添加劑對紫花苜蓿青貯品質及小腸可吸收氨基酸的影響

張海鉉，霍文婕，陳 雷，劉 強，張拴林，王 聰，許慶方，郭 剛

(山西農業大學動物科學學院，山西 太谷 030801)

紫花苜蓿蛋白質含量高，是反芻動物的優質粗飼料。青貯是紫花苜蓿主要的加工貯藏手段之一，但紫花苜蓿緩沖能值高，可溶性碳水化合物含量低，青貯難以成功[1]。補充添加劑是解決紫花苜蓿青貯問題的有效手段。近年來，乳酸菌添加劑已經在苜蓿青貯生產中廣泛應用，可提高青貯發酵品質[2]。并且同型發酵乳酸菌的青貯效果優于異型發酵乳酸菌，這是由于同型發酵以產生乳酸為主，可迅速降低pH值，抑制不良微生物的生長，提高青貯營養價值[3]。添加乳酸菌還可以減少青貯過程中蛋白質和氨基酸的分解，進而減少氨態氮(Ammonia nitrogen，NH3-N)的生成，降低干物質(Dry matter，DM)損失[4-5]。

單寧是一種植物次級代謝產物，多酚羥基化學結構及性質使其具有較強的抑菌和抗病毒作用。添加單寧可以提高青貯飼料的發酵品質，Ka-malak等[6]發現添加橡木縮合丹寧能夠降低苜蓿青貯中乙酸、丁酸濃度，提高乳酸和丙酸濃度，改善苜蓿青貯的發酵品質。李成云等[7]發現紫花苜蓿青貯中添加榛子(Hazelnut)葉縮合單寧迅速降低青貯pH值，增加青貯乳酸含量，減少發酵過程中營養物質損失，提高青貯發酵的品質。單寧還具有與蛋白質結合，減少蛋白質分解的作用。研究發現，在瘤胃pH值為5～7時，單寧可以降低瘤胃蛋白表面活性，從而保護蛋白質在瘤胃中不易被降解[8]，增加機體氮的利用效率[9]。另外，在青貯過程中，單寧與乳酸菌組合添加具有一定的協同作用[10]，從而為單寧在動物飼草料加工中的應用提供了新的研究思路。

氨基酸是蛋白質的基本單位，若日糧中氨基酸組成符合動物營養需要，則可顯著提高動物生長效率、減少廢物排出，對環境保護具有重要意義，但由于日糧組成變化較大以及瘤胃微生物的作用，使得目前還無法準確評估反芻動物氨基酸的營養需要及生物學價值[11]。幼齡反芻動物的消化系統類似于單胃動物，瘤胃功能尚未健全，所需要的營養物質，如氨基酸必須從日糧中獲得，因而氨基酸組成及供給十分重要。紫花苜蓿蛋白質含量高，氨基酸種類齊全[12]，可為反芻動物提供必需氨基酸。紫花苜蓿青貯中使用添加劑可抑制蛋白質降解，提高發酵品質，為動物機體提供更為豐富的氨基酸。郭旭升等[13]研究發現添加甲酸可以有效抑制紫花苜蓿青貯中蛋白質的降解，提高總氨基酸含量。

目前，關于乳酸菌和單寧作為青貯添加劑的研究，主要集中在降低苜蓿青貯飼料干物質和蛋白質損失，以及粗蛋白質構成方面，對于青貯飼料中的氨基酸組分變化及小腸可吸收氨基酸含量的影響研究較少。苜蓿青貯已經成為奶牛日糧的重要組成部分，氨基酸平衡，特別是必需氨基酸的供給對于奶牛生產性能的提升至關重要。為此，本試驗通過紫花苜蓿青貯添加縮合單寧(葡萄籽單寧)和復合乳酸菌，研究添加劑對紫花苜蓿青貯飼料發酵品質、營養價值及小腸可吸收氨基酸組成的影響，以期為紫花苜蓿青貯生產中添加劑的應用和反芻動物氨基酸營養理論提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

試驗設四個處理組：對照組(CK)；復合乳酸菌組(戊糖乳桿菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌，1∶1∶1，L)；葡萄籽單寧組(G)；復合乳酸菌+單寧酸組(LG)。葡萄籽單寧購置于潤澤生物科技有限公司，純度97%；戊糖乳桿菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌為實驗室自有菌株。處理組復合乳酸菌的添加量為106cfu·g-1鮮重(Fresh weight，FW)，葡萄籽單寧添加量為3%干物質(Dry matter，DM)。葡萄籽單寧添加量參考Tabacco等[8]報道紫花苜蓿青貯中單寧添加量。同時，三種乳酸菌均能耐受此單寧濃度。

1.2 青貯制作

紫花苜蓿(品種‘SR 4030’)種植于山西農業大學動物科學學院試驗站(112°35′25″E，37°25′08″N，海拔783 m)，于第二茬現蕾期刈割，留茬高度為5 cm，田間凋萎4.5 h至干物質含量在350 g·kg-1FW左右，用鍘刀切碎至2 cm左右，并進行徹底混勻，取樣分析其化學組分、微生物數量和氨基酸組分(表1)。試驗添加所用乳酸菌，于試驗前一天經分別活化后，置于恒溫搖床上厭氧培養36 h，測定乳酸菌數量，按照菌落數量1∶1∶1混合，復合乳酸菌添加量達到106cfu·g-1FW；葡萄籽單寧添加量為3% DM，將其用蒸餾后溶解后均勻噴灑至紫花苜蓿；LG組兩種添加劑按等體積進行添加，復合乳酸菌添加量為106cfu·g-1FW，葡萄籽單寧添加量為3% DM；對照組添加等體積的蒸餾水。將各處理組紫花苜蓿500 g放入帶有單向排氣閥的聚乙烯真空袋中，抽真空并密封，每組處理5個重復，至于環境溫度(20℃～25℃)條件下保存。青貯60 d后開袋取樣，分析其發酵指標。

表1 紫花苜蓿鮮樣營養價值、附著微生物數量和氨基酸組成Table 1 Nutrient value,epiphytic microbial amount and amino acid contents of alfalfa

1.3 測定指標及方法

取青貯后樣品20 g，加入60 g蒸餾水完全浸沒，4℃靜置24 h，用四層濾布及快速濾紙過濾，得到青貯浸提液，用于測定pH值、乳酸、揮發性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)和氨態氮(NH3-N)。pH值采用pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司LE438型)測定；乳酸含量采用對羥基聯苯比色法測定[14]；VFA含量采用氣相色譜儀(GC-TRACE 1300，色譜柱型號為30 m×0.25 mm×0.25 μm)測定[15]；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]測定。中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)含量采用Van Soest方法利用濾袋技術測定[17]。采用體外三步法[18]測定蛋白質及氨基酸小腸消化率。簡要步驟為晨飼前采集3頭瘤胃瘺管荷斯坦奶牛的瘤胃液，經4層濾布過濾至39℃保溫瓶中，將瘤胃液與人工唾液(按照Longland等[19]描述的方法配制)按照1∶1充分混勻，并持續通入CO2保持厭氧環境，以維持瘤胃微生物的活性。稱取新鮮青貯發酵樣品1 g于發酵瓶中(體積為120 mL)，加入90 mL發酵液，每個處理組3個重復，同時設置3個空白組(只有發酵液)，將發酵瓶置于恒溫水浴搖床中發酵16 h，模擬瘤胃發酵[20]后，測定發酵液pH值、NH3-N和VFA濃度，同青貯浸提液測定方法。稱取瘤胃發酵后飼料殘渣，先經過胃蛋白酶(1 g·L-1，Sigma P-7012)處理(38℃震蕩水浴1 h)，再經過胰酶(3 g·L-1，Sigma P-7545)作用(38℃震蕩水浴24 h)，然后加入三氯乙酸溶液終止酶反應，沉淀未消化蛋白。發酵后的飼料殘渣，采用冷凍干燥法測定體外干物質降解率(DMD)及各氨基酸組分含量。氨基酸分析前處理根照GB/T18246-2019[21]酸水解法進行，采用全自動氨基酸分析儀(Biochrom 30+)[22]測定，流動相流速25 mL·h-1，茚三酮流速20 mL·h-1，進樣量為20 μL，脯氨酸在波長440 nm處測定，其它種類氨基酸在570 nm波長下進行測定。

1.4 數據統計

試驗數據采用GLM(SAS 9.0)進行復因子方差分析。各處理組之間均值差異采用Tukey’s多重比較檢驗，以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 添加劑對紫花苜蓿青貯發酵特性及各氨基酸組分的影響

如表2所示，與對照組相比，添加復合乳酸菌組顯著增加了青貯飼料中粗蛋白含量(P<0.05)，顯著降低了丁酸含量(P<0.05)。與對照組比，添加葡萄籽單寧組及兩者組合添加組均顯著降低了青貯飼料中乳酸、乙酸、丁酸、總揮發酸及氨態氮含量(P<0.05)，而添加葡萄籽單寧單獨組顯著增加了青貯飼料干物質及粗蛋白含量(P<0.05)。與單獨添加復合乳酸菌組相比，兩種添加劑組合添加顯著提高了青貯飼料乳酸/乙酸比值(P<0.05)，顯著降低了青貯飼料中乙酸、丁酸、總揮發酸、氨態氮及粗蛋白含量(P<0.05)。與單獨添加單寧組相比，兩者組合添加顯著提高了青貯飼料中乳酸/乙酸比值(P<0.05)，顯著降低了青貯飼料中的乙酸、總揮發酸、氨態氮及粗蛋白的含量(P<0.05)。各添加劑處理組對青貯飼料丙酸、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量沒有顯著影響。

表2 復合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料發酵參數和營養價值的影響Table 2 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on fermentation parameters and nutrient value of alfalfa silage

如表3所示，除Val外，青貯飼料必需氨基酸含量均受到復合乳酸菌添加的顯著影響(P<0.05)，而非必需氨基酸只有Gly和Cys受到復合乳酸菌添加的顯著影響(P<0.05)；葡萄籽單寧添加顯著影響青貯飼料除Met，Phe和Val外的所有必需氨基酸，以及非必需氨基酸中的Ser和Cys含量(P<0.05)；兩者組合添加除對青貯飼料Met，Phe，Ser，Glu和Pro含量沒有交互效應外，其余氨基酸均存在交互效應(P<0.05)。與對照組相比，復合乳酸菌添加顯著增加了紫花苜蓿青貯飼料必需氨基酸組分中的Met含量和非必需氨基酸組分中Asp和Cys含量(P<0.05)，而Ile，Tyr和Thr含量顯著降低(P<0.05)；葡萄籽單寧添加顯著提高了青貯飼料必需氨基酸組分中的Ile，Leu，Lys，His，Arg，Tyr含量(P<0.05)和非必需氨基酸組分中的Asp，Ser，Ala，Cys含量(P<0.05)，同時TAA含量顯著提高(P<0.05)；兩種添加劑組合添加顯著提高了青貯飼料Cys含量(P<0.05)，而Tyr和Thr含量顯著降低(P<0.05)。

表3 復合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料氨基酸組成的影響Table 3 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on amino acid contents of alfalfa silage 單位：g·kg-1DM

2.2 添加復合乳酸菌及葡萄籽單寧青貯對體外瘤胃發酵特性及小腸可吸收氨基酸的影響

如表4所示，復合乳酸菌添加顯著提高青貯飼料干物質降解率(P<0.05)，葡萄籽單寧添加顯著提高瘤胃微生物蛋白產量(P<0.05)。

表4 復合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料體外瘤胃發酵參數的影響Table 4 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on rumen fermentation parameters of alfalfa silage in vitro

如表5所示，與對照組相比，添加復合乳酸菌顯著提高青貯飼料Cys以及TAA的小腸吸收量(P<0.05)；葡萄籽單寧添加提高青貯飼料His，Arg，Ser，Glu，Cys和TAA的小腸可吸收量(P<0.05)；兩者組合添加顯著提高青貯飼料中Glu和Cys的小腸可吸收量(P<0.05)。

表5 復合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料小腸可吸收氨基酸組成的影響Table 5 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on the contents of absorbable amino acids in the small intestine of alfalfa silage 單位：g·kg-1DM

3 討論

3.1 復合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料發酵特性的影響

青貯是復雜的微生物發酵過程，受多因素調控[23]，為提高青貯品質，復合添加劑的應用也越來越廣泛。添加單寧可抑制不良微生物對碳水化合物和蛋白質的利用，提高飼料營養價值[24]，本研究中添加葡萄籽單寧使苜蓿青貯飼料pH值，VFA及NH3-N含量顯著降低，減少營養物質損失。單寧種類及乳酸菌種類的選擇是影響單寧調控乳酸菌的因素[25]。葡萄籽縮合單寧對乳酸菌具有一定抑制作用[26]，本研究中葡萄籽單寧添加顯著降低青貯飼料中的乳酸含量，抑制乳酸菌生長代謝。青貯過程中NH3-N的生成主要是由于植物和微生物蛋白酶對飼料蛋白質的降解作用。單寧具有一定抑制蛋白降解的作用[27]，本研究中葡萄籽單寧單獨或組合添加均能顯著降低青貯飼料的NH3-N含量，抑制蛋白質降解。本研究中所選乳酸菌均為前期菌株篩選鑒定過程中產酸特性較好的菌株，但復合乳酸菌處理組青貯飼料的pH值和NH3-N含量與對照組無顯著性差異，這可能是由于青貯原料中水溶性碳水化合物含量較低，而附著乳酸菌數量較高，本研究中青貯原料附著乳酸菌達到105cfu·g-1FW以上。Muck等[28]證實青貯材料附著乳酸菌數量達到105cfu·g-1FW以上，乳酸菌外源添加劑的作用有限。另外，植物蛋白水解酶在pH值為5.0～6.0[29]范圍內表現出較高的活性。因此，復合乳酸菌添加并未表現出明顯的pH值和NH3-N變化。丁酸是蛋白質、葡萄糖和乳酸被腐敗菌等有害微生物分解所產生的，本試驗中紫花苜蓿經田間凋萎后，干物質含量達到350 g·kg-1，青貯原料水分活度降低，抑制梭菌生長[30]。葡萄籽單寧添加組丁酸含量顯著降低，是由于單寧具有強烈的抑菌作用，抑制了梭菌的生長，從而減少了丁酸產生。

葡萄籽單寧的添加顯著提高了青貯飼料的干物質含量，這與其抑制不良微生物作用有關。與紫花苜蓿原料相比，各添加劑處理組的蛋白質含量略有增加，其原因可能是復合乳酸菌及葡萄籽單寧對蛋白質具有一定的保護作用，而乳酸菌發酵過程中利用可溶性碳水化合物[31]，產生了揮發性物質，干物質含量減少，使青貯飼料中蛋白質含量相對增加。與對照組相比，單寧添加劑組增加了青貯飼料中粗蛋白質的含量。這是由于單寧與蛋白質可以形成復合物，從而抑制植物和微生物蛋白的降解[32]。復合乳酸菌添加同樣顯著提高了青貯飼料的粗蛋白質含量，然而兩種添加劑組合應用并未顯示良好的效果，可能是紫花苜蓿青貯中添加單寧抑制乳酸菌的生長，使得兩種添加劑組合添加應用不具備相互促進作用[33]。所有處理組的NDF和ADF含量無顯著性差異，這與徐生陽等[34]的研究結果一致，說明添加復合乳酸菌及葡萄籽單寧有利于紫花苜蓿青貯營養物質的保存。

紫花苜蓿青貯過程中蛋白質降解主要是由于植物蛋白酶和微生物的作用。本試驗青貯飼料Arg被大量分解，其他氨基酸也有不同程度的降低，但Gly，Ala，Pro和Leu增加，這是青貯過程中植物蛋白酶的降解作用和微生物蛋白合成的共同作用[35]。葡萄籽單寧處理組的TAA含量最高，這是由于葡萄籽單寧與蛋白質形成穩定的復合物，阻礙了蛋白酶的分解作用。復合乳酸菌與葡萄籽單寧組合處理組的TAA含量低于單獨添加葡萄籽單寧組，與上述蛋白質含量結果一致。與對照組相比，復合乳酸菌添加可以提高青貯飼料中的Cys含量，而對其他氨基酸沒有影響，這可能與乳酸菌菌種代謝[36]有關，有待于進一步研究。

3.2 復合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料體外瘤胃發酵特性及小腸可吸收氨基酸的影響

瘤胃液pH值是評定瘤胃內環境是否穩定的重要指標[37]。各處理組瘤胃液pH值均在正常值6.2～7.0范圍內[38]。對于體外發酵體系，青貯飼料底物有限，通常難以影響瘤胃pH值[39]。本試驗中添加葡萄籽單寧提高瘤胃MCP的產量，添加單寧減緩蛋白及碳水化合物的降解，為瘤胃微生物提供更多營養成分[40]。瘤胃干物質降解率是影響干物質采食量的重要因素[41]。本試驗中添加復合乳酸菌顯著提高了干物質降解率，乳酸菌有助于瘤胃其他有益菌的生長[42]，從而提高飼料營養物質在瘤胃內的降解[43]，陳雷等[33]也得出相似研究結果。葡萄籽單寧處理組干物質降解率最低，與其具有一定的抑制微生物生長的作用有關。

蛋白質的利用效率與小腸可吸收氨基酸含量和組成有關。在反芻動物新蛋白體系中，小腸可吸收氨基酸用以評價飼料蛋白質的營養價值[44]。小腸可吸收氨基酸主要來源于瘤胃微生物蛋白和飼料非降解蛋白質[45]，提高小腸可吸收氨基酸含量有利于提高反芻動物的生產性能。在pH值為5～7時，縮合單寧可與蛋白質結合，降低瘤胃蛋白表面活性，從而保護蛋白質在瘤胃中不易被降解[8]，還可以增加瘤胃液的黏性，減少泡沫和胃脹氣的產生，增加機體氮的利用效率[9]。葡萄籽單寧處理組小腸可吸收氨基酸含量最高，這是由于在瘤胃中葡萄籽單寧與植物蛋白質形成穩定復合物，抑制瘤胃微生物的分解作用，并且在酸性條件下不易被分離，使得過瘤胃蛋白質增多，到達小腸的蛋白質總流量增加，從而促進小腸對氨基酸的吸收效率[8,46]。單獨添加葡萄籽單寧可以提高小腸可吸收Lys和Arg的含量，可能與葡萄籽單寧提高胰蛋白酶活性有關，使得肽鏈內切酶水解兩種氨基酸之間的肽鍵[47]。添加劑處理組均提高了小腸可吸收Cys和Glu的含量，這是由于添加復合乳酸菌及葡萄籽單寧提高了青貯飼料中兩者的含量，同時還可能通過影響瘤胃內微生物群系提高兩種氨基酸的吸收量[48-49]。紫花苜蓿添加葡萄籽單寧青貯后，提高了青貯飼料中Lys，His等多種必需氨基酸含量，從而增加了小腸可吸收必需氨基酸的含量，對于提高反芻動物蛋白質利用和生產性能具有積極作用。

4 結論

本研究結果表明，單獨添加葡萄籽單寧以及葡萄籽單寧與乳酸菌組合添加可以降低紫花苜蓿青貯飼料中乙酸、總揮發性脂肪酸和氨態氮的含量，對青貯飼料發酵品質具有一定的改善作用，但乳酸含量降低；而單獨添加乳酸菌對青貯飼料發酵品質的改善作用效果有限；單獨添加葡萄籽單寧或乳酸菌，青貯飼料總氨基酸含量均顯著提高；添加葡萄籽單寧還可以顯著提高體外發酵微生物菌體蛋白合成量，以及小腸可吸收異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，酪氨酸和總氨基酸含量。因此，添加葡萄籽單寧在一定程度上改善了紫花苜蓿青貯飼料發酵品質和營養價值，且明顯提高了青貯飼料中必需氨基酸賴氨酸、組氨酸和精氨酸，以及總氨基酸的小腸可吸收量。