組成型雄烷受體人源化小鼠模型的構建與驗證

李海山，謝文平，周麗麗，沈國林，宋乃寧，陳會明

（中國檢驗檢疫科學研究院化學品安全研究所，北京 100176）

代謝綜合征是導致糖尿病、心腦血管疾病的危險因素，而糖尿病、心腦血管疾病是社會關注度高、威脅人類健康的重要疾病。國際糖尿病聯盟預測2045年世界上約有6.93億糖尿病患者［1］。組成型雄烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）在外源化學物代謝、能量代謝、內分泌激素代謝等過程中發揮重要作用，是機體對外源性化學物暴露的感受器［2-3］。外源性化學物通過對CAR活化特性的激活/拮抗，干擾機體對環境暴露的其他外源化學物代謝過程、內源物質的代謝過程、能量代謝的穩態，進而導致代謝紊亂和毒物-毒物相互作用。在已知的人類核受體超家族中，CAR 對化學物的應答存在顯著的物種差異［4］，給動物實驗測試數據外推到人帶來挑戰和不確定性。基于CAR 在代謝干擾研究領域的重要性和物種差異特性，構建表達人源化CAR 的動物模型具有重要意義。本研究通過基因編輯技術分別構建CAR基因敲除小鼠模型和表達人源CAR全序列轉基因小鼠模型，雜交得到不表達小鼠自身CAR、僅表達人源CAR的小鼠模型，并對其表達水平、剪接變異體、物種特異性化學物應答等特征開展鑒定和有效性評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 野生型C57BL 小鼠，8 周齡，雌性10只用于繁育，雄性20只用于繁育和實驗，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（生產許可證號SCXK［京］2021-0006）。動物常規喂養于獨立通風籠具，自由飲水；光照12 h，黑暗12 h，溫度21～26 ℃，日溫差不超過4 ℃，相對濕度40%～70%。CAR基因敲除小鼠模型由賽業（廣州）生物技術有限公司按設計方案實施，表達人源CAR全序列轉基因小鼠模型由中國醫學科學院實驗動物研究所按設計方案實施。獲得的陽性首建鼠在本課題組實驗室繁育、雜交和鑒定。

1.2 主要儀器及試劑 熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司），超速低溫離心機（德國Sigma 公司），超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），核酸分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

6-（4-氯苯基）咪唑并［2，1-b］［1，3］噻唑-5-甲醛-O- （3，4-二氯苯基） 肟（CITCO，CAS號：338404-52-7）、1，4-雙-［2-（3，5，二氯吡啶氧基）］苯（TCPOBOP，CAS號：76150-91-9）、橄欖油（美國Sigma 公司），Trizol、反轉錄試劑盒及SYBR預混試劑盒（日本Takara公司），組織裂解液（北京維通達生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1CAR基因敲除小鼠模型的構建 按照轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALEN）方法構建。剪取4周齡鼠尾尖于組織裂解液中。擴增CAR-KO上游引物：5′-TAACCCACAGAAGAAGGCTATGCCC-3′，CAR-KO 下游引物：5′-CATACCAGTCTTTAATCGGAGACCGG-3′，野生型小鼠擴增片段長度為370 bp，單向測序引物：5′-GGTCTGACTTACCGAGCGAGCAC-3′。

1.3.2 表達人源CAR全序列轉基因小鼠模型的構建 按照細菌人工染色體大片段序列轉基因方法構建。細菌人工染色體克隆RP11-297K8 含人源CAR全長序列，長度173 000 bp。剪取4 周齡鼠尾尖于組織裂解液中。擴增閱讀框前區（Up）上游引物：5′-CCAGGAAGTCAGCAGAAGAGG-3′，Up下游引物：5′-GGAAGAGAAGAAGGGTGGGA C-3′，產物長度435 bp；閱讀框區（CAR）上游引物：5′-CAGCGCATTAAAGTGGTAGCC-3′，CAR下游引物：5′-GCCTAGGTGACAGAGCAAGAAC-3′，產物長度301 bp；閱讀框后區（Down）上游引 物：5′-CCACGCCCAGACTGACTTATTAC-3′，Down 下 游 引 物：5′-GGAGAATCGCTTGAACCAGG-3′，產物長度314 bp。

1.3.3 肝、腸組織CAR基因表達水平和肝組織人源CAR剪接變異體豐度 采用熒光定量PCR 法。取8周齡雄性野生型、CAR人源化小鼠各3只，二氧化碳麻醉處理后，摘取肝、腸組織，剪取來源于3個人體的人肝組織塊（該數據為第一作者在美國從事博士后研究期間在馬里蘭大學藥學院使用實驗室保存的人肝組織塊總RNA 測試），按照Trizol試劑盒的操作要求提取總RNA，采用分光光度計在260 nm 和280 nm 波長處測定其光密度值，驗證總RNA的濃度與純度。按照反轉錄試劑盒操作說明，將樣本中的mRNA轉錄為互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。應用實時定量PCR 儀，測定各樣本等質量總RNA的mRNA的循環閾值（cycle threshold，Ct）值。小鼠CAR上 游 引 物： 5′- CCCTGACAGACCCGGAGTTA-3′，小鼠CAR下游引物：5′-GCCGAGACTGTTGTTCCATAAT-3′；人源CAR上游引物：5′-GAGCTGAGGAACTGTGTGGTA-3′，人源CAR下游 引 物：5′-CTTTTGCTGACTGTTCTCCTGAA-3′；人源CAR剪接變異體SV02（擴增0、2 型共用）上游引物：5′-AGATGGAGCCCGTGTGGG-3′；SV13（擴增1、3型共用）上游引物：5′-GAAGATGGAGCCCGTGTATCTC-3′；SV4（擴增4 型專用）上游引物：5′-AGATGGAGCCCGTGACCG-3′；SV01（擴增0、1 型共用）下游引物：5′-GGTAACTCCAGGTCGGTCAGG-3′；SV23 （擴 增2、3 型共用）下游引物：5′-AACTCCAGGTCGGTCTGTAAGAT-3′；SV4（擴增4型專用）下游引物：5′-TGCTGGCCCTTGATGTAGCT-3′。

1.3.4 物種特異性激活劑應答反應 通過比較給予激活劑后肝組織CAR典型靶基因細胞色素P450（cytochrome P450，CYP） 2B和3A相對表達水平。8周齡雄性野生型、CAR基因敲除小鼠、人源化CAR小鼠各9只，分為對照、TCPOBOP、CITCO組，每組3只。對照組腹腔注射橄欖油10 ml/kg體重，連續3 d，于末次注射24 h后二氧化碳麻醉處死小鼠，摘取肝組織；TCPOBOP用橄欖油配制為0.3 mg/ml 溶液，單次腹腔注射3 mg/kg 體重，注射72 h 后取小鼠肝組織；CITCO 用橄欖油配制為2 mg/ml溶液，腹腔注射20 mg/kg體重，連續3 d，于末次注射24 h 后取小鼠肝組織。CYP2B上游引物：5′-TCCTGACCAGTTCCTGGATG-3′，CYP2B下 游引 物：5′-CTGGAGGATGGACGTGAAGAA-3′，擴增產物長度162 bp；CYP3A上游引物：5′-GTCAAACGCCTCTCCTTGCTG-3′，CYP3A下 游引物：5′-GGCTTGCCTTTCTTTGCCTTC-3′，擴增產物長度277 bp；內參照基因β-actin上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，β-actin下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，擴增產物長度181 bp。以目的基因與內參照基因計算目的基因相對表達水平，相對表達量=2-△△Ct。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CAR基因敲除小鼠鑒定結果 經測序鑒定，其CAR外顯子區缺失10 bp 堿基序列（GATATCAACA），見圖1加框部分。

圖1 CAR基因敲除小鼠測序

2.2 人源CAR轉基因小鼠鑒定結果 經特異性引物擴增片段鑒定，人源CAR轉基因小鼠基因組中擴增出人源CAR基因片段，細菌人工染色體中CAR序列、上游、下游片段，典型鑒定結果見圖2。

圖2 人源CAR轉基因小鼠特異片段擴增鑒定

2.3 野生型、CAR基因敲除、CAR人源化小鼠肝、腸組織CAR基因表達水平CAR基因敲除小鼠肝、腸組織不表達任何CAR；野生型小鼠肝組織鼠源CAR表達水平為（24.1±1.2），與CAR人源化小鼠人源CAR的表達水平（23.8±1.4）接近；野生型小鼠腸組織的鼠源CAR表達水平為（25.6±1.5），而CAR人源化小鼠人源CAR表達水平為（30.6±2.1），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.4CAR人源化小鼠肝組織CAR剪接變異體表達豐度 對人源5 種主要CAR 剪接變異體（SV0-SV4）的肝表達豐度與人肝組織豐度相比較，結果顯示二者此5 種主要CAR 剪接變異體肝組織表達豐度非常接近。見圖3。

圖3 CAR人源化小鼠肝組織與人肝組織主要CAR剪接變異體豐度

2.5 物種特異性激活劑應答 野生型、CAR基因敲除、CAR人源化小鼠肝組織CAR 兩種典型靶基因（CYP2B、CYP3A）在給予物種特異性激活劑CITCO（人源CAR 激活）、TCPOBOP（鼠源CAR激活）與相應溶劑對照組相對表達水平，野生型小鼠給予TCPOBOP后肝組織2種靶基因表達水平顯著誘導，此種誘導效應在CAR基因敲除小鼠完全消失；CAR人源化小鼠僅對人特異性激活劑CITCO 產生應答，肝組織細胞色素P450 2B、3A表達顯著升高，見表1。

表1 小鼠物種特異性激活劑應答（n=3）

3 討論

本研究構建了CAR基因敲除小鼠和人源CAR轉基因小鼠，雜交獲得了CAR人源化小鼠。構建的CAR人源化小鼠主要優點：轉入基因片段包含CAR基因全序列及上下游調控序列，表達水平與鼠CAR相當（生理水平表達）；肝組織表達人CAR主要剪接變異體，其表達豐度與人肝組織相當［5］；主要臟器CAR表達模式與人相當，不同于小鼠CAR臟器分布（人CAR優勢表達于肝臟，小鼠CAR優勢表達于肝臟和小腸）［6］。

在已知的人類48種核受體中，CAR配體結合域基因序列在人與常用實驗動物大鼠、小鼠之間差異最大［4］，因此對外源化學物的應答表現出顯著的物種特異性，常被用作物種特異性的工具化學物CITCO特異性激活人源CAR，對大鼠、小鼠CAR均無明顯作用［7］；反之，TCPOBOP則特異性激活鼠源CAR，對人源CAR無明顯作用［8］。本研究建立的CAR 人源化小鼠表現出期望的表型。目前國際上高通量篩選平臺對數萬種化學物樣本庫進行了CAR 活性的體外篩選［9］，但由于化學物在體內經過吸收、分布、代謝、排泄復雜過程，尤其是經過生物轉化作用生成一系列的代謝物，亟待開發有效的體內模型進行驗證。化學物安全性評價動物實驗最常使用的嚙齒類動物是大鼠，機制研究使用小鼠也較普遍，由于化學物對CAR 活性調節的物種差異，很可能過高估計或過低估計化學物的毒理學效應，尤其代謝干擾效應介導的有害結局。應用本研究構建的CAR 人源化小鼠有助于對關注的化學物體外篩查結果進行體內驗證，為風險評估過程中物種差異的不確定度評價提供科學依據。

機體代謝穩態主要通過一類稱為外源物核受體或代謝核受體的轉錄因子超家族而發揮作用，CAR是其中重要的成員，與孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）、芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）等共同構成調控網絡，2007年美國國家研究委員會（NRC）將PXR/CAR/PPAR/AhR 途徑列為體外測試毒性途徑之一［10］。近年來毒理學界有害結局路徑（Adverse outcome pathway，AOP）概念及框架方興未艾，CAR 在促癌、膽汁淤積等AOP中發揮重要作用，受到廣泛重視［11］。由于這些調節子呈現網絡調控，尤其PXR與CAR作用和激活劑之間更是密切關聯，本課題組對PXR 也開展了基因編輯模式動物的工作，將產生PXR/CAR人源化小鼠，提供深入研究的有力工具。