定時輸精前15天給予馬絨毛膜促性腺激素可提高后備母豬的繁殖性能

王燕春，崔貞亮（編譯）

（寧波三生生物科技股份有限公司，浙江 寧波 315000）

試驗目的：定時輸精技術是利用外源性生殖激素調控母豬的性周期和排卵的一種技術，它能夠提高母豬養殖利用率、減少非生產天數、提高養豬場管理效率。本研究的試驗目的優化這個技術的程序。

試驗結果：孕激素飼喂42 h后，eCG-15D組母豬在人工授精前的卵泡直徑大于其他組。eCG-15D組中的排卵時間同步，該組母豬全部在定時人工授精的第25天的第2次人工授精前排卵。此外，eCG-15D組母豬的妊娠率、分娩率、出生仔豬總數和活仔數最高。該項研究的結果表明，在常規定時人工授精前15 d用馬絨毛膜促性腺激素預處理母豬可以優化生殖性能。

1 介紹

定時輸精（Fixed-time artifi cial insemination，FTAI）是一種無需發情識別即可輔助繁殖的有效技術，它使用外源性生殖激素來調控母豬的性周期，包括發情和排卵的時間。因此，該技術可以幫助解決養豬業規模化發展帶來的母豬隱性發情率高、養殖利用率低的問題。

使用FTAI時，后備母豬的窩產仔數明顯不同。例如，對飼喂烯丙孕素（Altrenogest，ALT）后備母豬繁殖性能的分析表明，窩產仔數和活產仔數顯著改善。同樣，用烯丙孕素ALT和促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）類似物處理后，豬的發情率和仔豬初生體重顯著增加，但是產仔數沒有變化。另一項最新研究發現，停止ALT處理后，肌肉注射馬絨毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotropin，eCG）和豬促黃體生成素可縮短產仔時間，但會降低窩產仔數。在實踐中，FTAI的生育率結果存在相當大的差異。試驗小組之前的一項研究發現，當兩種母豬接受相同的FTAI方案處理時，處在發情期的母豬表現出更強烈的發情反應和更高的妊娠率。因此，母豬的卵巢狀況可能會極大地影響FTAI的效率。

eCG通過促進卵泡發育、促進排卵和卵巢黃體化發揮雙重功能，類似于促卵泡激素（Folliclestimulating hormone，FSH）和促黃體激素（Luteinizing hormone，LH）。根據之前試驗中使用的eCG處理濃度（800～1 000 IU)，發現用eCG處理母豬可以有效促進卵泡發育，在注射eCG后第5天排卵。 因此，在FTAI之前用eCG對后備母豬進行預處理，以誘導激素控制母豬的發情周期，從而提高繁殖性能。值得注意的是，在開始FTAI前15 d和20 d注射eCG，根據母豬的發情周期時間分別同步使后備母豬進入卵泡期和黃體期。

在該研究中，旨在通過在孕激素飼喂前15 d或20 d給后備母豬注射1 000 IU馬絨毛膜促性腺激素來優化傳統的定時人工授精程序。進行常規定時人工授精后，監測和分析卵泡發育、排卵和生殖激素水平，為優化后備母豬定時人工授精程序提供基礎。

2 試驗設計

2.1 動物和管理

該項試驗使用190日齡、90 kg體重的健康大白×長白二元雜交母豬（n=166），這些母豬的生殖狀況未知。試驗期間，將母豬隨機分為不同的組，并在相似的環境下放置到不同的欄位進行繁殖。母豬可以自由飲水，并獲得由相同批次的玉米、豆粕、菜籽粕和麥麩制備的相同飼料（表1）。在eCG-15D、eCG-20D和對照組中，采用6頭（12月齡～36月齡）已證實有生育能力的公豬精液。使用計算機輔助精液分析儀——CASA系統測定這些精子的活力和濃度。只選擇精子活力超過70%，正常形態大于90%或更好的精液。評估測定結束后，立即將每1份精液在37℃的商品稀釋液中充分稀釋，最終按照體積每80 mL含有3×109個精子細胞的劑量儲存。在人工授精（AI）后的第25天，用超聲波檢查母豬是否懷孕。如果無法確定懷孕情況，則在第1次檢查后10 d對母豬進行重新檢查。

表1 試驗豬日糧的組成、化學成分和營養價值（以干物質為基礎）

2.2 試驗程序

試驗設計和程序如圖 1 所示。后備母豬隨機分為三組：對照組（CON，n = 62）、eCG-15D 組（n = 50）和 eCG-20D 組（n = 54）。Altrenogest、eCG、GnRH均購自中國浙江寧波三生生物科技，除ALT外其他采用肌肉注射。 eCG-15D 組（n = 50）豬在FTAI前15 d注射1 000 IU eCG，而eCG-20D組（n = 54）豬 在FTAI前20 d注 射1 000 IU eCG。簡而言之，豬口服烯丙孕素ALT（每頭豬每天20 mg），持續18 d，然后在停止烯丙孕素ALT飼喂后42 h，給母豬注射由1 000 IU組成的eCG，然后100μg GnRH 80 h后。后備母豬在注射GnRH 24 h后第1次授精，16 h后再次授精。24 h后對有站立反應的后備母豬再進行授精。在FTAI的第20天（停止ALT后42 h）收集血樣，并在第1～3天和第20～26天使用超聲監測卵泡發育。

圖1 定時輸精程序

2.3 卵泡發育和排卵檢測

在第1天至第3天和第20天至第26天，使用5 MHz凸面換能器（HS-1600，日本豐橋本田電子有限公司）對每組16頭母豬每天進行兩次經腹超聲檢查（上午08：00和下午14：30），以檢測每頭母豬卵巢中的卵泡發育。當大小為6～9 mm卵泡消失時，界定為發生排卵。直徑大于12 mm且連續幾天可見的卵泡被定義為囊性卵泡。從隨后的分析中排除了來自具有多個囊性卵泡的母豬的數據。

2.4 采血和激素分析

在停止ALT喂養后42 h進行采血。處理后備母豬后，使用10 mL 注射器從頸前靜脈采集血樣，并轉移到5 mL凝血管中30 min。血液凝固后，樣品以1 000 g離心4 min，將血清分離到離心管中并儲存在-20℃的冰箱 中。LH （JM-10117P1）、黃體酮（P4，JM-01368P1）和雌二醇（E2，JM-01314P1）使用酶聯免疫吸附法進行分析，檢測范圍分別為22-800 pmol/L、8-200 pmol/L和20-500 pg/mL。使用購自日本Cosmo Bio的商業試劑盒直接分析FSH（CSB-E06791P），檢測范圍為20-700 IU/mL。

2.5 數據

所有母豬的發情檢測都是通過觀察紅腫的外陰和有無站立的反射來進行的。發情檢查每天進行2次（上午08：00和下午16：00）。與成熟公豬進行鼻對鼻接觸和背壓試驗，以檢測母豬的發情，表現出站立反應即被認為是發情。當排卵前6～9 mm大小的卵泡消失時，排卵被認為已經發生。在分娩日，母豬自然生產。

2.6 數據分析

首先測試卵泡發育數據的正常性，然后使用SAS的混合程序進行分析。LSMEANS聲明中包括通過Turkey方法調整的PDIFF選項，以說明處理之間的多重比較。處理之間的差異在P＜0.05時顯著差異。使用卡方檢驗分析比較了后備母豬的排卵時間分布及其發情、排卵和妊娠率，P＜0.05時顯著差異。

3 結果

3.1 固定時間人工授精期間替代后備母豬的卵泡發育和激素水平

第1天的超聲分析顯示eCG-15D組的卵巢中有黃體，但在eCG-20D組中沒有（圖2C 和2D），而在CON組中觀察到黃體和卵泡（圖2A和2B)。此外，還測量了整個FTAI的卵泡直徑，發現第1天eCG-15D、eCG-20D和CON組的平均卵泡直徑分別為2.63 ± 0.15 mm、3.20 ± 0.15 mm和3.45 ± 0.15 mm，圖2E）。這些結果表明，每組后備母豬的卵巢在FTAI開始時處于不同的階段。在烯丙孕素ALT飼喂18 d內卵泡生長受到抑制，但eCG-15D組的卵泡直徑增加（2.90 ± 0.15 mm）至高于eCG-20D的水平（2.60 ± 0.15 mm，P＜ 0.05），對照組CON（2.50 ± 0.15 mm，P＜0.05)在停止ALT喂養后42 h（第20天）。第20天下午處理后，3組卵泡均開始發育，體積明顯增大。值得注意的是，在D24-PM（第1次人工授精）時，eCG-15D（6.10 ± 0.15 mm）組的平均卵泡直徑顯著高于其他2組（eCG-20D：5.80 ± 0.15 mm；CON：5.46 ± 0.15 mm；圖2B）。

圖2 各組后備母豬卵泡發育趨勢

3.2 母豬人工授精前激素變化與排卵時間

評估ALT飼喂停止后42 h激素水平的變化以及后備母豬在被AI處理之前的排卵。有趣的是，eCG-15D、eCG-20D和CON組 的后備母豬中E2、LH和P4沒有差異（P＞ 0.05，圖3A、3B、3C）。然而，eCG15D組的FSH水平低于CON組（P＜ 0.05，圖3D）。此外，eCG-15D組后備母豬的排卵時間集中在1 d內，而eCG-20D和CON組的排卵時間分別分布在2 d和4 d（圖3E）。3組都是在第25天早上的排卵率最高，分別為87.5%（eCG-15D組）、56.25%（eCG-20D組）和43.75%（CON組）（圖3E）。

圖3 各組后備母豬激素水平變化

3.3 定時輸精對后備母豬繁殖性能的影響

分析了FTAI對繁殖性能的影響，如表2所示。盡管eCG-15D組的發情（96%）、妊娠（92%）和分娩率（90%）略高于其他組，但差異無統計學意義。然而，eCG-15D組的所有小母豬在第1次授精后24 h內排卵，高于eCG-20D組或CON組（CON組和eCG-20D組為81.25%，P＜ 0.05）。此外，在eCG15D組中出生的仔豬總數和活仔數明顯高于eCG-20D組或CON組（表2）。

表2 不同處理組的后備母豬的繁殖性能

4 討論

FTAI是一種有效的輔助繁殖技術，通過使用外源生殖激素來調控母豬的性周期，以解決與養豬業大規模發展相關的隱性發情率高和配種利用率低的問題。然而，母豬的卵巢狀況會極大地影響FTAI的效率。以往用eCG治療母豬可以刺激卵泡生長和排卵，有效促進卵泡發育，提高繁殖性能。因此，在該項研究中，旨在通過在烯丙孕素ALT喂養前15或20 d給后備母豬注射eCG來優化傳統FTAI程序。

盡管有報道稱，在用eCG處理母豬后，存活數和窩產仔數沒有顯著增加，但注射eCG 可以促進卵泡發育提高繁殖性能，并已廣泛應用于養殖業。以前的研究表明，725～1 000 IU eCG 可以將后備母豬的發情率提高到70%～100%，而363～600 IU eCG只能達到25%～52%。因此，在本研究中選擇了1 000 IU eCG 進行預處理。在早期的研究中，試驗數據顯示，在注射eCG 5 d后FTAI可達到最大水平。同時，E2、LH和FSH在第5天急劇增加，eCG組處理后5～6 d排卵。因此，eCG在后備母豬中誘導了發情周期，并使卵泡發育和排卵時間同步。根據母豬的繁殖周期，假設后備母豬的卵巢在排卵后第10天處于黃體期，在排卵后第15天處于卵泡期。因此，在預處理后15 d和20 d進行了FTAI操作，以探討不同卵巢狀態對后備母豬FTAI功效的影響。

當FTAI定時輸精程序開始（第1天）時，eCG-15D組的卵泡平均大小＜3 mm，這表明在eCG注射1～15 d后，卵泡將出現在黃體期。eCG-20D組和CON組的母豬卵泡大小與eCG-15D組相似，這表明eCG-20D組和CON組的母豬卵巢中出現了正在發育的卵泡。結合超聲波分析結果，得出結論，eCG-20D組的母豬處于卵泡期，而CON組的母豬同時處于黃體和卵泡期。ALT飼喂18 d后，3組的卵泡都同步到相同的水平，其直徑小于3 mm，這表明ALT有效地阻止了中小型卵泡的發育，以控制同步發情。與預期相同，eCG-15D組在eCG注射后（第20天）卵泡直徑最大，與Soede的結果一致。由于eCG具有促卵泡活性，而GnRH可以有效改善LH分泌，促進優勢卵泡的最終成熟和排卵，因此在eCG注射后（第20天），卵泡直徑往往會隨時間增加。肌肉注射GnRH后，3組母豬的卵泡直徑增加至觀察到的最大水平，然后在人工授精后第2天（第26天）再次降至3 mm以下，表明排卵已經結束。

后備母豬受孕主要取決于排卵和受精的時間。理論上，精子在受精后24 h表現出最佳生育能力；因此，早期或晚期受精都可能會對母豬的生育能力產生負面影響，從而導致懷孕次數減少、受精率降低，并降低胚胎存活率。由于人工授精在第24、25天的下午和上午進行，最佳排卵時間應該在第25天。研究發現eCG-15D組的排卵率在第25天最高（94.5%），在24 h內完成排卵，表明排卵更加集中和同步。然而，研究還發現eCG-20D組和CON組的18.9%和6%小母豬分別在25 d后排卵（圖3E），因此錯過了受精的最佳時間。卵泡發育和排卵時間差異的原因與后備母豬的激素分泌密切相關。因此，在停止烯丙孕素ALT喂養后42 h收集了血液樣本，以測量激素水平的變化。盡管FSH水平在eCG-15D組中最低，但它們也具有最高的均勻性（圖3D）。這可能是由于以下事實: FSH在eCG-15D組的后備母豬中不僅被外源性ATL補充抑制，在黃體期分泌的內源性孕酮也被抑制。此外，通過eCG和GnRH治療進一步改善了小母豬的卵泡發育和排卵。

eCG-15D組的繁殖性能顯著改善，包括排卵率、產仔數和活產仔數。同樣，該組的發情和懷孕率會更高；這些變化在統計學上并不顯著，這可能是因為母豬數量較少。eCG-15D組母豬的超聲波監測進一步顯示，它們的卵泡發育和排卵時間優于其他組，因為它們在FTAI開始時處于黃體期。此外，eCG15D組的所有母豬都在第2次輸精前完成排卵，這可能解釋了與其他組相比，eCG15D組的妊娠率和產仔數更高。綜上結果表明，FTAI前15 d注射eCG可以改善母豬的繁殖性能和強化管理。

原文題目：《Equine chorionic gonadotropin pretreatment 15 days before fixed-time artificial insemination improves the reproductive performance of replacement gilts》

原文作者：Q Zhao，C Tao， J Pan， Q Wei，Z Zhu， L Wang， M Liu，J Huang ， F Yu，X Chen，L Zhang， J Li

原文出處：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34844186/PMID: 34844186DOI: 10.1016/j.animal.2021.100406