誘導(dǎo)富集胞外靈芝酸A 的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

丁 舒，宋兆偉，陳 穎，張志軍，張 峻，陳曉明

（天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300384）

靈芝屬于多孔菌目靈芝菌科靈芝屬真菌，在我國已有2 000 多年的藥用歷史。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，靈芝具有扶正固本、滋補強壯的作用[1]。現(xiàn)代科學(xué)研究證實，靈芝含有多種生理活性成分，如多糖、三萜、核苷、生物堿、蛋白質(zhì)、甾醇等，其中三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝、鎮(zhèn)痛、抗氧化等功效，可用于生產(chǎn)藥用及功能食品，具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的靈芝三萜類化合物生產(chǎn)方法主要通過靈芝子實體的提取，故受制于靈芝子實體的生產(chǎn)，相對生產(chǎn)周期長且成本較高，采用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)靈芝菌絲體并提取其中的活性化合物是一種可行的解決方案。優(yōu)化適宜的靈芝酸A 誘導(dǎo)富集培養(yǎng)基配方，進行靈芝菌絲液體發(fā)酵，工藝流程簡便，易于規(guī)范化，可作為生產(chǎn)靈芝酸等胞外活性成分的一種新方法[2]。

在發(fā)酵培養(yǎng)基配方和工藝優(yōu)化研究中，應(yīng)用響應(yīng)面法進行優(yōu)化是一種廣泛采用的方法，能夠獲得最優(yōu)發(fā)酵條件及工藝。魯明等[3]應(yīng)用響應(yīng)面法建立了二次多項回歸模型，對黑米乳酸菌飲料感官品質(zhì)的影響因素進行優(yōu)化，得到了乳酸菌發(fā)酵黑米飲料的最佳工藝條件。岳鹍等[4]設(shè)計響應(yīng)面試驗建立二次回歸模型，考察了發(fā)酵初始pH、發(fā)酵溫度、固液質(zhì)量體積比及發(fā)酵時間4 個因素對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。辛宇等[5]采用雙向固體發(fā)酵技術(shù)，利用響應(yīng)面法設(shè)計試驗篩選出了穩(wěn)定可行、重復(fù)性好的冬蟲夏草發(fā)酵人參工藝。閆舒雅等[6]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了樺褐孔菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖的工藝條件，為多糖的大量制備提供參考。在食藥用菌液態(tài)發(fā)酵和富集生產(chǎn)活性物質(zhì)的研究中，也經(jīng)常應(yīng)用響應(yīng)面法設(shè)計試驗，優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。曾璇竹等[7]研究了富硒香菇多糖的發(fā)酵富集及其抗氧化活性，通過響應(yīng)面法確定最優(yōu)發(fā)酵條件，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下得到的富硒香菇多糖具有較好的抗氧化活性。吳琪等[8]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了巴西蘑菇的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，得到最大菌絲生物量為17.85 g·L-1。張忠等[9]使用猴頭菌液體發(fā)酵生產(chǎn)麥角甾醇，經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中氮源對麥角甾醇產(chǎn)量的影響極顯著，對麥角甾醇產(chǎn)量的影響程度為：氮源＞碳源＞無機鹽。

參考已有經(jīng)驗，基于課題組前期研究方法和成果[10]，本研究以液態(tài)發(fā)酵靈芝菌絲誘導(dǎo)富集靈芝酸A，采用全合成培養(yǎng)基替代傳統(tǒng)的天然原料培養(yǎng)基，原料來源穩(wěn)定，適用性強，無毒無害，安全簡便，更有利于工業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

菌種：靈芝（Ganoderma lucidum）G8，保藏于天津市食用菌技術(shù)工程中心，接種于馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（Comprehensive Potatoes Dextrose Agar，CPDA）[11]試管斜面，于4 ℃冰箱中恒溫保存。

葡萄糖（生物試劑（BR））、麥芽糖（BR）、木聚糖（BR）、果糖（BR）纖維素（BR）、糊精（BR）、谷氨酸（BR）、天門冬氨酸（BR）、精氨酸（BR）、賴氨酸（BR）、組氨酸（BR），D-木糖（（分析純）AR）、淀粉（AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蔗糖（BR）、乳糖（BR），牛磺酸（AR），天津大茂化學(xué)試劑有限公司；菊糖（BR）、復(fù)合維生素B 族（原料藥），河南特康生物科技有限公司；靈芝酸A（Ganoderic acid A）（光譜純（SP）），四川維克奇生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FA-2004C 型分析天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HS-211C 型恒溫搖床，上海和呈儀器制造有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱和DHG-9203A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CT62A 型滅菌鍋，馳通儀器(上海)有限公司；MT-30K 型組織破碎機，杭州米歐儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方及配制方法

菌種培養(yǎng)基采用CPDA 培養(yǎng)基，配方為：土豆200 g（浸汁），葡萄糖20 g，酵母浸膏1 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.05 mg，瓊脂16 g，蒸餾水1 000 mL。采用5%NaOH 及5%HCl 調(diào)節(jié)pH 至6.4。

1 級、2 級搖瓶種子培養(yǎng)基采用改良的綜合培養(yǎng)基（Comprehensive Medium，CM），配方為：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸粉1 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，VB10.05 mg，蒸餾水1 000 mL。采用5%NaOH 及5%HCl 調(diào)節(jié)pH 至6.4[12-14]。

合成培養(yǎng)基為課題組自行研制，配方為：葡萄糖30 g，組氨酸0.5 g，復(fù)合VB（Compound Vitamins B，CVB）1 mL（包含VB13 mg、VB21.5 mg、VB60.2 mg、煙酰胺10 mg、泛酸鈣1 mg），牛磺酸0.1 g，蒸餾水1 000 mL。采用5%NaOH 以及5%HCl 調(diào)節(jié)pH 至6.4。

培養(yǎng)基配制方法：將各培養(yǎng)基配方所述成分稱量后，攪拌至充分溶解并定容至1 000 mL，分裝至250 mL 廣口三角瓶中，每瓶80 mL，棉塞封口后，表面加蓋雙層牛皮紙，于121 ℃滅菌30 min，冷卻，置于超凈工作臺中直至封口材料完全干燥后備用。

1.2.2 菌種的制備

1.2.2.1 母種的活化和制備

取保藏的靈芝菌種，于25 ℃活化48 h，鏟取0.5 cm2大小的方塊接種于菌種培養(yǎng)基平板表面，于25 ℃避光培養(yǎng)5 d，經(jīng)無菌檢查后備用[14]。

1.2.2.2 1 級搖瓶種子的制備

活化菌種菌落生長直徑達5 cm 時，鏟取0.5 cm2大小的小方塊接種于1 級搖瓶種子培養(yǎng)基中，每瓶接種3 個小方塊。置于恒溫搖床中，160 r/min，25 ℃避光培養(yǎng)5 d 至出現(xiàn)菌絲球，酚紅肉湯無菌檢查后備用[14]。

1.2.2.3 2 級搖瓶種子的制備

1 級搖瓶種子培養(yǎng)5 d，過40 目滅菌尼龍篩至無菌三角瓶中，以移液槍吸取5 mL 濾液，接種于2 級搖瓶種子培養(yǎng)基中，160 r/min，25 ℃避光培養(yǎng)7 d，用組織破碎機打碎菌絲球成均勻菌絲體，用無菌20目滅菌尼龍布過濾后，將菌絲體重懸于無菌水中，160 r/min 搖動5 min，反復(fù)3 次，去除菌絲體上殘余培養(yǎng)基，用蒸餾水調(diào)整菌絲生物量至10 g/L，重懸于蒸餾水中，經(jīng)酚紅肉湯無菌檢查后備用。

1.2.2.4 測試培養(yǎng)基的接種與培養(yǎng)

將懸浮于蒸餾水中的二級搖瓶種子以移液槍吸取20 mL，無菌加入預(yù)先滅菌分裝的各測試培養(yǎng)基處理，160 r/min、25 ℃避光培養(yǎng)10 d。

1.2.2.5 對照培養(yǎng)基的接種與培養(yǎng)

對照培養(yǎng)基為CM 培養(yǎng)基，其接種與培養(yǎng)方法同“1.2.2.4”。

1.2.3 靈芝菌絲生物量（以下簡稱靈芝生物量）的測定

使用濾紙過濾法對各處理培養(yǎng)基中菌絲體生物量進行測定。將搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液用經(jīng)100 ℃烘干至恒重、并準確稱重編號的雙層定性濾紙抽濾，用蒸餾水洗滌沉淀3 次，80 ℃烘干至恒重，分析天平稱重并減去對應(yīng)濾紙的皮重，得菌絲生物量干重，將其換算為g/L 進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 pH 值的測定

使用酸度計測定發(fā)酵液pH 值，具體方法參照GB/T 6920—1986《水質(zhì)pH 值的測定 玻璃電極法》[15]，同一樣品重復(fù)測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 靈芝酸A 產(chǎn)量的測定

1.2.5.1 靈芝胞外靈芝酸A 的提取

在去除菌體后的發(fā)酵液中加入4 倍體積冷95%乙醇進行沉淀，除去多糖，將上清液濃縮直至完全干燥，再用蒸餾水懸浮，加10 mL 氯仿萃取。重復(fù)3 次后合并萃取液，加10 mL 5%NaHCO3溶液，于漩渦振蕩混合器中萃取氯仿提取液中的靈芝酸A，萃取3 次，合并萃取液，用稀鹽酸調(diào)pH 值至3，移至離心管中，再反復(fù)用氯仿萃取3 次，每次用10 mL 氯仿。合并氯仿萃取液，待氯仿完全揮發(fā)后，用無水乙醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中。

1.2.5.2 靈芝胞外靈芝酸A 產(chǎn)量的測定

采用紫外分光光度法測定，以靈芝酸A 為標準品，具體方法參考文獻[16-17]。

1.2.6 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

通過前期試驗篩選合成培養(yǎng)基各主要成分的適宜濃度范圍，包括：碳源為25～35 g·L-1葡萄糖，氮源為0.3～0.7 g·L-1組氨酸，生長因子為20～40 g·L-1復(fù)合VB。

以葡萄糖添加量（A）、組氨酸添加量（B）、復(fù)合VB 添加量（C）為自變量，以發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液菌絲生物量（Y1）和靈芝酸A 產(chǎn)量（Y2）為響應(yīng)變量，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗，其因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM design

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Box-Benhnken（BBD）中心組合方法，使用Design-Expert 10 軟件進行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

采用響應(yīng)面法對液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，試驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of RSM test

2.2 回歸模型的建立及方差分析

對表2 中的數(shù)據(jù)進行多元線性回歸擬合，得到靈芝生物量（Y1）與葡萄糖添加量（A）、組氨酸添加量（B）、復(fù)合VB 添加量（C）的二次多元回歸方程為：Y1=-54.31+2.78A+73.90B+0.14C-0.28AB+0.01AC -0.15BC-0.05A2-57.96B2。

靈芝酸A 產(chǎn)量（Y2）與葡萄糖添加量（A）、組氨酸添加量（B）、復(fù)合VB 添加量（C）的二次多元回歸方程為：Y2=-254.64+12.62A+408.03B+4.84C+6.85AB+0.21BC+0.31AC-0.36A2-634.20B2-0.18C2。

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3～4。

由表3 可知，以靈芝生物量為響應(yīng)值的模型1 極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著，表明該回歸模型方程的擬合度良好。該模型的R2為0.990 1，調(diào)整后R2adj為0.977 4，模型1 可以解釋97.74%的靈芝生物量的變化，說明可以用模型1 分析和預(yù)測液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)配方。靈芝生物量（Y1）模型中，一次項A、B、C，交互項AC 及二次項A2、B2、C2對靈芝生物量的影響極顯著（P＜0.01），交互項BC 的影響顯著（P＜0.05），交互項AB 的影響不顯著。各因素對靈芝生物量的影響程度由大到小為：A＞B＞C，即葡萄糖添加量＞組氨酸添加量＞復(fù)合VB 添加量。

表3 回歸模型1 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for regression model 1

由表4 可知，以靈芝酸A 產(chǎn)量為響應(yīng)值的模型2顯著（P＜0.05），失擬項不顯著，表明模型2 并不理想，但仍有一定的參考價值，尤其是對于不和初生代謝相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物。該模型的R2為0.835 1，調(diào)整后R2adj為0.623 2，二者之間有一定的差距，因此，僅用該模型分析和優(yōu)化培養(yǎng)基的配方和添加物。靈芝酸A 產(chǎn)量（Y2）模型中，一次項和交互項對靈芝酸A 產(chǎn)量的影響均不顯著。靈芝酸A 為次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的多寡與靈芝菌絲生物量的關(guān)系并不密切[18-19]，靈芝酸的代謝受制于更復(fù)雜的情況。

2.3 因素間的交互作用分析

根據(jù)表3 和表4 的結(jié)果，只分析各因素間的交互作用對靈芝生物量（Y1）的影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果，得到葡萄糖添加量與組氨酸添加量（AB）、葡萄糖添加量與復(fù)合VB 添加量（AC）、組氨酸添加量與復(fù)合VB 添加量（BC）之間的交互作用對靈芝生物量（Y1）的影響，如圖1 所示。由圖1 可見，AC 間的交互作用對靈芝生物量（Y1）的影響達極顯著水平（P＜0.01），這與菌絲的生長狀態(tài)相關(guān)，較大生物量與碳源有關(guān)，促進了菌絲體對生長因子的需求，導(dǎo)致AC 的交互作用極顯著；相比較而言，BC 間的交互作用較弱，達顯著水平（P＜0.05），是由于菌絲對氮源的需求較少且恒定，故而由氮源引起的促生作用不明顯，其交互作用較弱；AB 間的交互作用不顯著，說明雖然AB 的交互作用會影響培養(yǎng)基碳氮比，但培養(yǎng)基各處理已經(jīng)是基于最優(yōu)碳氮比的設(shè)計，因此碳/氮源各因子的變動無法造成較大的影響。

圖1 各因素間的交互作用對靈芝菌絲生物量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots of effect of various factors interactions on biomass of Ganoderma lucidum mycelium

表4 回歸模型2 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for regression model 2

2.4 驗證試驗

根據(jù)回歸模型1 分析可知，誘導(dǎo)富集胞外靈芝酸A 的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)配方為：葡萄糖35 g，組氨酸0.7 g，復(fù)合VB 40 mg。經(jīng)驗證試驗，采用優(yōu)化后的配方進行靈芝液體發(fā)酵，檢測得到菌絲生物量為11.45 g·L-1，靈芝酸A 產(chǎn)量為137.98 mg·L-1。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化誘導(dǎo)富集胞外靈芝酸A 的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖35 g，組氨酸0.7 g，復(fù)合VB 40 mg，牛磺酸0.1 g，蒸餾水1 000 mL。用5% NaOH 及5% HCl 調(diào)節(jié)pH 至6.4，121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。在此培養(yǎng)基上進行靈芝液體發(fā)酵，菌絲生物量為11.45 g·L-1，靈芝酸A 的產(chǎn)量為137.98 mg·L-1。