CRISPR/Cas9技術在畜禽育種中的研究進展

徐 景，楊 光，江美祺，丁向彬，郭益文，胡德寶，李 新，郭 宏，張林林

（天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384）

成簇規律間隔短回文重復序列/Cas關聯蛋白9（clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9）基因編輯技術為DNA基因沉默提供了更直接的基因敲除方式，不需要同源重組（homologous recombination,HR）和中間介質（如胚胎干細胞或成纖維細胞），可直接應用于受精卵。它還可以在細胞或胚胎中進行更高效的HR以實現特定位點的DNA序列敲入[1]。CRISPR/Cas9系統具有設計簡單、篩選精準、可編程性、合成高效及同時敲除多個基因等優點[2-4]，目前已被廣泛應用于畜禽的基因編輯及其相關研究，包括基因功能研究、遺傳改良、抗病育種、生產功能性畜產品及制藥等[5-7]。隨著對畜禽產品需求的增加和相關疾病的防控[8-11]，CRISPR/Cas9基因編輯技術在畜禽遺傳改良和抗病育種方面的研究和應用仍需不斷發展。作者主要對CRISPR/Cas9技術的原理及其在畜禽育種中的應用進展進行綜述，以期為推進CRISPR/Cas9技術在畜禽育種中的研究提供參考依據。

1 CRISPR/Cas9技術的原理

CRISPR/Cas9基因編輯技術是由細菌和古細菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas獲得性免疫系統經人工改造而成的DNA基因編輯技術[1]。CRISPR是在一些細菌基因內呈簇狀排列的短DNA重復序列，每個重復序列都被原間隔序列（protospacer）隔開。原間隔序列是與靶DNA結構相似的短重復序列，決定基因序列的識別位點[3]。每個原間隔序列始終與保守的原間隔序列相鄰基序（protospacer adjacent motif,PAM）相鄰，PAM對于靶DNA的識別具有重要作用。最初CRISPR/Cas系統是根據與靶DNA或RNA配對的Cas蛋白不同分為3類[1]。2015年，根據Cas編碼復合物的不同將CRISPR系統分為5個類型和16個亞型[12]。2020年，CRISPR/Cas系統的最新分類包括2個綱、6個類型和33個亞型[13]，即根據CRISPR基因的組成分為兩類：Ⅰ類系統的CRISPR RNA（crRNA）效應器復合物由多個亞基組成；Ⅱ類系統的crRNA效應器復合物僅由單一的Cas基因編碼[14]。對這兩類進一步分類，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型是通過靶向外源DNA來保護細胞，Ⅲ和Ⅵ型則是靶向入侵的RNA。在細菌基因組中發現95%以上的CRISPR/Cas系統是Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型之一[15]，而Ⅱ類系統幾乎是細菌所獨有的，且僅依賴一種Cas蛋白，即Cas9蛋白。

CRISPR/Cas9系統主要由crRNA[16]、反式激活crRNA（transactivating crRNA,tracrRNA）[17]和核酸酶Cas9組成（圖1）。當靶DNA上的PAM序列被CRISPR/Cas9系統識別后，CRISPR序列在前導序列的調控下轉錄為pre-crRNA，在Cas9和RNase Ⅲ作用下加工成成熟的crRNA，與tracrRNA形成雙鏈互補，形成crRNA-tracrRNA與Cas9的RNP復合體。RNP復合體在crRNA引導下特異性識別外源基因序列上的CRISPR序列，由核酸酶Cas9切割識別的DNA序列生成雙鏈斷裂（double strand break，DSB）[18]。生成的DSB通過同源定向修復（homology-directed repair,HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）兩種機制進行修復[2]。NHEJ修復途徑常伴隨著隨機插入或刪除堿基突變，導致較小片段的隨機插入、缺失或染色體重排。當CRISPR靶點位于特定基因的開放閱讀框（open-reading frame，ORF）內或隨機插入或刪除堿基數不是3的倍數時會發生移碼突變，破壞ORF，產生基因敲除模型。HDR修復途徑可以重組原始序列，或利用提供的重組模板插入給定修飾的序列，產生基因敲入模型。之后模擬crRNA和tracrRNA的作用機理，在體外人工合成單導向RNA（single guide RNA,sgRNA）[19-21]，從而代替crRNA-tracrRNA復合體引導Cas9到達目標位點發揮作用。這不僅可以將系統簡化成仍能在靶標位點上產生所需的替換、插入或刪除的僅含Cas9和sgRNA 2個組分的系統，而且增加了通過修改sgRNA就能改變Cas9切割位點的便捷性的特點，使得CRISPR/Cas9基因編輯技術得以更加廣泛地應用。

圖1 CRISPR/Cas9系統的位點結構及作用機制Fig.1 The site structure and mechanism of CRISPR/cas9 system

2 CRISPR/Cas9技術在畜禽育種中的應用

作為第3代基因編輯技術，CRISPR/Cas9技術已在牛、羊、豬、雞等畜禽的遺傳、繁殖和營養等方面得到了廣泛研究應用，在提高現代畜禽的生產力、改善肉蛋生產、優化牛羊奶成分以改良現代畜禽育種體系方面展現出巨大潛力。下面總結了CRISPR/Cas9編輯技術在畜禽育種中的最新研究應用，重點闡述了該技術在豬、牛、羊、雞遺傳改良和抗病育種方面的研究進展。

2.1 CRISPR/Cas9編輯技術在豬育種上的應用

豬作為中國重要的食品家畜和大型模式動物，CRISPR/Cas9技術在其育種中的應用比較廣泛[22]，尤其是在遺傳改良和抗病育種方面，較多應用于提高豬的產肉性能和瘦肉率或增強抗高致病性、致死性病毒能力，對獲得高產優質或抗病新品種的豬展現出巨大的應用潛力和經濟價值。

在遺傳改良方面，最典型的一個例子是豬肌生長抑制素（myostatin,MSTN）基因的敲除。MSTN基因能夠負向調節生長激素家族，抑制骨骼肌生長。Wang等[23]借助CRISPR/Cas9技術成功制備了敲除MSTN的基因編輯豬，這種豬的肌間溝、舌、背和臀等部位的肌肉明顯增多。此外，線粒體中的解偶聯蛋白1（uncoupling protein-1,UCP1）能將仔豬體內的棕色脂肪轉化為熱能來維持體溫，提高瘦肉率[24]。侯連杰[24]、Zheng等[25]利用CRISPR/Cas9技術將UCP1基因插入到豬染色體上，成功獲得能抵制肥胖、增強抗寒能力的瘦肉豬。

在抗病育種方面，密集化的飼養會導致豬新舊疫病的繼發，給產業化養豬造成重大的經濟損失。目前研究人員主要是通過編輯宿主基因來抑制病毒，培育抗病的轉基因豬，其中最成功的一個應用是制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的基因編輯豬。PRRSV是一種囊膜單鏈正義RNA病毒[26]，增殖復制過程不產生dsDNA中間產物，而CRISPR/Cas9技術主要是DNA基因編輯，故病毒感染和增殖所必需的宿主基因成為CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向的優先選擇。Whitworyh等[27]研究發現，PRRSV受體和門控蛋白CD163（cluster of differentiation 163）基因敲除豬對PRRSV感染具有抗性；進一步應用CRISPR/Cas9技術構建了CD163基因第7外顯子SRCR5（scavenger receptor cysteine-rich domain 5）敲除豬，成功阻斷了生長豬和妊娠母豬及其胎兒的PRRSV感染[28]。此后的研究也證實了對PRRSV受體CD163基因進行CRISPR/Cas9基因編輯可以防止PRRSV感染和與感染相關的繁殖障礙[29-31]。

CRISPR/Cas9技術在豬其他高致死性疾病的抗病育種方面也取得了一定的進展。豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）是一種囊膜單鏈正義RNA病毒，利用CRISPR/Cas9技術成功構建以特定的靶向病毒序列的短發夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）為突變體的抗CSFV轉基因豬[32]，有效限制了CSFV在體內外的復制，且其抗病特性可以穩定地傳遞給F1代。Oh等[33]利用CRISPR/Cas9技術編輯PRRSV受體CD163，同時結合RNAi技術將靶向口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）的RNA聚合酶3D基因和PRRSV的開放閱讀框7（ORF7）基因的shRNA整合到CD163編輯的細胞中，抑制了病毒的復制，成功培育出對FMDV和PRRSV的多重抗病毒轉基因豬細胞系。綜上所述，在大多數RNA病毒（如PRRSV、CSFV和FMDV）的增殖復制過程中都不產生dsDNA中間產物，故應用CRISPR/Cas9基因編輯培育抗病豬，主要是通過靶向病毒感染所必需的宿主基因，即敲除或替換病毒感染所涉及的細胞因子或受體，從而抑制RNA病毒復制。

2.2 CRISPR/Cas9編輯技術在牛育種上的應用

大型反芻家畜牛是中國優質肉制品和奶制品的重要來源，CRISPR/Cas9技術在其遺傳改良方面已開展了大量的研究。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）基因是基于牛奶的營養價值進行研究的一個熱門靶標。BLG是牛奶中主要的過敏原，過去主要是借助核移植（SCNT）、轉錄激活樣效應因子核酸酶（TALEN）和顯微注射等手段干擾BLG基因的表達，但是過程較為復雜。2020年，Yulia等[34]利用CRISPR/Cas9技術敲除了奶牛BLG基因，培育出可分泌不含致敏性BLG基因牛奶的高營養奶牛品種。在肉質方面，通過CRISPR系統成功敲除了牛MSTN基因，不僅獲得了肌肉發達的牛品種[35]，還為后續的肌肉發育調控機制研究提供了MSTN敲除牛的骨骼肌衛星細胞模型。以上研究證實了CRISPR/Cas9基因編輯大型反芻動物的有效性和培育優質家畜的可能性，為提高反芻動物的經濟效益提供了方向。

CRISPR/Cas9技術在研究牛的抗病育種方面得到了廣泛的關注。針對病菌性疾病，特別是利用CRISPR/Cas9基因編輯培育抗溶血性支原體肺炎牛的相關研究較多，但是相對較分散。如由溶血性曼氏桿菌引起牛的肺臟組織損傷和急性炎癥，該桿菌能分泌白細胞毒素。利用CRISPR/Cas9精準編輯病菌毒素的受體基因，如白細胞表面的黏附蛋白CD18等位基因[36]，影響了白細胞毒素與CD18信號肽結合，阻止了由白細胞毒素誘導的白細胞溶解，避免了肺臟組織損傷和急性炎癥。研究發現，利用CRISPR/Cas9敲入或敲除肺臟相關的免疫內源性功能基因，如敲入天然抗性相關巨噬蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein-1,NRAMP1）基因，提高奶牛對結核分枝桿菌的抵抗力[37]；敲除抗炎細胞因子白細胞介素10受體α（interleukin-10 receptor alpha,IL-10RA）基因，促進促炎細胞因子的表達，增強對由副結核分枝桿菌引起的抗炎反應[38]。這些應用CRISPR/Cas9技術培育出的具有抗炎性的功能細胞系，不僅有助于深入研究抗炎反應的網絡調節機制，而且還可作為抗炎藥物的抗炎效果評價的細胞模型發揮作用。針對病毒性疾病，研究最多的是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的牛病毒性腹瀉。BVDV是一種單鏈、有囊膜的RNA病毒，增殖復制過程不存在dsDNA中間產物。利用CRISPR/Cas9技術靶向病毒感染所必需的宿主基因，敲除該RNA病毒的受體基因，如低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor,LDLR）[39]、1型跨膜糖蛋白CD46[40]、緊密連接蛋白（occludin,OCLN）[41]基因；敲除該病毒RNA復制所需的細胞因子，如α2抗纖溶酶（serpin peptidase inhibitor clade F member 2,SERPINF2）[42]及豬Jiv（J-domain protein interacting with virus，DNAJC14）[43]基因，都能有效防治由BVDV引起的繁殖障礙和免疫功能紊亂等疾病。另外，利用CRISPR/Cas9技術敲除病毒感染后的差異基因為疾病防控和機制研究提供了一種新的策略。史慧君等[44]利用CRISPR/Cas9技術敲除BVDV感染后細胞內的差異基因，如UDP-葡萄糖糖蛋白糖基轉移酶1（UDP-glucose glycoprotein glucosyltransferase 1,UGGT1）基因，抑制了BVDV的復制。由此可見，對于已知的感染機制，CRISPR/Cas9技術主要是通過編輯宿主基因（如病菌毒素受體基因、免疫相關的內源性功能基因和影響RNA病毒復制相關的基因）來實現對牛病菌性和病毒性疾病的防控；對于未知的感染機制，CRISPR/Cas9技術主要是通過敲除篩選出的差異基因進一步提高對疾病的機制研究，因此，創新CRISPR/Cas9基因編輯抗病牛的研究方法和應用勢在必行。

2.3 CRISPR/Cas9編輯技術在羊育種上的應用

小型反芻家畜羊是中國重要的優質肉、奶、毛制品的重要來源。CRISPR/Cas9技術用于生產基因編輯的綿羊和山羊，主要是從產肉、絨、毛、奶性狀相關的重要基因功能進行研究。在肉質方面，MSTN是首批CRISPR/Cas9目標基因，通過在肉用綿羊[5,45]和肉用山羊[5,46]中應用Cas9/gRNA介導的基因靶向編輯工具促進了肌肉生長發育。Zhou等[47]利用CRISPR/Cas9技術在綿羊細胞因子信號抑制蛋白2（suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2）基因抑制子中引入點突變，其對綿羊體重、大小和產奶量均有影響。Niu等[48]敲除β-胡蘿卜素加氧酶2（β-carotene oxygenase 2,BCO2）基因實現了綿羊羊肉黃色脂肪的增加。Wang等[49]利用CRISPR/Cas9技術敲除綿羊MSTN基因和刺豚鼠信號蛋白（agouti-signaling protein,ASIP）、BCO2 2個重要的經濟性狀基因，實現了肌纖維增大和體重增加的多重基因編輯，表明大多數重要的經濟性狀是由多個基因座控制。因此，通過CRISPR/Cas9技術能在家畜育種中有效地多重靶向是非常重要的。在絨毛品質方面，重點研究對象是成纖維細胞生長因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）基因。作為毛發生長的調節因子，該基因成為CRISPR/Cas9基因編輯羊的首選靶向基因。Li等[50]應用了CRISPR技術將無意義的密碼子滲入FGF5基因中阻斷了FGF5基因活性，提高了山羊產絨量。Zhang等[51]研究證實，綿羊FGF5基因的CRISPR/Cas9基因編輯破壞可導致羊毛長度和平均羊毛生長率的增加，同時建立的FGF5和Wnt/β-catenin等下游信號通路為改善羊毛品質提供了新思路。馮新宇[52]研究發現，分泌型糖蛋白Wnt2基因在次級毛囊形態發生誘導期表達量差異顯著，利用CRISPR/Cas9技術在綿羊細胞水平上敲除Wnt2基因后，FGF5基因表達顯著上調，推測Wnt2基因對FGF5基因的表達存在抑制作用，為應用CRISPR/Cas基因編輯技術改善羊毛品質提供了理論支撐。提高羊奶質量是羊基因改造計劃的主要目標之一。運用CRISPR/Cas9技術靶向山羊BLG基因[53]，培育了敲除BLG基因編輯山羊，生產出無BLG的羊奶。另外，通過CRISPR/Cas9技術敲除綿羊乳腺細胞中的硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1）[54]、前脂肪細胞中的乙酰輔酶A酰基轉移酶2（acetyl CoA acyltransferase 2,ACAA2）[55]基因對脂肪酸代謝產生影響，這些基因與羊奶性狀直接或間接相關，有助于開發一個天然低脂或功能性乳制品的牛奶市場。綜上所述，應用CRISPR/Cas9技術能培育出具有特定生產特性的基因修飾綿羊和山羊，有利于促進功能性羊產品的研究和大規模生產。

在增強抗病力方面，最具代表性的是利用CRISPR/Cas9系統對細胞朊病毒蛋白（prion protein,PrP）和病毒受體透明質酸酶2（hyaluronidase 2,HYAL2）基因的敲除。PrP基因與山羊傳染性海綿狀腦病的發病機制直接相關，利用CRISPR/Cas9技術靶向山羊成纖維細胞中PrP基因，產生PrP基因敲除供體細胞，能用于SCNT生產PrP基因抗性山羊[56-57]。Menchaca等[58]運用CRISPR/Cas9系統誘導HYAL2基因功能喪失，使綿羊肺腺癌綜合征得以防治。這些疾病相關基因敲除羊的產生驗證了CRISPR/Cas9系統應用于基因編輯小型反芻動物的有效性和培育抗病毒家畜的可能性。

2.4 CRISPR/Cas9編輯技術在雞育種上的應用

由于雞的受精卵結構特殊，無法直接通過SCNT獲得基因編輯個體[59-60]，所以CRISPR/Cas9基因編輯技術在雞育種上發展較為緩慢。傳統選育的重點是篩選出飼料轉化效率高、生長快、產蛋多的優質種雞，但是該過程操作繁瑣、耗時耗力且效果差。作為一種新型的解決方案，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術尋找生長速度快、飼料轉化效率高和其他理想特性（如抗病性）的遺傳標記得到了積極的應用[61]。

在肉雞行業，提高肉品產量是實現經濟效益的重要因素，Kim等[62]利用突變的CRISPR/Cas9的Cas9-D10A nickase對MSTN基因進行了有效的調控，首次建立了在雞DF-1細胞中敲除MSTN基因的方法；其次為了提高飼料利用率，可以通過減少體內脂肪來實現所需的營養物質分配，利用CRISPR/Cas9技術通過PGC介導產生的G0/G1開關基因2（G0/G1 switch gene 2,G0S2）敲除雞，解除了脂肪甘油三酯脂肪酶的活性抑制，引發甘油三酯分解，加速脂肪分解代謝，減少脂肪積累，使得腹部脂肪含量顯著降低[63]，這有利于研究雞的脂質代謝，為CRISPR/Cas9技術在工業飼料方面的實際應用和基礎研究奠定基礎。

在蛋雞產業養殖過程中生產的雛雞約一半是雌性雛雞，之后留作產蛋種雞，而另外一半雄性雛雞則會被淘汰，造成蛋雞養殖業巨大的經濟損失和優質潛能種雞的錯過。通過CRISPR/Cas9技術將表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的基因插入雞的Z染色體中，使用熒光設備鑒定表達GFP的ZW雌性與野生型ZZ雄性交配的后代，能實現高效的性別篩選，降低孵化成本[64]。另外，利用CRISPR/Cas9系統敲除雞Stra8（stimulated by retinoic acid 8）[65]和C1EIS（chromosome 1 expression in SSC）[17]基因，阻止了胚胎干細胞轉化為雄性生殖細胞，為產蛋種雞的育種研究提供了新的參考，也為利用CRISPR/Cas9技術從蛋白和蛋黃營養質量方面的研究和應用提供了新的策略，從而提高雞蛋的營養品質，降低人類患病的風險[66]。

馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）和J型禽白血病病毒（Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J）是主要的免疫抑制病毒，給養雞業造成了巨大的經濟損失[67]。傳統的選擇育種難以獲得抗病性，而CRISPR/Cas9技術提供了另一種選擇，即通過編輯病毒受體的宿主基因增強基因編輯家禽的抵抗力，如通過修飾ALV-J的功能性細胞受體的Na+/H+交換子類型1（Na+/H+exchanger type 1,chNHE1）基因，使得NHE1受體活性的關鍵氨基酸W38缺失，使雞對ALV-J產生抗性[68-71]。但是ALV-J和MDV共感染在養殖場普遍存在，MDV作為一種雞皰疹病毒，可增強ALV誘導的淋巴白血病。Liu等[67]利用ALV-J和MDV的重疊感染特性，使用MDV作為CRISPR/Cas9載體在體內切除ALV-J基因，首次使用皰疹病毒作為體內用于各種基因治療目的的CRISPR/Cas9系統的載體，為防治雞慢性病毒感染的研究和臨床試驗提供了新的方向。此外，火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkeys,HVT）[72]是馬立克氏病的活疫苗，更是一種重要的生產禽類疾病的CRISPR/Cas9重組疫苗載體，如傳染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）和禽流感（avian influenza,AI）等禽類疾病。Tang等[73]應用CRISPR/Cas9基因編輯IBDV的VP2基因敲入到HVT基因組中，得到了基于HVT的快速、高效地表達IBDV VP2蛋白的新型重組疫苗。 Li等[72]利用CRISPR/Cas9基因編輯將H7N1型禽流感病毒的血凝素（hemagglutinin,HA）基因敲入到HVT基因組中，獲得了一種重組HVT（rHVT-H7HA）的多價疫苗載體，可誘導產生HA特異性抗體，為受到高致病性H7N1-AIV攻擊的免疫雛雞提供保護，同時也對MDV攻擊具有保護作用。Liu等[74]利用CRISPR/Cas9系統構建了含H9N2-AIV的HA基因的重組HVT（rHVT-H9），誘導雞體內發生強烈的體液免疫和細胞免疫，對H9N2-AIV具有有效的保護作用。綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術為快速開發新型重組載體疫苗提供了一種有效的潛在方法，將有助于預防多種家禽疾病。

3 小 結

CRISPR/Cas9系統已成為現代畜禽遺傳育種基礎研究必不可少的工具，已經被廣泛利用產生了很多有價值的畜禽動物或細胞模型，拓寬了對相關基因及其相應的表型和功能的理解。但是將CRISPR/Cas9技術用于家畜遺傳育種也面臨著一些問題，首先是主要表現在CRISPR/Cas9技術本身存在脫靶效應、sgRNA設計及載體的運載效率等限制因素；其次，通常利用CRISPR/Cas9技術抑制病毒主要有兩種方法，即靶向病毒感染所必需的宿主基因和靶向病毒DNA以直接阻止病毒復制。但是CRISPR/Cas9系統在畜禽中抗RNA病毒感染的應用障礙為系統針對的是dsDNA而不是RNA[75]。因為CRISPR/Cas9基因編輯技術是一種dsDNA病毒基因組工程，缺乏RNA靶向活性，從而限制CRISPR/Cas9基因編輯畜禽抗RNA病毒的能力。另外，CRISPR/Cas9介導的dsDNA病毒靶向可能會在引導RNA靶向位點引入突變、插入或缺失[75]，從而導致病毒變體，這些變體可能更具致病性或抵抗力，這是CRISPR/Cas9基因編輯畜禽在抗病毒治療中存在的問題。但不可否認的是，CRISPR/Cas9基因編輯技術創新推進了畜禽育種現代化，且其在畜禽育種中的研究僅僅是起步階段，其巨大潛力將在更多的CRISPR/Cas9基因編輯畜禽中得以顯現。