豬流行性腹瀉病毒截短M基因克隆、生物信息學分析及其截短片段表達

張明亮，耿亞春，連凱琪，馬 磊，常 瑩，王雙山，張福良

（1.安陽工學院生物與食品工程學院，安陽 455000;2.河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室，安陽 455000）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的豬的高度接觸性腸道傳染性疾病，其臨床癥狀包括嚴重腹瀉、脫水和嘔吐，仔豬死亡率最高，可達90%[1-3]。該病的流行給全球養豬業帶來了巨大的經濟損失，因此,對該病的診斷和防控具有重大意義[4-6]。1971年，該病在英國首次暴發，之后迅速在歐洲各國發現[7]。1978年成功分離到該病病原體，并命名為PEDV CV777[8]。M蛋白是PEDV重要的結構蛋白之一，也是病毒囊膜蛋白中含量最豐富的蛋白。該蛋白介導了病毒的裝配，還能誘導機體產生α-干擾素。因此，PEDV M蛋白被認為是檢測和制備基因工程產品的有效候選抗原[9-10]。生物信息學分析在促進建立和完善傳染病的診斷試劑、疫苗研制及抗體工程等方面具有重要作用。然而，針對M蛋白的生物信息學分析及蛋白表達的報道很少，本研究克隆了截短的M基因（rM），分析了rM蛋白的結構特征，并對該基因進行原核表達，以期為基于該蛋白檢測及預防性生物制品的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、試驗動物、菌種及質粒 表達載體pET-28a（+）、采集于豫北某豬場的PEDV陽性病料（小腸）、PEDV陽性血清及陰性血清均由河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室保存；6月齡體重約3 kg的雌性新西蘭大白兔購自河南信誠有康生物技術有限公司；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態細胞均購自北京博邁德基因技術有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、病毒RNA提取試劑盒、pMD18-T載體、反轉錄試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ及XhoⅠ均購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒購自莫納生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白質分子質量標準均購自北京全式金生物技術有限公司；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；包涵體純化試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；ECL化學發光顯色液、辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗豬二抗均購自Proteintech公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 病料RNA提取 參照病毒RNA提取試劑盒說明書提取病料RNA，利用反轉錄試劑盒合成cDNA,-80 ℃保存備用。

1.2.2 引物設計及合成 參照GenBank公布的PEDVM基因序列（登錄號：NC_003436.1），采用DNAStar軟件進行基因的親/疏水性分析，選取親水性較好的基因片段，命名為rM，并設計合成特異性引物。 引物序列為：MF：5′-CCGGAATTCATG-ACACATTCTTGGTGGT-3′（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點）；MR：5′-CCGCTCGAGTTAGACTA-AATGAAGCACT-3′（下劃線處為XhoⅠ酶切位點）。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 截短的M基因擴增及鑒定 以得到的cDNA為模板，用引物MF、MR擴增截短的M基因片段。PCR反應體系50 μL：5×PCR Buffer 5 μL，TaqHS 0.25 μL，MF/MR各0.5 μL，cDNA模板8 μL，滅菌去離子水35.75 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到的截短的M基因連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒經雙酶切鑒定正確后，命名為pMD18-T-rM，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 rM蛋白氨基酸序列特征分析 利用生物信息學軟件分析rM蛋白氨基酸序列，預測rM蛋白的結構特征，軟件信息及功能見表1。

表1 生物信息學軟件及網址Table 1 Bioinformatics softwares and websites

1.2.5 重組菌株的構建及鑒定 將測序正確的質粒pMD18-T-rM與原核表達載體pET-28a（+）同時用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切片段并連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，小批量提取質粒，經雙酶切鑒定正確后，重組質粒命名為pET-28a-rM，將重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，將鑒定正確的重組菌株命名為BL21（pET-28a-rM）。 將原核表達載體pET-28a（+）轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，鑒定正確的重組菌株命名為BL21（pET-28a）。

1.2.6 rM蛋白的可溶性檢測及誘導表達 挑取重組菌株BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）單菌落接種于5 mL LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、200 r/min恒溫搖床培養過夜。取過夜培養菌液按比例1∶100接種于5 mL LB培養基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、200 r/min恒溫搖床培養，至D600 nm值約為0.6時，分別加入終濃度為0.5、0.8、1.0和1.5 mmol/L的IPTG進行誘導，誘導表達12 h后，取2 mL菌液，12 000 r/min離心后棄上清，PBS 10倍濃縮重懸，分別在重懸菌液中加入適量的5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。待電泳完畢，將膠塊置于考馬斯亮藍染色液中染色2 h，將染色后的膠塊置于脫色液中脫色；將誘導表達的重組菌BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）分別離心，無菌PBS洗滌2遍，適量PBS重懸沉淀。將重懸菌液置于小燒杯中，并在冰浴中超聲破碎，待菌體破碎完全時，取出菌液，12 000 r/min離心10 min，取上清及沉淀，之后用適量PBS重懸沉淀。在重懸液中加入適量的5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE檢測上清及沉淀中蛋白的表達情況。

1.2.7 rM蛋白的純化 將誘導表達的BL21（pET-28a-rM）離心，用無菌生理鹽水洗滌2遍，量取適量的生理鹽水將菌體重懸，將裝有重懸菌液的容器置于冰浴中，進行超聲破碎，待破碎完全時，取出菌液。12 000 r/min離心10 min，取適量的Binding Buffer溶解沉淀。用0.8 μm濾器過濾沉淀溶解液，將濾液加入平衡好的His標簽蛋白純化鎳柱，進行rM蛋白的純化。待濾液與柱子作用一段時間后，向柱子中加入適量洗脫液洗脫rM蛋白，最后用SDS-PAGE檢測純化后的rM蛋白。

1.2.8 rM蛋白的Western blotting檢測 將誘導表達的BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）的蛋白樣品轉印PVDF膜。結束轉膜后，將膜置于封閉液中封閉4 h。以感染PEDV豬的陽性血清為一抗，HRP標記的兔抗豬IgG為二抗，ECL發光液顯色、拍照。

1.2.9 rM蛋白多克隆抗體的制備及效價檢測 將0.5 mg純化的rM蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，背部皮下分點注射免疫新西蘭大白兔。分別在14和28 d各加強免疫一次（0.5 mg rM蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化）。在第3次免疫后的1周采集動物血液，分離血清，-20 ℃保存備用。

1.2.10 rM蛋白多克隆抗體效價檢測 將準備好的rM抗原用包被液稀釋至一定的濃度，加入96孔ELISA板，100 μL/孔，4 ℃包被過夜；PBST洗滌3遍，每次10 min，將封閉液加入96孔ELISA板，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h；將待檢測樣本按照相應稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400）加入包被好的相應的96孔ELISA板中，37 ℃孵育45 min；PBST洗滌3遍，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的HRP標記的兔抗豬二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min；PBST洗滌3遍，每次10 min，加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光顯色10 min，加入2 mol/L硫酸終止反應，100 μL/孔，酶標儀檢測各孔的D450 nm值。

2 結 果

2.1 截短的M基因擴增及鑒定

以cDNA作為模板進行PCR擴增，結果在約366 bp處觀察到目的條帶（圖1）。截短的M基因與pMD18-T載體連接、轉化后，提取質粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ進行酶切，得到大小約2 692和366 bp的條帶（圖2），與預期結果一致。測序結果表明，克隆序列與GenBank中登錄的M基因序列一致，表明成功克隆得到了截短的M基因序列。

M,DL2000 DNA Marker；1～3,截短的M基因；4，陰性對照M,DL2000 DNA Marker;1-3,Truncated M gene;4,Negative control圖1 截短的M基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of truncated M gene

M1,DL2000 DNA Marker；1,陰性對照；2,雙酶切結果；3,截短的M基因；M2,DL15000 DNA MarkerM1,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2,Double enzyme digestion results;3,Truncated M gene;M2,DL15000 DNA Marker圖2 質粒pMD18-rM酶切鑒定Fig.2 Double enzyme identification of plasmid pMD18-rM

2.2 rM蛋白理化性質分析

利用ProtParam預測rM蛋白理化性質，結果表明，rM蛋白由121個氨基酸數組成，其分子式為C575H909N153O173S2，分子質量為12.8 ku，該蛋白的理論等電點（pI）為8.89，為堿性蛋白質，氨基酸殘基中Ser（10.7%）、Thr（12.4%）頻率較高，帶負電荷殘基（Asp+Glu）總數為6個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數為8個。 其消光系數為22 460，不穩定指數（Ⅱ）為20.91（<40），屬于穩定類蛋白，因為序列的N-端是Thr，估計在體外哺乳動物網織紅細胞的半衰期是7.2 h。疏水指數為95.70，總平均疏水性（GRAVY）為0.242，屬于疏水類蛋白。 使用ProtScale中的Kyte & Doolittle對rM蛋白的疏水性進行預測（windows size=9），該蛋白序列具有較高的疏水性，在第28位氨基酸處分值最高（1.933），疏水性最強；在第99位氨基酸處分值最低（-1.844），親水性最強。主要疏水部位分布在第16-18、21-57、59-78、90-92和106-108位氨基酸處，主要親水性部位分布在第5-14、79-89、93-105和109-112位氨基酸處。因此，綜合分析該蛋白為疏水性蛋白。

2.3 rM蛋白結構分析

根據rM氨基酸序列進行保守結構域分析，保守結構域為第1-116位氨基酸。糖基化位點分析顯示，rM蛋白無N-糖基化位點和O-糖基化位點。rM共存在21個磷酸化位點，分別為12個Ser、8個Thr和 1個Tyr（圖3）。

圖3 rM蛋白磷酸化位點分析Fig.3 Analysis of phosphorylation site of rM protein

氨基酸序列分析顯示，rM蛋白無信號肽（圖4），但有跨膜區（圖5）。該蛋白含有4個B細胞線性結合位點和7個T細胞結合位點。生物信息學軟件預測結果顯示，rM蛋白二級結構主要由延伸鏈和無規則卷曲構成，占比分別為33.88%和48.76%，α-螺旋和β-轉角分別占8.26%和9.09%（圖6）。三級結構預測發現，蛋白序列與PDB數據庫中6xdc.1.A模板序列的相似性為22.09%（圖7）。

圖4 rM蛋白信號肽預測分析Fig.4 Prediction and analysis of signal peptide of rM protein

圖5 rM蛋白跨膜預測分析Fig.5 Prediction and analysis of protein transmembrance of rM protein

圖6 rM蛋白二級結構分析Fig.6 Secondary structure analysis of rM protein

圖7 三維結構同源模型Fig.7 Three-dimensional homology model

2.4 重組菌株BL21（pET-28a-rM）的構建及鑒定

用T4 DNA連接酶將回收后的截短的M基因和線性化的載體pET-28a（+）連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒后，使用XhoⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切消化，經0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約5 300和366 bp的條帶（圖8），與預期相符。測序正確的質粒pET-28a-rM轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，獲得鑒定正確的重組菌株BL21（pET-28a-rM）。

M,DL15000 DNA Marker；1,pET-28a-rM雙酶切；2,pET-28a（+）雙酶切；3，截短的M基因M,DL15000 DNA Marker;1,Double enzyme digestion of pET-28a-rM;2,Double enzyme digestion of pET-28a（+）;3,Truncated M gene圖8 重組質粒pET28a-rM酶切鑒定Fig.8 Enzyme identification of recombinant plasmid pET28a-rM

2.5 rM蛋白的表達與純化

2.5.1 rM蛋白的表達 將IPTG誘導過的重組菌株BL21（pET-28a-rM）、BL21（pET-28a）超聲破碎，進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染色2 h，脫色液脫色過夜。在約15 ku處有蛋白條帶，其中，誘導劑IPTG終濃度為1 mmol/L時蛋白表達量最高（圖9）。

M，蛋白質分子質量標準；1，空載體；2～5，IPTG濃度分別為0.5、0.8、1.0和1.5 mmol/LM，Protein Marker;1，Empty vector;2-5，The concentrations of IPTG were 0.5,0.8,1.0 and 1.5 mmol/L,respectively圖9 SDS-PAGE檢測rM蛋白表達情況Fig.9 Expression of rM protein detected by SDS-PAGE

2.5.2 rM蛋白的可溶性檢測 將重組菌株BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）置于200 r/min恒溫搖床培養，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導后，破碎菌體，對處理后的上清與沉淀進行SDS-PAGE檢測。由圖10可知，上清中無條帶出現，沉淀中有大小約15 ku的蛋白條帶，說明目的蛋白以包涵體形式存在于沉淀中。

M，蛋白質分子質量標準；1，空載體；2，沉淀；3，上清M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Supernatant;3，Precipitate圖10 rM蛋白可溶性檢驗Fig.10 Detection of rM protein solubility

2.5.3 rM蛋白的純化 將誘導后的沉淀溶解后，進行rM蛋白的純化，對收集的洗脫液進行SDS-PAGE檢測，得到了大小約為15 ku、純度較高的rM蛋白（圖11）。

M，蛋白質分子質量標準；1，空載體；2，純化后的rM 蛋白M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Purified rM protein圖11 純化蛋白rM檢測Fig.11 Detection of purified protein rM

2.6 重組蛋白的 Western blotting 檢測

以PEDV陽性血清作為一抗，對該蛋白進行Western blotting檢測,結果顯示，在約15 ku處出現了特異性條帶，表明原核表達的rM蛋白能與PEDV陽性血清發生較好的免疫反應，而對照菌株不能發生反應（圖12）。

M，蛋白質分子質量標準；1，空載體；2，重組菌株M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Recombinant bacteria圖12 Western blotting檢測結果Fig.12 Western blotting results

2.7 多克隆抗體滴度測定

以表達的rM蛋白包被ELISA板，檢測得到抗體的效價為1∶51 200（圖13）。

圖13 多克隆抗體效價測定Fig.13 Determination of polyclonal antibody titer

3 討 論

自20世紀80年代中國首次分離到PEDV之后，很多省份及地區陸續報道了該病原的感染，PEDV已成為制約中國養豬業發展的主要傳染病之一，因此對PEDV的及早診斷對于控制豬流行性腹瀉具有重要意義[11]。PEDV屬冠狀病毒科成員，具有與其他冠狀病毒屬成員相似的病毒粒子形態[12-13]。傳統的診斷方法主要實施病毒分離、免疫組化等技術，然而該病毒分離較困難，采用PEDV結構蛋白作為診斷抗原開發快速、簡便的診斷方法是目前檢測類產品發展的趨勢。M蛋白是PEDV眾多結構蛋白中較為保守的蛋白。然而研究表明，冠狀病毒的M蛋白表達較困難[14-15]。因此，有必要對該蛋白序列進行生物信息學預測與分析，選擇成熟的表達系統表達該蛋白，為進一步研究M蛋白的生物學功能奠定基礎。本研究利用生物信息學軟件對截短的M蛋白的結構及生物學信息進行了預測和分析。跨膜區預測顯示該蛋白存在跨膜區，推測該蛋白主要以包涵體形式存在，這可為后續的純化及研究奠定基礎。該蛋白存在21個潛在的磷酸化位點，推測可能與細胞內信號轉導和蛋白定位有關系。

盡管有報道指出M蛋白可通過真核表達系統進行表達，然而較低的蛋白獲得量及較高的成本限制了其應用的范圍。原核表達以其高效、低成本的優點已被廣泛應用到生物技術中。吳凌等[16]構建了攜帶PEDVM基因的原核表達載體，但該載體在多種宿主細胞中并未表達。本研究初期曾嘗試將M基因全基因克隆至原核表達載體進行表達，但未成功。Utiger等[17]研究結果表明，冠狀病毒的M蛋白在體外表達較困難，可能與M蛋白對細菌的毒性有關。Chen等[18]也通過原核表達系統對M蛋白進行了表達，但在試驗過程發現宿主菌有被抑制的現象，推測可能完整的M蛋白在細胞內蓄積之后，破壞了宿主菌的細胞壁，引起了細菌的死亡。蛋白的親/疏水性程度與蛋白的表達有密切關系[19-20]。本研究選取了M基因親水性較高的一段基因進行了表達，獲得了高純度的截短M蛋白。盡管很多研究涉及該蛋白的體外表達，但缺乏相應的條件摸索，這也可能導致了表達失敗。本研究對重組蛋白的表達體系進行了優化，在37 ℃、1 mmol/L IPTG誘導12 h的條件下rM蛋白的表達量最高。

4 結 論

本研究成功獲得了高純度、截短的PEDV M蛋白，制備了高滴度的兔抗多克隆血清，對開發基于該截短蛋白的PEDV亞單位疫苗及檢測生物制品的研發具有重要意義。