螺蟲乙酯單克隆抗體的制備及酶聯免疫分析方法的建立

趙靜，趙其陽，張耀海，何悅，焦必寧*，崔永亮*

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)2(農業農村部柑桔及苗木質量監督檢測測試中心，重慶，400712)

螺蟲乙酯是德國拜耳公司開發的一種新型螺環季酮酸類殺蟲殺螨劑，它通過抑制乙酰輔酶A羧化酶活性，干擾脂肪生物合成，阻斷害蟲正常的能量代謝，最終致其死亡[1]。由于其作用高效，被廣泛應用于防治果蔬中的刺吸口器類害蟲和害螨，如蚜蟲(甘藍蚜蟲和蘋果樹棉蚜)、木虱(梨樹梨木虱)、粉虱(番茄煙粉虱)和全爪螨(柑橘樹紅蜘蛛)等[2-3]。然而，螺蟲乙酯對人的皮膚有輕微致敏性[3]，對其他動物有毒性，如螺蟲乙酯對蚯蚓有潛在遺傳毒性[4]，它能夠誘導斑馬魚肌肉組織的氧化應激效應，進而引起氧化損傷[5]，也會對斑馬魚產生內分泌干擾效應[6]，此外，螺蟲乙酯對兩棲類生物如蟾蜍也有潛在毒性[7]。螺蟲乙酯在施用后主要產生4種代謝物，分別為B-enol，B-glu，B-keto和B-mono[8]，其中B-enol的毒性與螺蟲乙酯相當，對雄性大鼠有生殖毒性[3]。因此，螺蟲乙酯及其代謝物的殘留檢測對人類健康和環境保護具有重要意義。

目前，植物中螺蟲乙酯及其代謝物的殘留檢測方法主要包括HPLC[9]，LC-MS/MS[1, 10]和GC-MS[11]，盡管這些方法靈敏度和準確性高，但它們受限于熟練的操作人員和昂貴的儀器，而免疫分析方法具有檢測迅速、操作簡便和成本低廉等優點[12]。CEVALLOS-CEDEO等[13-14]設計合成了多種螺蟲乙酯的半抗原，得到了特異性識別螺蟲乙酯及B-enol的多克隆抗體和單克隆抗體，基于單克隆抗體建立了直接競爭酶聯免疫分析方法，對葡萄、葡萄汁和葡萄酒基質進行加標回收實驗，并且該課題組還以免疫原BSA-SPh為檢測線，羊抗鼠多克隆抗體為控制線，金納米顆粒標記的單克隆抗體SPm#23為流動相，建立螺蟲乙酯膠體金免疫層析分析方法，對葡萄酒樣品中螺蟲乙酯及B-enol殘留進行半定量測定，其可視化最低檢測限為1 000 μg/L，滿足歐洲對葡萄酒中螺蟲乙酯殘留的半定量快速分析的要求。雖然國外已經建立了螺蟲乙酯的免疫分析方法，但這種方法在蔬菜、水果和環境樣品中的應用還尚待研究，同時我國在這方面的研究也比較匱乏。因此，本研究設計合成了一種新型的螺蟲乙酯半抗原，篩選出特異性識別螺蟲乙酯及B-enol的單克隆抗體，并對蔬菜、水果及環境基質進行螺蟲乙酯加標回收實驗，同時測定了柑橘實際樣品中的螺蟲乙酯殘留，旨在提供一種快速檢測果蔬中螺蟲乙酯殘留的新方法，并為螺蟲乙酯免疫試紙條的開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種：本研究中所用的土壤、河水、番茄和柑橘(溫州蜜柑)在重慶市北碚區收集，其中番茄和柑橘為市售。

藥劑與試劑：螺蟲乙酯、B-enol、B-glu、B-keto、B-mono、螺螨酯、乙螨唑、唑螨酯、噠螨靈標準品，上海安譜實驗科技股份有限公司；次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymine nucleoside，HAT)培養基添加劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記羊抗鼠IgG、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(Tween-20),美國Sigma-Aldrich公司；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、溴乙酸乙酯、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、N,N′-二環己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)顯色液，上海Aladdin公司；DMEM培養基和胎牛血清(fetal calf serum，FBS)，蘇格蘭Gibco BRL公司；蛋白膠、2×考馬斯亮藍R-250緩沖液、Real Band 3-color High range protein Marker，上海BBI生命科學有限公司。

電泳脫色液(30%的無水乙醇和10%的冰醋酸混合液)；包被緩沖液[碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution，CBS)，pH 9.6，0.05 mol/L]：稱取2.93 g NaHCO3，1.5 g Na2CO3，用去離子水溶解并定容至1 000 mL；磷酸鹽緩沖液[(phosphate buffer solution，PBS)，pH 7.4，0.01 mol/L]：稱取0.2 g KH2PO4，2.96 g Na2HPO4·12H2O，8.0 g NaCl，用去離子水溶解并定容至1 000 mL；洗滌緩沖液(PBST，含體積分數0.1% Tween-20的PBS，pH 7.4)；封閉液(含質量分數3%脫脂奶粉的PBS)；樣品稀釋緩沖液(PBSTG，含質量分數0.1%明膠的PBST，pH 7.4)；終止液(2 mol/L H2SO4)。

1.2 儀器與設備

細胞培養板和96孔酶標板，美國Corning Costar公司；Varioskan LUX型多功能微孔板檢測儀、IEC CL31R型臺式冷凍離心機，芬蘭賽默飛世爾科技公司；INC153型二氧化碳細胞培養箱，德國Memmert公司；電熱恒溫培養箱，天津市中環實驗電爐有限公司；Milli-Q型超純水器，美國Millipore公司；XS204型電子天平、PB8001-S/FACT型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；SB-5200D型超聲波清洗器，寧波新芝公司；0.22 μm有機相針式濾器，上海安譜實驗科技股份有限公司；核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；X500R QTOF高分辨質譜儀(用于半抗原鑒定)，美國AB SCIEX公司；Agilent 1290-6495液相色譜串聯質譜儀(用于方法確證)，美國Agilent公司。

1.3 螺蟲乙酯人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

1.3.1 螺蟲乙酯半抗原的合成

螺蟲乙酯半抗原的合成路線如圖1所示。準確稱取226 mg B-enol、200 mg NaOH和250 mg溴乙酸乙酯于圓底燒瓶中，加入5 mL DCC溶解，回流12 h，期間通過薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)監測反應進度，待原料點消失，將反應的混合物倒入25 g冰中，攪拌4 h，并用2 mol/L的鹽酸調節pH至2～3，隨即用25 mL的乙酸乙酯萃取3次，并用飽和食鹽水進行洗滌，收集上清液置于具塞錐形瓶中，加入適量的無水硫酸鎂干燥過夜。將干燥后的溶液過濾，旋轉蒸發濃縮后柱層析梯度洗脫純化產物。之后通過核磁共振波譜儀和X500R QTOF高分辨質譜儀對產物進行鑒定。

圖1 螺蟲乙酯半抗原的合成路線Fig.1 The synthetic route of spirotetramat hapten

1.3.2 螺蟲乙酯人工抗原的制備

螺蟲乙酯人工抗原的制備過程參照文獻[15]，合成路線如附圖1所示(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)。將純化后的螺蟲乙酯人工抗原通過SDS-PAGE鑒定，并置于-20 ℃保存。

1.3.3 動物免疫及血清效價測定

本研究采用的動物免疫方案參考文獻[16]，具體操作見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/911.1802.TS.20211011.1812.006.html)。選取6只6～7 周齡的雌性Balb/c小鼠，將免疫原螺蟲乙酯-BSA與等體積弗氏佐劑乳化后進行免疫，4次免疫后1周，眼眶取血，室溫靜置1 h，4 ℃放置2 h，4 000 r/min 離心10 min，收集血清，進行血清效價測定。

血清效價的測定采用間接競爭酶聯免疫分析方法(indirect homologous competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，通過棋盤格法進行。具體操作步驟參考文獻[15, 17]：(1)包被：用CBS將1 g/L 的螺蟲乙酯-OVA稀釋至1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，酶標板每孔加入100 μL，37 ℃孵育3 h，棄包被液，用PBST洗板4次；(2)封閉：每孔加入200 μL封閉液，37 ℃封閉孵育1 h，棄封閉液，用PBST洗板4次；(3)加標準品和血清：將血清用PBSTG稀釋至1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，每孔先加入50 μL螺蟲乙酯標準品(1 000 μg/L和0)，再加入50 μL稀釋后的血清，37 ℃孵育30 min，洗板4次；(4)加二抗：將HRP標記的羊抗鼠IgG用PBSTG 稀釋至1∶10 000，每孔加入100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板4次；(5)顯色：每孔加入100 μL TMB單組分顯色液，室溫下避光顯色10 min；(6)終止與檢測：每孔加入50 μL終止液，終止反應，在450 nm處檢測吸光度OD450nm值；(7)效價確定[18]：取吸光度為1.0時的血清的最大稀釋倍數為血清效價；(8)特異性確定：根據抑制率來判斷血清的特異性，抑制率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 抗螺蟲乙酯單克隆抗體的制備

第4次免疫后，選擇血清效價高，特異性好的小鼠進行加強免疫用于細胞融合。使用促融劑PEG-2000將脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0按10∶1質量比進行融合，融合后每天觀察細胞生長，在第9天采用icELISA篩選特異性強，效價高的雜交瘤細胞株。將篩選到的細胞株采用有限稀釋法進行克隆化，最終得到單克隆細胞株(mAb 3D11G7)。制備腹水前，向5只6～7周的Balb/c雌性健康小鼠中注射液體石蠟(0.4 mL/只)。1周后，向小鼠腹腔中注射細胞株(mAb 3D11G7)進行擴繁，7～10 d后收集腹水于4 ℃下靜置約3～4 h后，10 000 r/min離心10 min，棄去脂肪層和細胞層，吸取中間澄清部分保存在-20 ℃用于后續實驗。

1.4 螺蟲乙酯人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

1.4.1 抗螺蟲乙酯單克隆抗體與包被抗原的最佳工作濃度

利用icELISA和棋盤格法確定抗螺蟲乙酯單克隆抗體與包被抗原的最佳工作濃度，具體操作步驟參考文獻[15, 17]，其中，抗螺蟲乙酯單克隆抗體為腹水，選擇對照孔吸光度>1.0，抑制率較高的包被抗原和單克隆抗體的最大稀釋倍數為最佳工作濃度。

1.4.2 螺蟲乙酯icELISA標準曲線的繪制

以螺蟲乙酯-OVA的最佳工作濃度進行包被，37 ℃孵育3 h，洗板4次，接著每孔加入200 μL封閉液，37 ℃ 孵育封閉1 h，棄封閉液，用PBST洗板4次，然后將螺蟲乙酯標準品倍比稀釋，每孔加入50 μL標準品和50 μL最佳工作濃度下的抗螺蟲乙酯單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，洗板4次，之后加入100 μL稀釋至1∶10 000的HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，洗板4次。隨即進行顯色，每孔加入100 μL TMB單組分顯色液，室溫下避光顯色10 min后加入50 μL終止液，終止反應，在450 nm處檢測吸光度OD450nm值。以螺蟲乙酯標準品的濃度為橫坐標，對應濃度下的吸光度為縱坐標，繪制間接競爭抑制曲線如圖2所示。根據公式(2)[19]計算抗螺蟲乙酯單克隆抗體的靈敏度即半數抑制質量濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和最佳工作濃度范圍(IC20～IC80)。

(2)

式中：B0為未加標準品溶液組的OD450nm值，B為加入梯度濃度標準品溶液組OD450nm值。

1.4.3 抗螺蟲乙酯單克隆抗體特異性分析

(3)

1.4.4 緩沖液中有機溶劑對icELISA的影響

為了評估緩沖液中有機溶劑對icELISA的影響，選擇農藥前處理過程中常用的有機溶劑甲醇和乙腈，并配制含不同體積分數的有機溶劑(5%、10%、20%和40%)的樣品稀釋液PBSTG，隨后通過icELISA測定不同濃度溶劑條件下的B0值和IC50值。

1.4.5 緩沖液的pH對icELISA的影響

為了評估緩沖液的pH對icELISA的影響，配制含不同pH值(4.5、5.5、6.5、7.4和8.5)的樣品稀釋液PBSTG，隨后通過icELISA測定不同pH條件下的B0值和IC50值。

1.4.6 加標回收及實際樣品檢測

將采集到的溫州蜜柑和番茄用紗布擦拭干凈，按四分法取全果進行勻漿，土壤樣品剔除其中的碎石等雜物，將處理好的樣品置于-20 ℃的冰箱保存。

樣品的提取方法為：稱取2.0 g的樣品于15 mL的離心管中，加入2 mL的甲醇超聲輔助提取20 min(25 ℃，200 W)，隨后于6 000×g離心10 min，提取3次，合并3次的上清液，于40 ℃條件下氮吹干燥，用2 mL的PBSTG復溶，稀釋至適當濃度后通過icELISA進行測定。

向河水中添加不同水平的螺蟲乙酯(20、50、100、500 μg/L)，用PBSTG稀釋至適當濃度后通過icELISA進行測定，并計算加標回收率。向空白基質土壤、番茄和溫州蜜柑中添加不同水平的螺蟲乙酯(50、100、500、1 000 μg/L)，4 ℃條件下，靜置吸附1 h，然后按照樣品的提取方法進行提取，通過icELISA進行測定，加標回收率計算如公式(4)所示：

加標回收率/%

(4)

本研究選用的實際樣品1～3號為未噴灑螺蟲乙酯的樣品，4～9號為隨機浸泡不同濃度的柑橘盲樣。

1.4.7 超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法驗證

UPLC-MS/MS法的檢測條件參考文獻[20]，具體條件如下：

色譜條件：色譜柱為Agilent eclipse plus C18column(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相A為0.1%甲酸-水溶液，B為甲醇。柱溫為40 ℃，進樣量為3 μL，流速為0.3 mL/min，洗脫梯度見附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)。

質譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描模式，毛細管電壓3 kV，離子源溫度120 ℃，鞘氣溫度300 ℃；通過動態多反應監測模式檢測。

2 結果與分析

2.1 螺蟲乙酯半抗原鑒定結果

從附圖2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)半抗原的氫譜中可以看到，δ 12.86 (s, 1H, COOH) 和4.29 (dd, 2H, CH2COOH)兩處峰為引入的CH2COOH基團的氫譜信息。碳譜中δ 12.86 (s, 1H, COOH)和66.87 (CH2COOH)2處峰也表明CH2COOH基團被成功引入。螺蟲乙酯半抗原的分子式為C20H25NO5，相對分子質量為359.173 3，其在質譜中的母離子[M+H]+質荷比(為360.180 5)與X500R QTOF高分辨質譜儀測得質荷比(為360.181 0)相吻合[附圖3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)]。核磁圖譜和質譜結果表明，成功合成了螺蟲乙酯的半抗原。

1H NMR [600 MHz, 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)] δ 12.86 (s, 1H, COOH), 8.41 (s, 1H, NH), 7.07 (d, 1H,J=7.5 Hz, H-5 Ph), 7.04 (d, 1H,J=18.4, 7.5 Hz, H-6 Ph), 6.85 (s, 1H, H-2 Ph), 4.29 (dd, 2H,J=45.1, 16.3 Hz, CH2COOH), 3.26 (s, 3H, OCH3), 3.15 (m, 1H, H-8’), 2.24 (s, 3H, OCH3), 2.05 (s, 3H, OCH3), 1.99 (m, 2H, H-7’/H-9’), 1.89 (m, 2H, H-6’/H-10’), 1.53 (m, 4H, H-6’/H-7’/H-9’/H-10’)。

13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 171.19 (COOH), 171.12 (C-2’), 169.02 (C-4’), 135.05 (C-1 Ph), 134.46 (C-3 Ph), 131.97 (C-4 Ph), 131.27 (C-5 Ph), 129.72 (C-6 Ph), 128.89 (C-2 Ph), 106.95 (C-3’), 77.93 (C-8’), 66.87 (CH2COOH), 60.15 (C-5’), 55.36 (OCH3), 33.31and 32.63 (C-6’和C-10’), 27.89 (C-7’和C-9’), 20.89 (CH3-Ph), 19.47 (CH3-Ph)。

2.2 螺蟲乙酯人工抗原鑒定結果

SDS-PAGE中相對分子質量小的化合物的電泳速度大于相對分子質量大的化合物，故由附圖4(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)可以看出，OVA和BSA的電泳速度大于螺蟲乙酯偶聯物，表明螺蟲乙酯偶聯物的相對分子質量大于OVA和BSA的相對分子質量，OVA和BSA的相對分子質量分別約為44、66 kDa，螺蟲乙酯偶聯物的條帶也在44、66 kDa附近，證明螺蟲乙酯半抗原與OVA或BSA偶聯成功。

2.3 融合小鼠血清效價

融合前3 d對免疫的小鼠血清效價進行檢測，選擇血清效價和抑制率高的小鼠加強免疫以備后續融合。其中，附表3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)顯示的是融合小鼠的血清效價，篩選出抗原抗體的組合為：包被抗原螺蟲乙酯-OVA 1∶16 000，血清1:8 000，此時該融合小鼠血清對1 000 μg/L螺蟲乙酯的抑制效率最高(92.7%)，該組合用于篩選細胞。以對照孔OD值與抑制孔之間的差值至少>1.0為標準，當包被原稀釋1∶8 000時，融合小鼠的血清效價為16 000。

2.4 最佳抗原抗體工作濃度的確定

由附表4(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)可知，當包被原螺蟲乙酯-OVA稀釋16 000 倍(0.062 5 mg/L)、腹水(mAb 3D11G7)稀釋16 000倍時，對照孔的OD450nm值在1.00左右，且抑制孔的抑制率>90%，故該組合為建立標準曲線的最佳抗原抗體工作濃度組合。

2.5 icELISA檢測螺蟲乙酯的標準曲線

在最佳抗原抗體的工作濃度下，以一定濃度梯度的螺蟲乙酯為橫坐標，其在450 nm處的OD值為縱坐標，通過Logistic函數進行擬合得到標準曲線，如圖2所示，抗體mAb 3D11G7的IC50值為2.1 μg/L，檢測范圍IC20～IC80為0.5～8.6 μg/L，相關系數R2=0.999 7。這表明，利用本研究設計合成的螺蟲乙酯半抗原偶聯大分子蛋白進行免疫能夠制備出特異性識別螺蟲乙酯的單克隆抗體。

圖2 icELISA檢測螺蟲乙酯的標準曲線Fig.2 Inhibition curve of the icELISA for spirotetramat

2.6 抗螺蟲乙酯單克隆抗體特異性分析

為了評估抗螺蟲乙酯單克隆抗體mAb 3D11G7的特異性，選擇與螺蟲乙酯結構類似的化合物進行交叉反應實驗，結果如表1所示。單克隆抗體mAb 3D11G7與螺蟲乙酯的代謝物B-enol、B-glu的CR分別為72.4%和15.2%，與B-keto和B-mono幾乎沒有交叉反應(CR< 0.01%)。螺蟲乙酯的完全抗原是通過B-enol的羥基與載體蛋白進行偶聯的，與羥基相對的B-enol另一部分暴露在載體蛋白表面，這就導致抗體mAb 3D11G7可以區分B-mono和B-keto中的吡咯烷環，但不能區分螺蟲乙酯中的碳酸乙酯基團和B-glu中的糖苷基團。由于螺蟲乙酯與其他的殺螨劑螺螨酯、乙螨唑、唑螨酯和噠螨靈的結構差異相對較大，mAb 3D11G7與它們幾乎沒有交叉反應(CR<0.01%)。

表1 螺蟲乙酯單克隆抗體的交叉反應率Table 1 Cross-reactivity of the monoclonal antibodies against spirotetramat structural analogs

2.7 緩沖液中有機溶劑對icELISA的影響

為了評估緩沖液中的有機溶劑對icELISA的影響，選擇農藥提取過程中最常用的兩種有機溶劑甲醇和乙腈，配制含不同濃度有機溶劑的PBSTG溶液，通過icELISA測定抗原抗體結合情況并計算IC50。如附圖5-A(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，當甲醇的體積分數為5%時，測得的IC50值為2.88 μg/L大于不含有機溶劑測得的IC50(2.1 μg/L)，且隨著甲醇濃度的增加，B0值變化不大，但IC50值逐漸增大，當甲醇體積分數為40%時，IC50為55.12 μg/L，這表明甲醇對mAb 3D11G7與包被原的結合能力有影響，且高濃度的甲醇使icELISA的靈敏度下降。如附圖5-B(https：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，當乙腈體積分數為5%時，測得的IC50值為3.75 μg/L大于不含有機溶劑測得的IC50值(2.1 μg/L)，當乙腈體積分數由5%升高至10%，B0值變化不大，但IC50值由3.75 μg/L上升至6.84 μg/L，當乙腈體積分數由5%升高至20%，B0值由1.08降至0.55，IC50值由3.75 μg/L上升至14.73 μg/L，這表明乙腈對mAb 3D11G7與包被原的結合能力有影響，且高濃度的乙腈使icELISA的靈敏度下降。因此在使用icELISA測定樣品中的螺蟲乙酯時，應將樣品提取液中的有機溶劑除去，再使用樣品稀釋液PBSTG復溶。

2.8 緩沖液的pH對icELISA的影響

為了評估緩沖液的pH對icELISA的影響，配制不同pH值的PBSTG溶液，通過icELISA測定抗原抗體結合情況并計算IC50值。如附圖6(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，不同pH值條件下的IC50值差異不大，但pH值為7.4時的B0值最大，即在該pH值條件下mAb 3D11G7與包被原的結合能力最強且靈敏度最高，故在測定實際樣品時，直接使用PBSTG溶液進行復溶而無需調節稀釋液的pH值。

2.9 加標回收率

采用加標回收的方法評估基于抗螺蟲乙酯單克隆抗體建立的icELISA的準確性和重現性。根據GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》可知，我國蔬菜和水果中螺蟲乙酯的最大殘留限量(maximum residues limits，MRLs)為100～10 000 μg/L，獼猴桃除外(20 μg/L)。在河水中添加的螺蟲乙酯的水平分別為20、50、100、500 μg/L，用PBSTG稀釋后直接通過icELISA測定，結果如表2所示。在土壤、番茄和柑橘樣品中添加的螺蟲乙酯的水平分別為50、100、500、1 000 μg/L。由于有機溶劑對icELISA有影響，故使用甲醇提取后，需氮吹干燥以除去甲醇再進行測定。在河水、土壤、番茄和柑橘基質中，螺蟲乙酯的平均加標回收率變幅為72.9%～110.1%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)的變幅為0.7%～12.6%，符合NY/T 788—2018《農作物中農藥殘留試驗準則》中不同添加水平對回收率和RSD的要求(表3)。

表2 icELISA 測定樣品中螺蟲乙酯的平均加標回收率(n=3)Table 2 Recovery of spirotetramat determined by icELISA in spiked different samples (n=3)

2.10 實際樣品檢測結果

為了進一步驗證基于抗螺蟲乙酯單克隆抗體開發的icELISA的可靠性，選擇UPLC-MS/MS進行驗證。使用icELISA和UPLC-MS/MS同時測定陰性柑橘樣品(不含螺蟲乙酯)和陽性柑橘樣品(隨機浸泡的盲樣)。如附圖7(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，icELISA與UPLC-MS/MS測定柑橘樣品結果的相關性R2=0.965 2，表明兩種方法的檢測結果具有一致性。如表3所示，icELISA和UPLC-MS/MS在3個陰性柑橘樣品中均未檢出螺蟲乙酯殘留。而icELISA測得柑橘陽性樣品中螺蟲乙酯的殘留量為38.10～454.49 μg/L。除獼猴桃外，我國蔬菜和水果中螺蟲乙酯的MRLs為100～10 000 μg/L(GB 2763—2021)，本研究開發的icELISA檢測范圍為0.5～8.6 μg/L，能夠滿足蔬菜和水果中螺蟲乙酯檢測的要求。

表3 icELISA和UPLC-MS/MS測定柑桔樣品中的螺蟲乙酯Table 3 Analysis of spirotetramat in different citrus samples by icELISA and UPLC-MS/MS

3 結論與討論

在我國，螺蟲乙酯的殘留定義是螺蟲乙酯和B-enol的總和，以螺蟲乙酯表示(GB/T 2763—2021)。因此，為了開發檢測螺蟲乙酯殘留的免疫方法，抗體應該同時識別螺蟲乙酯和B-enol。CEVALLOS-CEDEO等[13-14]從螺蟲乙酯不同位點引入相似的連接臂，設計合成了2種半抗原，篩選出主要識別B-enol的單克隆抗體，建立相應的免疫分析方法，但其僅測定了葡萄、葡萄汁和葡萄酒中的螺蟲乙酯，未測定其他基質。在本研究中，半抗原是通過B-enol的羥基進行衍生，合成步驟簡單。雖然半抗原的結構在酯基部分與螺蟲乙酯不同，但在與BSA或OVA偶聯后，螺蟲乙酯和B-enol的共同結構暴露在載體蛋白表面，故篩選出的抗體mAb 3D11G7能夠同時識別螺蟲乙酯和B-enol。基于篩選到的單克隆抗體，建立了icELISA，其IC50值為2.1 μg/L，最佳工作范圍為0.5～8.6 μg/L。在河水、土壤、番茄和柑橘樣品基質中的平均加標回收率為72.9%～110.1%。此外，icELISA還成功應用于檢測陽性柑橘樣品中的螺蟲乙酯殘留，其結果與UPLC-MS/MS方法的檢測結果具有一致性。因此，本研究基于抗螺蟲乙酯單克隆抗體建立的icELISA是快速檢測蔬菜、水果和環境基質中螺蟲乙酯殘留的良好選擇。