基于近紅外光譜技術快速定量分析天麻有效成分*

彭璐，鐘淑梅，廖鵬程，范蔭蔭，胡昌強，覃冬玖

(九州天潤中藥產(chǎn)業(yè)有限公司，武漢 430050 )

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖，主產(chǎn)于貴州、云南、四川、陜西等地，是我國名貴中藥材之一，具平肝熄風、祛風定驚的功效，用于小兒驚風、癲癇、頭痛、風濕[1]等?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻在緩解平滑肌痙攣、降低血壓、增加智力和提高記憶力等方面有重要作用[2-6]。天麻素和對羥基苯甲醇為天麻的主要成分，近年來，大量文獻報道巴利森苷A、B、C、E是天麻素和檸檬酸縮合而成的特殊化合物，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用，為天麻的活性成分[7-8]。目前天麻的質(zhì)量控制主要采用高效液相色譜(HPLC)法進行含量測定，該方法雖然準確，但樣品前處理復雜，耗時耗力，時效性差，操作過程復雜，需各種有機試劑，污染環(huán)境，檢測成本高，不適用于中藥工業(yè)中多批次中藥材及飲片的快速檢測。近紅外光譜技術(near-infrared spectroscopy，NIR)具有分析速度快、效率高、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點，目前已經(jīng)在中藥真?zhèn)舞b別、產(chǎn)地溯源、優(yōu)劣、廠家鑒別、中藥生產(chǎn)過程質(zhì)量控制等方面應用[9-14]。筆者在本研究采用NIR和化學計量學建立天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E 6種成分的定量分析模型，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Corona Extreme型近紅外光譜儀器(德國Carl Zeiss Spectroscopy 公司)，玻璃樣品杯池，Inprocess光譜掃描軟件(版本2.11.1.10485)，TQ Analyst 8.0分析軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)，1260 系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2試藥 對照品天麻素(批號：110807-201809，含量：96.7%)、對羥基苯甲醇(批號：111970-201702，含量：99.4%)均購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷A(批號：A010586，含量≥98.0%)、巴利森苷B(批號：A010587，含量≥98.0%)、巴利森苷C(批號：A010694，含量≥98.0%)、巴利森苷E(批號：A010652，含量≥98.0%)均購自珠海安哲生物科技有限公司；95%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190704)，乙腈(美國Aavator公司，色譜純，批號：00002309)，磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純，批號：20160629)。

實驗所用樣品包括安徽金寨和陜西漢中的不同等級的天麻樣品66批次，經(jīng)九州天潤中藥研究院吳衛(wèi)剛副研究員鑒定為蘭科植物天麻GastrodiaelataB1.的干燥塊莖，樣品來源具體信息見表1。

表1 66份天麻樣品來源信息

2 方法與結果

2.1HPLC分析

2.1.1供試品溶液的制備 取天麻粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(120 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘渣加乙腈-水(3：97)混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用乙腈-水(3：97)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2對照品溶液的制備 取天麻素對照品、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E對照品適量，精密稱定，加乙腈-水(3：97)混合溶液分別制成天麻素儲備液(0.050 7 mg·mL-1)、對羥基苯甲醇儲備液(0.026 4 mg·mL-1)、巴利森苷A、B、C、E儲備液(濃度分別為0.232 8，0.342 4，0.090 0，0.295 6 mg·mL-1) 。

2.1.3色譜條件 使用Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B，3：97)為流動相梯度洗脫：0～10 min，3%→10% A ；>10～15 min，10%→12% A ；>15～25 min，12%→18% A ；>25～40 min，18%→82% A ；檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL·min-1，進樣量10 μL。

2.2近紅外光譜采集 取上述66 份天麻樣品適量，粉碎，過孔徑0.180 mm(80 目)篩。采用光柵式漫反射模式采集光譜，分辨率8 cm-1，掃描次數(shù)為64 次，掃描波長范圍為950～1650 nm，溫度為15～28 ℃，相對濕度為38% 。將收集到的樣品粉末取約12 g，放入玻璃樣品杯中，混合均勻，以空氣為參比，扣除背景采集圖譜，按上述實驗條件進行掃描，每個樣品重復掃描4次，求平均光譜。

2.3統(tǒng)計學方法 應用化學計量學軟件TQ Analyst 8.0版分析軟件采用偏最小二乘回歸法(PLSR)建立天麻6種有效成分定量分析模型。

2.4結果

2.4.1HPLC分析 按“2.1.3 ”項下色譜條件測定，HPLC色譜圖見圖1 。

將不同產(chǎn)地不同等級的天麻以“2.1.3 ”項下色譜條件進行含量測定，計算出不同產(chǎn)地不同等級天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E 6種指標成分的含量，均符合2020版《中華人民共和國藥典》項下含量要求，其平均值依次為(0.59±0.22)%，(0.08±0.04)%，(1.40±0.44)%，(0.63±0.15)%，(0.12±0.04)%，(1.92±0.60)%。

2.4.2近紅外光譜采集 在“2.2”項下近紅外光譜測定條件下，采集66批次不同產(chǎn)地不同等級的近紅外光譜，重復測定4次，平均光譜見圖2。

2.4.3校正集和驗證集劃分 應用TQ Analyst 8.0版軟件，由計算機從66份樣品中隨機挑選出60份不同批次的天麻樣品建立天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E的近紅外定量校正模型，見表2。驗證集樣品中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E 含量均在校正集含量范圍內(nèi)，此校正集與驗證集可用于建模。

1.天麻素；2.對羥基苯甲醇；3.巴利森苷E；4.巴利森苷B；5.巴利森苷C；6.巴利森苷A。

2.4.4波段選擇 采用TQ Analyst軟件自帶的優(yōu)化設置，篩選出最佳建模波段為950.00～1650.00 nm。

2.4.5NIR光譜預處理 在NIR分析中，常用多元校正方法包括：多元線性回歸(MLR)、主成分回歸法(PCR)、偏最小二乘回歸法(PLSR)等線性校正方法。本實驗采用PLS作為校正方法，以相關系數(shù)(R)，校正均方差(RMSEC)，預測均方差(RMSEP)為模型性能評價指標，考察標準正態(tài)變換(SNV)，多元散射校正(MSC)，平滑去噪法(Narris derivative filt和Savitzky-Golay卷積平滑法)，一階導數(shù)法(1stderivative，1stD)，二階導數(shù)法(2ndderivative，2ndD)等預處理方法。其中R越接近1，RMSEC和RMSEP越接近0，模型的性能越穩(wěn)定。本實驗比較SNV和MSC等預處理方法對天麻6種指標性成分定量模型的影響，見表3。綜合考慮天麻素采用SNV+1stD組合方案進行預處理，對羥基苯甲醇采用MSC方案進行預處理，巴利森苷A和B采用BSC+1stD組合方案進行預處理，巴利森苷C和E采用MSC+2ndD+N-D平滑組合方案進行預處理。

圖2 66份天麻樣品的近紅外原始光譜疊加

2.4.6主成分數(shù)的選擇 主成分數(shù)的選擇影響NIR定量分析模型的穩(wěn)定性和預測性。定量分析模型以校正集樣本的內(nèi)部交叉驗證均方差(Root mean square error of cross validation，RMSECV)為評價指標，當RMSECV最小時，所選主成分數(shù)最佳。本研究中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E定量模型最佳主因子數(shù)分別為8，7，8，8，9，5，RMSECV依次為0.190 6%，0.030 9%，0.198 0%，0.127 9%，0.026 8%，0.238 7%。

2.4.7定量模型的建立與評價 運用TQ數(shù)據(jù)分析軟件，采用偏最小二乘法PLS算法，建模波長為950～1650.00 nm，天麻素和對羥基苯甲醇分別采用SNV+1stD和MSC光譜前處理方法，巴利森苷A和巴利森苷B采用MSC+1stD組合方案進行預處理，巴利森苷C和E采用MSC+2ndD+N-D平滑組合方案進行預處理。天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E定量模型最佳主因子數(shù)分別為8，7，8，8，9，5；模型質(zhì)量評價參數(shù)R依次為0.984 1，0.906 3，0.985 8，0.985 7，0.985 2，0.950 6；RMSEC依次為0.042 7%，0.017 0%，0.074 9%，0.026 9%，0.008 0%，0.136 0%；RMSEP依次為0.083 7%，0.011 6%，0.138 0%，0.069 9%，0.014 5%，0.178 0%；上述天麻6種有效成分定量模型相關系數(shù)R值均接近于1，RMSEC值和RMSEP 值均接近于0，即說明天麻6種有效成分定量模型預測性能穩(wěn)健且準確性高。天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E的NIR預測值與真實值相關性見圖3。

表2 校正集與驗證集樣品測定值

表3 不同預處理對6種成分定量模型的影響

A.天麻素；B.對羥基苯甲醇；C.巴利森苷A；D.巴利森苷B；E.巴利森苷C；F.巴利森苷C。

2.4.8定量模型驗證 定量模型建立后，選擇6個未參加建模的樣品進行外部驗證，驗證結果見表4。天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E指標預測值和HPLC測定的真實值分別見表6。通過統(tǒng)計學分析，說明模型穩(wěn)定性和準確性較好，可以用于天麻飲片6種主要有效成分的含量預測。經(jīng)配對t檢驗，6個驗證集樣本的HPLC法測定的真實值與NIR光譜預測值的配對t檢驗值都小于t(0.05，6)=4.032，即兩者分析方法的分析結果差異無統(tǒng)計學意義，表明該這6種成分預測模型可用于天麻樣品6種成分的含量測定。

表4 天麻6種成分模型預測值與HPLC測定真實值

3 討論

筆者在本實驗為了體現(xiàn)中藥的整體性和化學成分的多樣性，以安徽金寨和陜西漢中多個縣市的天麻為研究對象，采用主成分分析PCA和偏最小二乘法PLS等算法，建立不同產(chǎn)地不同等級天麻的天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E 6種指標性成分的定量校正模型，并對未參與建模的6批次樣品進行預測，對結果進行配對t檢驗，顯示預測值與真實值之間差異無統(tǒng)計學意義，表明本文所采用的NIR法與HPLC法之間沒有明顯的系統(tǒng)誤差。

目前天麻的質(zhì)量控制主要采用HPLC法進行檢測，該方法雖然檢測準確，但樣品前處理繁瑣，耗時較長，本研究建立天麻6種指標成分的定量校正模型，模型穩(wěn)定可靠，可用于對未知樣品的預測。與HPLC法比較，能快速簡便準確地預測不同產(chǎn)地不同等級的天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 6種指標性成分含量，大大縮短檢測時間，并節(jié)省檢測成本，減少環(huán)境污染，可實現(xiàn)天麻工業(yè)大生產(chǎn)中的快速檢測和在線質(zhì)量監(jiān)控，為后期建立天麻質(zhì)量品質(zhì)的數(shù)字化和智能化提供參考。