xiàn)11段優(yōu)勢(shì)區(qū)段（圖8），具體抗原表位序列見(jiàn)表2。

圖8 BoPAG19蛋白的線性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)Fig.8 Linear B cell epitopes prediction of BoPAG19 protein

表2 抗原表位序列Table 2 Antigenic epitope sequence

2.3.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 經(jīng)SOPMA在線軟件對(duì)BoPAG19蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白主要以α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，占比分別為18.95%、6.32%、42.37%和32.37%（圖9）。 經(jīng)Phyre2在線軟件對(duì)BoPAG19蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致（圖10）。

h，α-螺旋；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無(wú)規(guī)則卷曲；e，延伸鏈h,Alpha helix;t,Beta turn;c,Random coil;e,Extended chain圖9 BoPAG19蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Secondary structure prediction of BoPAG19 protein

圖10 BoPAG19蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Tertiary structure prediction of BoPAG19protein

2.3.6 蛋白相互作用分析 通過(guò)STRING在線軟件預(yù)測(cè)BoPAG19蛋白的相互作用，結(jié)果顯示，與BoPAG19互作的蛋白包括β-淀粉樣前體樣蛋白2（amyloid beta （A4） precursor-like protein 2，APLP2）和β-淀粉樣蛋白（amyloid-beta A4 protein，APP）（圖11、表3）。

圖11 BoPAG19蛋白相互作用Fig.11 Interactions of BoPAG19 protein

表3 BoPAG19蛋白功能預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)域Table 3 Functional prediction and domain of BoPAG19 protein

3 討 論

目前，在牛、羊、鹿等多種偶蹄動(dòng)物的胎盤(pán)上皮細(xì)胞層中發(fā)現(xiàn)了100多種編碼PAG的基因，其中BoPAGs有21種，它們的序列差異至少5%[2]，根據(jù)PAG蛋白是否保留了蛋白水解活性，將BoPAGs蛋白分成“古代組”和“現(xiàn)代組”[19-20]，“現(xiàn)代組”包括了大多數(shù)BoPAGs，它們的催化中心發(fā)生了堿基突變，因此失去了蛋白水解酶活性，PAG19就是結(jié)構(gòu)中DTG模體羧基端常為蘇氨酸的位置突變?yōu)楫惲涟彼幔虼薖AG19屬于“現(xiàn)代組”[2]。“現(xiàn)代組”如BoPAG1、BoPAG9和BoPAG21，因僅在滋養(yǎng)層細(xì)胞亞群（也叫雙核細(xì)胞）中表達(dá)，被認(rèn)為在著床和胎盤(pán)形成過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[21]，也可能具有免疫調(diào)節(jié)活性和催乳活性[22]。PAGs和孕促性腺激素受體存在相互作用，可能參與了黃體保護(hù)與妊娠維持的調(diào)節(jié)[23]。盡管對(duì)PAG蛋白有著不同的研究和推測(cè)，但PAG真正的功能目前尚不清楚，關(guān)于PAG19更是鮮有報(bào)道，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中僅能查詢到在水牛（Bubalusbubalis）和奶牛（Bostaurus）中有PAG19的表達(dá)。

在目的基因和蛋白缺少足夠的試驗(yàn)依據(jù)的情況下，可利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)研究的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與其他物種進(jìn)行比對(duì)分析，這對(duì)后續(xù)的功能性試驗(yàn)有一定的指導(dǎo)作用[12]。成熟的PAGs約有330個(gè)氨基酸，其理論分子質(zhì)量為37 ku，但是糖基化后的PAGs蛋白分子質(zhì)量幾乎翻倍（約67 ku），糖基化對(duì)蛋白分泌、防止蛋白水解、抗原識(shí)別和生物學(xué)功能等方面均發(fā)揮重要作用[24]。楊亞軍等[12]制備的分泌型BoPAG2蛋白，分子質(zhì)量為68 ku，含有5個(gè)糖基化位點(diǎn)，有7個(gè)互作蛋白，通過(guò)互作蛋白預(yù)測(cè)，BoPAG2可能參與了消化吸收和妊娠期調(diào)節(jié)功能。劉長(zhǎng)斌等[17]制備的BoPAG9也采用了HEK-293F真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了分子質(zhì)量約68 ku、純度為90%的蛋白。本試驗(yàn)在HEK-293F細(xì)胞表達(dá)并純化后的BoPAG19分子質(zhì)量約60 ku，大于其理論值44 ku，說(shuō)明蛋白糖基化修飾和磷酸化修飾是分子質(zhì)量大于理論值的主要原因。

最新的結(jié)構(gòu)建模研究表明，“現(xiàn)代組”P(pán)AGs雖然失去了蛋白水解酶活性，但是可能保留了短肽結(jié)合能力[25]。PAGs蛋白結(jié)構(gòu)中有一個(gè)肽/底物結(jié)合裂隙及N-和O-連接的糖基側(cè)鏈，可以結(jié)合類似于植物凝血素和整合素的蛋白，甚至可以作為某些蛋白的對(duì)接位點(diǎn)，隔絕或運(yùn)輸?shù)鞍?，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[4]，只是這些底物結(jié)合位點(diǎn)的功能目前還不明確。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，PAG19含有與APP結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能與肽結(jié)合，且具有天冬氨酸型內(nèi)肽酶活性，而APP在細(xì)胞基質(zhì)沉積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，能夠誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡[26-27]。有報(bào)道顯示，APP沉積與阿爾茨海默疾病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)[28]。PAG19可能通過(guò)在胎盤(pán)-子宮界面與APP結(jié)合，減少妊娠期APP的沉積和分泌，保護(hù)和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。但PAG19是否調(diào)節(jié)了神經(jīng)發(fā)育的相關(guān)過(guò)程，以及是否能用于牛早期妊娠診斷，還缺乏試驗(yàn)依據(jù)，仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了BoPAG19基因，全長(zhǎng)1 200 bp，編碼380個(gè)氨基酸，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，有1個(gè)信號(hào)肽，屬于不穩(wěn)定、親水分泌型蛋白質(zhì)，具有6個(gè)糖基化位點(diǎn)和11個(gè)B細(xì)胞表位；α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈所占比例分別為18.95%、6.32%、42.37%和32.37%；BoPAG19蛋白與APLP2和APP蛋白有相互作用；成功構(gòu)建了pcMV3-BoPAG19重組質(zhì)粒，并在HEK-293F細(xì)胞中表達(dá)，純化獲得的BoPAG19蛋白純度高達(dá)98.4%，為BoPAG19蛋白的功能研究和臨床診斷提供參考。