乳酸菌混合發酵毛酸漿果汁工藝優化及發酵特性分析

王柳岑，朱永樂，鞠葛金悅，劉至立，李美瑩，王晶晶

（錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121000）

毛酸漿（Physalis pubescens L.）為茄科酸漿屬一年生草本植物，其果實顏色金黃，外形圓潤，俗稱黃菇娘，味道酸甜可口，是我國東北地區一種營養豐富的應季水果。研究表明，毛酸漿富含黃酮、多酚等多種功能性成分，具有抗炎、提高免疫力等多種功效[1-3]，是一種極具開發潛力的漿果。目前市場上毛酸漿的深加工產品少，主要是果汁、罐頭、果醬和果脯等初級加工產品[4-8]。大量研究表明，乳酸菌發酵可以改善果蔬汁的品質、風味和抗氧化活性[9-12]。另外，乳酸菌具有調節腸道pH 值、保護腸道、抑制腫瘤和預防腹瀉等生理功效，因此乳酸菌發酵果蔬汁的研制成為近年來的研究熱點[13-16]。國內學者分別采用植物乳桿菌、短桿乳桿菌、副干酪乳桿菌等對葡萄汁、獼猴桃果汁、樹莓汁和拐棗汁等進行了單一菌種或者復合菌種的發酵工藝研究，均取得了較好的效果[16-20]。本團隊前期研究表明，植物乳桿菌發酵毛酸漿果汁經體外消化后，乳酸菌仍具有很好的活力，果汁中多酚含量和抗氧化活性均較高[21]。有學者分別比較了植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等常見益生菌在毛酸漿中的單株發酵特性，對乳酸菌復合酵母菌發酵工藝進行了研究，但未對植物乳桿菌和副干酪乳桿菌的復合發酵工藝進行研究，其發酵后抗氧化成分及主要氣味變化也尚未明確[22-24]。

本研究通過單因素和響應面試驗設計，對植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發酵毛酸漿果汁的工藝配方進行了優化，對發酵前后果汁理化指標、抗氧化成分（黃酮和多酚）以及氣味進行了檢測，為乳酸菌發酵毛酸漿果汁類產品的開發提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

毛酸漿，購于遼寧省錦州市；植物乳桿菌1.1856（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿1.9089（Lactobacillus paracei），錦州醫科大學實驗室保存。

亞硝酸鈉、福林酚、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純；沒食子酸（標準品，純度≥98%）、蘆?。藴势?，純度≥98%），購于索萊寶生物科技有限公司；MRS 液體培養基，購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.2 儀器與設備

RBM-615 型榨汁機，德國瑞本公司；UV-1800 型分光光度計，日本島津公司；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-250 型生化培養箱，上海一恒科技有限公司；HH-4D 型恒溫水浴鍋，上海比朗儀器制造有限公司；WTY-A 型手持糖度儀，成都豪創光電儀器有限公司；PEN3 型電子鼻，德 國Airsense Analytics Gmbh 公 司；ZHJH-112 型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；HR/T20MM 型立式冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；FA2004N 型電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毛酸漿果汁的制備

挑選新鮮無壞果的毛酸漿果實，清洗去宿萼后榨汁，一層濾布過濾，82 ℃滅菌15 min。

1.2.2 毛酸漿果汁發酵

取出保存在甘油管中的乳酸菌，接種于MRS 液體培養基中，置于37 ℃培養箱靜置培養12 h，活化2代。將不同菌種比例的菌液配比后，以107CFU/mL的菌密度接入毛酸漿果汁中，于封口玻璃瓶中培養，37 ℃靜置發酵24 h，每6 h 取樣進行綜合評價。

1.2.3 綜合評價

1.2.3.1 感官評價

參考仵白敏[17]的方法，隨機挑選受過相關訓練的10 人，采取隨機抽樣的方式，分別對發酵果汁的色澤、組織狀態、氣味、口感、酸甜度5 個項目進行感官評價，評分標準如表1 所示。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation scoring criteria

1.2.3.2 抗氧化性評價

由于毛酸漿富含具有抗氧化性的黃酮、多酚等功能性成分，因此對黃酮和多酚的含量進行了檢測，評分標準如表2 所示。

表2 抗氧化性成分評分標準Table 2 Antioxidant composition scoring criteria

1.2.3.3 綜合評分的確定

將黃酮含量、多酚含量和感官品質3 項指標擬合而成綜合評分。綜合評分權重的確定是采用專家評分的方法，即請專家對3 個指標（總和為100 分）的重要度進行評分，確定3 項指標的權重系數分，具體如表3 所示[25]。

表3 指標的專家權重評分結果Table 3 Weight scoring results of indicators by experts

綜合評分=0.50×感官評分+0.25×總黃酮含量評分+0.25×多酚含量評分

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 復合菌種接種比例試驗

在接種量1%（V/V），發酵時間12 h 條件，調整植物乳桿菌與副干酪乳桿菌的接種比例（后文簡稱菌種比）分別為0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0（V/V）（配比后菌密度107CFU/mL），對制備的乳酸菌混合發酵毛酸漿果汁進行綜合評價。

1.2.4.2 復合菌種接種量試驗

在菌種比例2∶1（V/V），發酵時間12 h 條件下，調整菌種接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（V/V），對制備的乳酸菌混合發酵毛酸漿果汁進行綜合評價。

1.2.4.3 復合菌種發酵時間試驗

在菌種比例2∶1（V/V），接種量1%（V/V）條件下，調整發酵時間分別為0、6、12、18、24 h，對制備的乳酸菌混合發酵毛酸漿果汁進行綜合評價。

1.2.5 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，進一步采用Box-Behnken Design（BBD）試驗設計對3 個發酵因素進行優化，試驗設計見表4。

表4 響應面試驗因素水平表Table 4 Factor and level of response surface test

1.2.6 測定項目與方法

1.2.6.1 乳酸菌活菌數

根據GB 4789.35—2016[26]進行乳酸菌計數。

1.2.6.2 發酵指標

pH 值：使用pH 計測定；總酸含量：參照GB/T 12456—2021[27]中的方法測定，總酸度以乳酸計算；可溶性固形物含量：使用手持糖度儀測定；總糖含量：采用DNS 比色法[28]測定，標準曲線為：y=0.639 9x-0.074 6，R2=0.997 9。

1.2.6.3 總黃酮和多酚含量

總黃酮含量：參考雷靜文等[29]的方法測定；多酚含量：采用Folin-Ciocalteu 檢測法[30]測定。

1.2.6.4 電子鼻檢測

參考韓雪等[31]的方法，對樣品進行電子鼻檢測，儀器參數：載氣流速100 mL/min，清洗時間100 s，檢測時間60 s，樣品準備時間5 s，自動調零時間5 s，選擇58 s 時的響應值用于數據分析。對新鮮果汁、滅菌后的新鮮果汁、發酵果汁和滅菌后的發酵果汁4 個樣品進行檢測，滅菌方法采用巴氏滅菌法。

1.2.7 數據處理

數據均以xˉ±s 表示，采用Excel 2010 和SPSS 26.0進行統計分析，采用Origin2018-64 繪制圖。響應面試驗設計采用Design Expert 10 軟件，揮發性氣味成分采用WinMuster 軟件分別進行PCA、Loading 和LDA 分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

如圖1～3 所示，菌種比、接種量和發酵時間均對毛酸漿果汁的綜合評分有很大影響，菌種比為2∶1時，發酵果汁的綜合評分最高，為（25.8±0.48）分（圖1）；隨著接種量和發酵時間的增加，發酵果汁的綜合評分呈先上升后下降的趨勢，當接種量和發酵時間分別超過1.0%和12 h 時，由于發酵果汁過酸使感官評分下降，導致綜合評分下降（圖2～3）。因此，選取菌種比2∶1，接種量1.0%和發酵時間12 h 為響應面優化試驗中的0 水平。

圖1 復合菌種接種比例對毛酸漿果汁綜合評分的影響Fig.1 Effect of inoculation ratio of mixed starins on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

圖2 復合菌種接種量對毛酸漿果汁綜合評分的影響Fig.2 Effect of inoculation concentration of mixed starins on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

圖3 復合菌種發酵時間對毛酸漿果汁綜合評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time of mixed strains on comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面優化發酵工藝試驗

根據單因素試驗的結果，以菌種比（A）、接種量（B）和發酵時間（C）為自變量，響應面試驗設計和結果見表5，方差分析見表6。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Response surface test design and results

表6 回歸模型的方差分析Table 6 ANOVA for the regression models

對表5 中的試驗數據經多元回歸分析，得到發酵毛酸漿果汁綜合評分（Y）對菌種比（A）、接種量（B）和發酵時間（C）的回歸方程為：

Y=26.01+0.49A+0.96B+0.34C-1.26AB-0.82AC-1.52BC-1.69A2-1.21B2-1.60C2

由表6 的方差分析結果可知，該試驗模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著，決定系數（R2）為0.971 8，調整決定系數（R2adj）為0.935 6，說明該回歸方程具有良好的擬合度和可信度[32]，因此該回歸方程可用于毛酸漿果汁發酵結果的理論推測。其中，A、AC 對發酵毛酸漿果汁綜合評分的影響顯著（P＜0.05），B、AB、BC、A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01）。影響發酵毛酸漿果汁綜合評分各因素的主次順序依次為：B（接種量）＞A（菌種比）＞C（發酵時間）。

圖4～6 為兩兩因素之間的響應面曲線圖。通過分析可知，菌種比（A）、接種量（B）和發酵時間（C）任意兩因素間的組合，其綜合評分皆隨工藝參數的提高而呈現先增加后下降趨勢，特別是AB 和BC 組合，其曲面變化陡峭，這與方差分析結果一致，說明本試驗參數選擇合理，在選定范圍內的參數進行發酵工藝的優化，能夠得到最佳的綜合評分。

圖4 菌種比和接種量的交互作用對毛酸漿果汁綜合評分影響的響應面曲線圖Fig.4 Response surface map of the effects of the interaction of strain ratio and inoculum amount on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

2.2.2 最佳發酵工藝的確定

圖5 菌種比和發酵時間的交互作用對毛酸漿果汁綜合評分影響的響應面曲線圖Fig.5 Response surface map of the effects of the interaction of strain ratio and fermentation time on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

圖6 接種量和發酵時間的交互作用對毛酸漿果汁綜合評分影響的響應面曲線圖Fig.6 Response surface map of the effects of the interaction of inoculation amount and fermentation time on the comprehensive score of Physalis pubescens L.juice

根據響應面回歸模型及Design Expert 10 軟件求解方程得到毛酸漿乳酸菌混合發酵最佳工藝參數為：菌種比7∶3.515，接種量1.016%，發酵時間12.09 h，根據上述條件經模型優化預測得到發酵毛酸漿果汁綜合評分為25.793 分?？紤]到實際生產需要，對參數進行簡化，調整為菌種比2∶1，接種量1.0%、發酵時間12 h，經過3 次驗證試驗，綜合評分平均值為25.82分，與模型預測理論值基本一致，說明本模型可信度高，可用于生產中預測毛酸漿果汁混合發酵工藝的結果。

2.3 毛酸漿果汁發酵前后理化指標變化

表7 為發酵前后毛酸漿果汁的理化指標變化情況。由表7 可見，由于乳酸菌在發酵過程中需要消耗糖類作為碳源并產酸[33]，所以發酵后毛酸漿果汁的pH 值、可溶性固形物和總糖含量降低，總酸含量升高。毛酸漿果汁發酵前后的多酚和總黃酮含量分別由（0.259±0.01）g/L 和（0.268±0.01）g/L 提高至（0.281±0.00）g/L 和（0.401±0.00）g/L，菌落總數達到8.31±0.12（lg（CFU/g））。葉盼等[34]選用植物乳桿菌對蘋果汁進行發酵，也發現多酚和總黃酮含量顯著增加，與本文研究結果一致。說明乳酸菌發酵有益于毛酸漿中功能性物質的轉化和溶出，這可能由于乳酸菌在發酵過程中產生酯酶和酚酸脫羧酶。酯酶可促進果汁中結合酚水解釋放出游離酚；酚酸脫羧酶能夠將復雜的大分子酚類物質轉化成小分子酚類物質。另外，發酵過程中產生的酸還可以抑制酚類物質降解。這些都可導致乳酸菌發酵后果汁中酚類物質的含量及種類發生變化[35]。

表7 理化指標Table 7 Physico-chemical indicators

2.4 電子鼻結果

氣味是果蔬汁品質的重要評價指標之一。乳酸菌發酵過程中，果蔬汁中的游離氨基酸以及糖類等物質被水解成萜烯類物質，使得烯萜類物質含量增加，產生花果香以及香脂香氣，對果蔬汁的氣味產生影響[36]。采用優化后的工藝參數發酵毛酸漿果汁，利用電子鼻確定了發酵果汁中的主要氣味成分，評價了乳酸菌發酵對毛酸漿果汁氣味的影響。

2.4.1 雷達圖分析

由圖7 可知，傳感器S7 對不同處理的樣品氣味的響應值均為最大，其次是傳感器S9 和傳感器S2，說明樣品中萜烯類物質和無機硫化物含量最高，其次為氮氧化合物和有機硫化物、芳香物質。萜烯類物質廣泛存在于植物和動物體內，越來越多的研究表明，萜烯類物質具有抗氧化活性[21]，而硫化物廣泛存在于果酒中。發酵前后傳感器S7 響應值差異明顯，萜烯類物質和無機硫化物含量增加最明顯；揮發性香氣由強到弱依次為發酵果汁、滅菌發酵果汁、新鮮果汁和滅菌新鮮果汁，這說明乳酸菌發酵處理可以豐富果汁氣味，巴氏滅菌處理會降低果汁的氣味成分。

圖7 雷達分析圖Fig.7 Radar diagram

2.4.2 Loading 分析

4 個樣品揮發性氣味的Loading 分析如圖8 所示，傳感器的響應值距原點越遠，對揮發性氣味成分的識別能力越強[37]。由Loading 分析圖可知，氣味總貢獻率為99.944%，對樣品揮發性成分貢獻率最大的感應器是S7，其次是S2 和S9，其他感應器的貢獻率差別不明顯，表明影響樣品果汁風味差異的主要是萜烯類物質、無機硫化物、氮氧化合物、有機硫化物和芳香物質，其他成分差異不明顯。

圖8 Loading 分析圖Fig.8 Loading diagram

2.4.3 PCA 分析

4 個樣品揮發性氣味的PCA 分析如圖9 所示，每個橢圓代表不同樣品揮發性氣味成分的數據采集點。分析得出，第一主成分貢獻率為93.176%，第二主成分貢獻率為6.768%，貢獻率之和為99.944%，大于90%，說明基本代表了樣品主要的氣味特征。在PCA圖中，每個橢圓內數據點分布越緊密，說明樣品重復性越高；橫坐標軸上的間距越大，說明樣品之間的差異性越大，由于第一主成分貢獻率遠高于第二主成分貢獻率，所以差異主要體現在第一主成分上。通過圖9 可以看出，滅菌前后的毛酸漿果汁差異不顯著，發酵前后的毛酸漿果汁差異非常明顯?？衫肔DA 圖進一步分析。

圖9 PCA 分析圖Fig.9 PCA diagram

2.4.4 LDA 分析

4 個樣品揮發性氣味的LDA 分析如圖10 所示，通過LDA 分析得出，兩個主成分貢獻率之和為98.28%，高于70%～85%，說明方法可以使用[38]。通過圖10 可以看出，樣品間離散度大，說明不同處理對毛酸漿果汁的揮發性氣味有明顯的影響[39]。

圖10 LDA 分析圖Fig.10 LDA diagram

3 結論

本試驗對乳酸菌混合發酵毛酸漿果汁工藝進行了優化，結合實際生產，確定乳酸菌混合發酵毛酸漿果汁最佳工藝參數為：植物乳桿菌與副干酪乳桿菌接種比2∶1，接種量1.0%，在37 ℃下發酵12 h。在此條件下制作的毛酸漿果汁中富含多酚黃酮和萜烯類物質，萜烯類物質為毛酸漿果汁中香氣物質種類最多且含量最高的物質，具有柑橘類以及松木香氣。本研究為毛酸漿的深加工提供了參考。