豬體細胞克隆和基因編輯技術研究

張 展，劉 芳，陳淑慧

（1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2.佛山科學技術學院馬克思主義學院，廣東 佛山 528000）

體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）是一種將已分化的細胞重編程恢復其全能性，進而生產與供體細胞基因型完全相同后代的無性繁殖技術。包括收集并成熟卵母細胞，供體細胞核處理，重構胚的體外激活，胚胎的培養和移植等過程。豬的SCNT技術的建立在農業和醫學有廣泛的應用。

基因編輯技術（Gene editing technology）是指利用基因工程的基本原理對動物基因組的靶向基因進行有目的的編碼修飾，并結合體細胞克隆和胚胎移植等技術手段，獲得經過基因修飾的個體且可穩定遺傳給子代的一種生物技術。此技術不僅克服了大型動物在傳統育種方面存在的周期長、遺傳效力低等問題，而且在抗病性、肉質改善、動物福利及動物疾病模型等研究上都有重要突破。CRISPR/Cas9系統是目前應用最廣泛的基因編輯技術。文章將對豬體細胞克隆技術進行概述，從影響其效率的因素應用以及同基因編輯的聯系等方面進行綜述。

1 豬SCNT概述

關于克隆豬的發展早期開始于1989年，當時的研究者將減數分裂中期的卵母細胞中形成的致密morula或blastocys:stage共88個核移植胚胎移植到受體中繼續發育，1頭小豬出生。研究表明，細胞核在轉移到去核的、激活的減數分裂中期的卵母細胞后能夠直接發育到足月。1995年，有研究將低溫保存的原始生殖細胞作為核質體在豬體內進行核移植。實驗表明低溫保存的原始生殖細胞能夠在72 h內進行核重組和卵裂，或者在體外孵育到4細胞期，然后將核轉移到去核、激活（S-）或M II期卵母細胞。1997年世界首例體細胞克隆動物——綿羊“Dolly”的誕生標志著哺乳動物體細胞克隆進入一個新的時代。然而，豬的體細胞核移植技術發展較為緩慢。美國研究員Polejaeva2000年研究并報道了從培養的成年體細胞群中克隆出仔豬。國內方面，東北農業大學于1999年成功獲得體細胞克隆豬囊胚，直至2005年我國第1頭體細胞克隆豬誕生，其在國內克隆技術發展歷程上具有里程碑意義。近年來豬的體細胞核移植技術逐漸完善，國內越來越多的研發機構通過體細胞克隆獲得仔豬，比如，廣西特色小型豬、巴中土豬、太湖豬等。

2 影響豬SCNT技術的因素

近年來雖然在豬的體細胞克隆上取得了不錯的研究進展，但是考慮其整體的效率，仍舊不理想，這主要與不同供體細胞的來源、卵母細胞的成熟質量、胚胎移植操作等方面有關系。

2.1 供體細胞的影響

在體細胞克隆研究中，已經發現通過胎兒成纖維細胞、腎臟細胞、心臟細胞、顆粒細胞、成年豬皮膚成纖維細胞等成功得到了克隆豬，但是不同的供體細胞來源對體細胞克隆的效率有一定影響。潘登科等人利用胎兒成纖維細胞、成年豬耳成纖維細胞和顆粒細胞進行細胞核移植，結果表明，使用胎兒成纖維細胞和顆粒細胞作為核供體的重構胚融合率（72.7%vs.81.5%）與耳成纖維細胞的對應結果差異顯著（62.8%）；Li，Z等以3種類型的供體成纖維細胞在克隆豬的大規模生產中進行了測試，結果表明使用胎兒的成纖維細胞可以顯著提高克隆胚胎的妊娠率和分娩率。Tianbin Liu等研究結果表明胎兒成纖維細胞導致重構胚胎率較低（30.38%比37.94%、34.65%和34.87%），但總體效率更高。Z.Hua等利用梅山豬胎兒成纖維細胞成功克隆了克隆豬，其克隆效率優于初生仔豬和成年豬成纖維細胞，表明核供體細胞系對梅山豬克隆胚胎的發育能力和克隆效率均有顯著影響。從以上研究結果不難看出，在克隆豬方面，雖然有多種細胞形態可以作為供體細胞進行克隆，但是最為理想的供體細胞仍然是胎兒成纖維細胞。

2.2 受體細胞的影響

通過體外采集到的卵母細胞對豬SCNT的影響主要表現在其成熟后卵母細胞的品質，在實驗研究中通常采用體外培養成熟和體內自然發育成熟的卵母細胞。理論上講，自然發育成熟的卵母細胞要比體外培養成熟的卵母細胞更為理想，但是體內發育成熟的卵母細胞難以獲取且價格昂貴；體外培養成熟的卵母細胞雖然價格便宜、易獲取，但是移植效率低。有研究表明，以體內和體外成熟卵母細胞作為核移植受體構建的克隆胚胎二者的胚胎融合率和卵裂率均無顯著差異，但體內成熟卵母細胞囊胚率高于體外成熟卵母細胞。然而，在臨床試驗或者實際應用中仍然以體外成熟的卵母細胞作為核移植受體的主要來源。在馬的相關研究中，有研究表明，供體動物的年齡以及細胞的儲存條件和時間對卵母細胞的質量有很大影響。在克隆豬方面，有研究表明卵丘細胞會影響卵母細胞內的谷胱甘肽合成，影響卵母細胞成熟后的品質。

此外，豬卵母細胞成熟的又一影響因素是卵泡液的成分。根據不同質量的卵母細胞制訂最優的體外成熟方案，有助于獲得較高的成熟率。有實驗研究表明黃芩苷可以通過抑制促凋亡相關基因（Bax）mRNA，提高卵母細胞體外成熟能力和質量。用甲基-β環糊精（CLC）預處理可以提高豬卵母細胞的存活率和成熟率。JiEunPark等發現軟性瓊脂糖基質能有效抑制卵母細胞和胚胎的凋亡。

2.3 胚胎移植數量和方法對SCNT效率的影響

胚胎移植技術是影響克隆豬生產效率的諸多因素中最為重要的因素之一。進行核移植后的重構胚，融合激活，在體外培養后通過腹腔鏡微創手術、開腹手術或非手術方法等移植到代孕母豬的子宮內，發育成為個體。肷窩部開腹手術的方法是目前應用最多的豬胚胎移植方法，其易于學習操作簡單，但是開腹手術可能導致腸壁、腹膜等粘連的風險，且在手術中應考慮的諸多因素，比如麻醉、術后護理等都會對胚胎移植的效果造成影響，不利于代孕母豬的再次利用。2014年有研究對手術法胚胎移植進行優化，在一定程度上提高了克隆效果。非手術方法胚胎移植最早的成功案例在1989年，但是至今仍沒有廣泛應用，主要是因為母豬的子宮頸皺褶和子宮彎曲。2004年，國外某科研機構發明了一種新的非手術胚胎移植器械，并報道其在代孕母豬的妊娠率達到70.8%，平均窩產仔豬6.9頭。有研究表明通過非手術子宮深部移植的產仔率和產仔數增加了更多的玻璃化胚胎的功能，且代孕母豬的胎次不影響其生殖性能，并不影響代孕母豬重新引種到豬場做種畜的繁殖潛力。以上的研究為非手術胚胎移植在豬只的廣泛應用提供了新的可能性。

此外，豬是多胎動物，每窩懷孕3～5胎以上才能夠維持妊娠，所以胚胎移植數目對克隆的效率起到一定的決定作用，有研究表明將過量的（250～450個）克隆胚胎移植到個體代孕者身上對提高效率并無作用，移植到個體受體上的重構胚胎的最優數量為200～249個。CholHoRim等研究表明，與移植150～200個或超過200個的胚胎相比，100～150個的胚胎移植導致懷孕率顯著升高，該研究沒有一次移植更多的胚胎作為對比，且該研究認為與單側輸卵管移植相比，雙側輸卵管移植顯著提高了母豬繁殖效率，此結論目前尚有爭議，且雙側移植臨床上不便操作。

3 基因編輯和豬SCNT的應用

理論上講，基因編輯技術和轉基因技術是不同的。近年來，轉基因技術特指將外源基因轉入到受體生物中的技術，而狹義的基因編輯則相對地特指轉基因之外的對生物體基因組目標基因的特定修飾。2002年以克隆胚胎成纖維細胞系作為核供體，用去核豬卵母細胞重建胚胎的首例基因敲除豬誕生。除了SCNT方法外，成功獲得轉基因豬的技術還有原核顯微注射法、逆轉錄病毒載體法、精子載體法等。但是，目前就整體效率而言，SCNT仍然是獲得轉基因動物的主要方法。近年來隨著包括鋅指核酸酶技術（ZFNs）、轉錄激活子樣效應因子核酸酶技術（TALENs）及CRISPR/Cas9技術等多種基因高效靶向修飾和調控技術的發展，為基因修飾豬構建研究提供了技術支持，同時也為其在生物學、醫學領域展開更多深入的研究打下基礎。

豬體細胞克隆技術首先可用于畜牧業，作為一種方便、有效的方法來提高種群的質量，加速遺傳改良；同時保護瀕危滅絕物種是體細胞克隆的另一個潛在應用。為了達到高質量豬肉蛋白供應，可通過基因編輯和SCNT技術相結合培育滿足理想生產性能的豬，提高豬的抗病能力，改善豬肉營養價值和豬肉生產，例如：抗豬藍耳病的基因編輯克隆豬、增加對非洲豬瘟抗性克隆豬等。

其次，豬的SCNT技術和基因編輯技術相結合在醫學領域也有廣泛的應用，隨著以 CRISPR/Cas9 為主的多種CRISPR系統的不斷研發和改進，基因編輯技術逐漸完善，對人類疾病動物模型的制備有重要意義。為某些人類疾病的發病機理、病理變化、臨床癥狀以及治療等的研究提供參考。也可制作轉基因豬生物反應器，利用膀胱、乳腺等合成人生長激素、重組蛋白、藥用蛋白和重組抗體等。自20世紀80年代中期引進慢性免疫抑制藥物以來，臨床移植已成為終末期器官衰竭的首選治療方法之一。解決人體器官供應有限問題的一種新方法是利用替代物種作為器官來源。出于對倫理、繁殖特性、傳染病、解剖結構以及生理功能的考慮，并且小型豬在外科操作上更加便利，豬被認為是主要的替代物種。通過基因編輯獲得克隆豬的心、腎等器官，可以使異物種器官移植后隨之而來的超急性排斥反應大大降低。

4 小結

自2000年第1頭體細胞克隆豬誕生以來，雖然體細胞克隆技術不斷更新、發展，相關理論研究和技術優化也取得長足進展，但是目前該技術相關機制仍不明確，生產效率低，新生仔豬會仍出現器官發育異常、呼吸困難、骨骼發育不完善等先天性疾病。造成這些情況的原因有很多，例如文中所述，但普遍認為是表觀遺傳學重編程不完全或異常造成。相信隨著SCNT技術的不斷深入研究、完善，并且隨著新的基因編輯技術的不斷創新，促進基因修飾豬的研究新發展，廣泛應用于豬的精準育種以及生物醫學領域，并取得一定的成果。