高效耐鹽堿石油烴降解菌篩選及降解特性研究

王之語，原隴苗，劉艷紅，馬榮，吳應琴

1.中國科學院西北生態環境資源研究院/甘肅省油氣資源研究重點實驗室，蘭州 730000

2.中國科學院大學，北京 100049

0 引言

石油作為戰略物資和工業命脈，在現代經濟的發展中具有舉足輕重的作用。然而，由于不當操作或事故造成的溢油污染事件頻發，給周邊環境造成了嚴重污染。石油烴是石油中最主要的成分之一，主要由烷烴、芳香烴構成，也含有少量的含硫、含氮化合物。其中烷烴逐漸沉積到土壤、地下水與海洋中，極易造成持久性環境污染，還會對底棲生物造成威脅[1]，芳香烴中多環芳烴不但難以降解而且具有致癌性，會通過食物鏈進入人體，威脅著人類的生命健康[2]。同時，溢油會使土壤中總有機碳上升，碳氮比例失調，改變土壤的理化性質從而影響土壤微生物數量及群落結構，對土壤環境造成破壞。因此，石油污染土壤的修復具有潛在意義[3]。

目前，針對土壤石油污染的修復主要有物理、化學和生物修復[4￣6]，其中生物修復是通過生物代謝活動來吸收轉化污染物，使其轉化為無毒無害的二氧化碳和水的方法[7]。相較于物理和化學修復而言，生物修復具有成本低、環境友好等優勢[8]。因此，本研究主要聚焦于生物修復中的微生物修復。目前已有超過兩百種具有石油烴降解能力的微生物被發現并報道，包括細菌、真菌、藻類等，且由于合成磷脂能力強，細菌對石油的降解效率往往遠高于真菌和藻類[9]。不動桿菌(Acinetobacter)、假 單 胞 菌(Pseudomonas)、棒 桿 菌（Corynebacterium）、微球菌（Micrococcus）、節細菌（Arthrobacter）、產堿桿菌（Alcaligenes）等是常見的土壤石油降解細菌[10]。但微生物降解菌通常受環境因素的限制，如溫度、鹽度、pH 等，其最適pH 為7.0 左右，偏酸性或堿性都會抑制微生物的生長及活性，同時高鹽度也會使微生物數量及成活率急劇下降[11]。Liet al.[12]在大慶油田附近的鹽堿土中分離出的耐冷嗜鹽性菌Planococcussp. ZD227 可利用苯及同系物作為碳源，張海榮等[13]從大港油田油泥中篩選出十株石油烴降解菌，研究發現過高pH值及鹽度均會嚴重影響大多數菌株的生長。因此，要得到能在西北高鹽堿環境中對石油污染進行原位修復的石油烴降解菌，則需從當地污染土壤中篩選并培養出優勢菌株。本研究選取長慶油田為研究區域，該區域地處西北，由于常年干旱少水，鹽堿積累，土壤高pH、高鹽度等特性成了石油烴污染微生物修復的主要阻力[14]。因此，亟需一種低成本、高效、環保的修復方案來針對性地解決該地區鹽堿土壤的石油污染問題。

研究通過對鄂爾多斯盆地長慶油田附近的10個石油污染土樣進行微生物培養，從中篩選出了4株高效原油降解菌株，并對其進行生化理化試驗和分子生物學鑒定。通過降解實驗研究了其對原油不同組分（烷烴、芳烴）的降解特性及其抗逆性，為西北地區鹽堿土壤石油烴污染修復提供一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣品采集

實驗所用土樣采自鄂爾多斯盆地長慶油田周邊，分布在慶城縣和西峰區兩個區域（圖1）。供試土壤樣品總有機碳含量為3.12~4.12 g/kg，鹽度為1.43%~2.03%，pH為7.1~8.6，呈中性及弱堿性。具體采樣位置見表1。

表1 土壤樣品采集點Table 1 Collection sites of soil samples containing microorganisms

圖1 長慶油田采樣點示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling points in Changqing Oilfield

1.1.2 培養基

PBS緩沖溶液（磷酸鹽緩沖溶液）：K2HPO42.75 g，KH2PO40.24 g，NaCl 8.14 g，用超純水定容至1 000 mL，pH為7.4，于121 ℃高壓滅菌20 min。

微量 元素溶 液：FeSO40.054 g，MnSO42.3 g，CuSO40.032 g，用超純水定容至1 000 mL。

無機鹽培養基：KH2PO42.42 g，K2HPO47.3 g，（NH4）2SO42 g，NaCl 2 g，MgSO40.3 g，CaCl20.03 g，微量元素溶液1 mL，用超純水定容至1 000 mL，pH 為7.0。于121 ℃高壓滅菌20 min。

富集培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，超純水1 000 mL，pH 為7.4，于高121 ℃高壓滅菌20 min。

斜面保藏培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，超純水1 000 mL，

1.2 實驗方法

1.2.1 高效石油烴降解菌的篩選、鑒定及理化性質分析

（1）石油烴降解菌的初篩

將5 g 石油污染土壤接入裝有200 mL 無菌水錐形瓶中，于30 ℃，130 r/min 條件下恒溫震蕩培養24 h。然后取出5 mL上述培養液轉接入裝有100 mL無機鹽培養基中，加入1.0%原油為唯一碳源，30 ℃，180 r/min培養10 d。取5 mL培養液加入1.0%原油無機鹽培養基中，相同條件下培養7 d，如此轉接5次后。用1 μL接種棒以平板劃線法接種到固體富集培養基中，30 ℃條件下培養48 h，對長出的菌種進行計數。待菌落長出后經過多次劃線分離后得到單一菌株，接種于牛肉膏蛋白胨斜面上在4 ℃條件下保存，并將純化菌液與甘油1∶1混合后凍存于-80 ℃冰箱中保存。

（2）菌株鑒定及生化理化特征

將單株菌用平板劃線法接種到固體富集培養基上，觀察群落形態。然后用接種環取出小塊菌苔涂在滴加了無菌水的載玻片上，并對其進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其顏色和形態。根據已有資料[15]中的方法對分離的菌株進行生化理化性質鑒定

在純化后的菌體中提取細菌的基因組DNA，使用相應的引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）/1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。PCR反應體系為：滅菌蒸餾水22 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 1 μL，27F 和1492R 引物各1 μL，DNA 模板1 μL（30~100 ng）,Taq 酶25 μL。PCR 升溫程序設定為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次，72 ℃延伸8 s。擴增產物由廣東美格基因科技有限公司使用ABI3730測序平臺進行測序。將測序結果在NCBI上進行對比，根據BLAST結果用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.2 菌株對石油烴的降解

將菌株在100 mL 富集培養基中培養48 h，用滅菌的PBS 溶液配制光密度為OD600=0.5 的純菌液，再以5%的接種量接種到無機鹽培養基中進行降解實驗（此培養基以1.0%原油為唯一碳源）。以未接種菌株的培養基為對照組，每組設置3 個平行樣，在30 ℃、180 r/min的條件下培養14 d后，用20 mL石油醚與樣品混合，經搖床震蕩10 min、180 W 超聲波細胞破碎儀提取10 min 后，用分液漏斗進行萃取。將萃取過程重復三次，合并萃取液，離心，Na2SO4去除水分轉移至容量瓶，待溶劑揮發后，再用石油醚定容至20 mL。充分搖勻后用移液槍取出200 μL樣品兩份，分別加入100 μL 0.3 mg/mL C24D50和500 μL 0.05 mg/mL 氘代萘（Nap-D）作為內標備用。利用安捷倫6890N（GC）/5973B（MSD）氣相色譜質譜聯用儀對樣品進行分析。色譜條件：HP-5MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，進樣口溫度280 ℃，色譜柱程序升溫條件：80 ℃（恒溫1 min），以4 ℃/min 升至290 ℃（恒溫30 min）。進樣量1.6 μL，無分流。質譜條件為：增強型EI 源，電離能量70 eV，四極桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；質量范圍：50~650 amu；譜庫：NIST12。掃描方式：全掃描。

在氣相色譜中不同物質的相對豐度為該物質的峰面積與內標物峰面積的比值[16]。降解率為降解前后物質的相對豐度差值與降解前物質相對豐度的比值。以未接種菌劑為對照組，由此可得到出石油烴各組分以及總石油烴降解率：

式中：A’EG為實驗組內標物峰面積，AEG為實驗組石油烴各組分峰面積，A’CK為空白組內標物峰面積，ACK為空白組石油烴各組分峰面積。

1.2.3 菌株抗逆性測試

用NaCl、NaOH、鹽酸配制不同鹽度（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%）及不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、10.0、11.0）的富集培養基100 mL，每個梯度設置三個平行組，然后將菌株接種到培養基中，在30 ℃、150 r/min 下培養48 h，以滅菌的富集培養基作為對照組，每4 h 取樣，用紫外可見分光光度計（UV-6000）測量吸光度（λ=600 nm）。

2 結果與討論

2.1 石油烴降解菌的篩選

研究以長慶油田采油廠周圍被石油污染的土壤為石油烴降解菌菌源，經過5 個周期的馴化篩選后，將10 個樣品分離出的菌株的菌種數量進行比較（表1）。除了1號樣品未篩選出石油降解菌，其余9個樣品都得到了不同數量的菌株。這可能是由于石化公司院內采集的1號土壤樣為新鮮土壤，幾乎未遭受石油污染。而已有研究發現，與石油污染土壤相比，無污染土壤中石油降解細菌數量相對較少，其數量不足微生物總量的百分之一[17]。

另外，通過對不同采樣點石油烴降解菌數量進行比較，周邊有植物綠化的采樣點（4 號、5 號、6 號）較無綠化的采樣點（1 號、2 號、3 號、7 號、8 號、9 號、10 號）來說，經馴化培養后可提取的石油烴降解菌的數量相對較多，說明植物可能對土壤細菌數量和菌落結構產生影響，這與很多學者研究的結果一致[18￣20]：說明植物對細菌具有促生作用，因此，在石油污染修復過程中植物根系對有機污染物的附著作用提高了原油利用率，使石油烴降解菌群落更加豐富。3 號的油污土壤篩選菌株在富集平板上的種類、數量都相對較少，可能是高濃度的石油烴產生了較大的毒性所致。有學者指出，一定程度上的石油污染會使其污染土壤中有效石油降解菌得到富集，但高濃度的石油會對土壤和石油降解細菌產生毒性作用，明顯降低石油降解細菌的活性，甚至導致其死亡[21]。

2.2 石油烴降解菌生化理化特性

對初篩菌株進行了復篩和降解率的計算。對其中降解率較高的4株降解菌進行了生化理化鑒定（表2）。4 株降解菌均為革蘭氏陰性菌；吲哚試驗、淀粉水解試驗、M.R 及V.P.試驗均為陰性，接觸酶試驗均為陽性，即四株菌株均為需氧菌或兼性厭氧菌，不能分解色氨酸產生吲哚，代謝葡萄糖過程中不產酸，且不能利用淀粉。可利用該結果對菌株的菌種進行初步的判定。

通過菌落形態和顯微照片對4 株石油烴降解菌的理化特性進行了進一步的觀察（圖2，3）。菌株5-5為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣整齊，單菌呈短桿狀。菌株5-X為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣不規則，單菌呈短桿狀。菌株9-2 為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣不規則，單菌呈桿狀。菌株10-3為乳白色革蘭氏陰性菌，菌落邊緣不規則，單菌呈短桿狀。結合表2生化理化鑒定結果，初步判斷5-5，5-X，10-3為不動桿菌屬（Acinetobacter），9-2 為假單胞菌屬（Pseudomonas）。

圖2 4 株菌在富集平板上的菌落形態（a）5￣5；（b）5￣X；（c）9￣2；（d）10￣3Fig.2 Colony morphology of four strains on enrichment medium(a)5￣5;(b)5￣X;(c)9￣2;(d)10￣3

表2 石油烴降解菌的生化理化特征Table 2 Biochemical and physicochemical characteristics of petroleum hydrocarbon degrading bacteria

2.3 石油烴降解菌的16S rDNA測序

為了對石油烴降解菌的種屬進行進一步鑒定，對4 株石油烴降解菌進行了DNA 提取，PCR 擴增和測序，與NCBI 數據庫進行BLAST 比對后，結果顯示5-5 為醋酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticus，與已發表菌株（MN250321.1）相似度為100%；5-X 為不動桿菌Acinetobactersp.，與已發表菌株（MK602435.1）相似度為100%；10-3為乳酸不動桿菌Acinetobacter lactucae，與已發表菌株（MH880845.1）相似度為100%；9-2 為蒙氏假單胞菌Pseudomonas monteilii，與已發表菌株（CP043396.1）相似度為100%。根據測序結果，用MEGA 軟件對5-5、5-X、9-2、10-3 四株降解菌用鄰接法構建系統發育樹（圖4，5）。

圖4 石油烴降解菌5-5、5-X、10-3 的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of petroleum hydrocarbon degrading bacteria 5-5, 5-X, 10-3

2.4 不同菌株對總石油烴的降解特性

14d 內 菌 株5-5、5-X、9-2、10-3 對 總 石 油 烴（1.0%）的降解率分別為50.92%、51.27%、78.3%、44.39%（圖6）。同時，在降解過程中接種了這四種菌株的錐形瓶中均出現了原油的乳化現象，而接種其他菌株的對照組未出現該現象（圖7），這表明菌株可能會產生一些生物表面活性劑。這是由于部分微生物新陳代謝過程中會產生生物表面活性劑，可通過降低水相與有機污染物間的表面張力使疏水相在水相中充分分散，從而增大了菌株細胞膜與有機物間的接觸面積，從而提高碳源的利用率促使降解率升高[22]。在4 株降解菌中，菌株9-2 的降解率可達到78.3%，表現出了良好的降解效果，因此選定菌株9-2進行進一步研究。石油烴降解菌Pseudomonas monteilii9-2 已于2021 年10 月25 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No.23666。

圖6 菌株對石油烴的降解率Fig.6 Degradation rate of petroleum hydrocarbon by strains

圖7 菌株降解石油烴乳化現象（a）降解前；（b）對照組；（c）降解后Fig.7 Emulsification of petroleum hydrocarbon degradation by strains(a)before degradation;(b)control;(c)after degradation

2.5 菌株9?2對原油不同組分降解特性

為了研究菌株9-2 對石油烴不同組分的降解差異，分別對對照組和實驗組降解14 d 后的殘油成分進行了GC-MS分析（圖8）。另外，為避免氣相色譜對不同類物質的響應度不同，選用了C24D50和Nap-D 兩種內標物分別進行飽和烴和芳烴組分的計算。經14 d 降解后，石油中各組分都有了大幅度地顯著下降，幾乎降解了全部正構烷烴和大部分異構烷烴（圖8），說明菌株9-2 對原油中各組分的降解能力較好。

圖8 原油降解前后氣相色譜圖（a）降解前；（b）降解后（Nap￣D為內標物氘代萘，Pr為姥鮫烷，Ph為植烷）Fig.8 Gas chromatogram of crude oil before and after degradation(a) before; (b) after (Nap￣D: internal standard, deuterated naphthalene; Pr: pristane;Ph:phytane)

圖3 4 株菌經革蘭氏染色后的顯微照片（a）5￣5；（b）5￣X；（c）9￣2；（d）10￣3Fig.3 Micrographs of four strains after Gram staining(a)5￣5;(b)5￣X;(c)9￣2;(d)10￣3

圖5 石油烴降解菌9-2 的系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of petroleum hydrocarbon degrading bacterium 9-2

為了進一步探討石油烴降解菌對原油中不同結構碳鏈化合物降解的差異，分析了菌株9-2對原油中正構烷烴、異構烷烴和和芳烴的降解率（圖9），其降解率分別為94.65%、69.73%和59.07%，降解效果顯著。此結果反應了菌株9-2 對正構烷烴降解效率較高，對異構烷烴和芳烴的降解相對較低。這是由于類異戊二烯烷烴的分支結構比正構烷烴的線性結構更加具有抗生物降解的特性[23]。因此與異構烷烴相比，石油烴降解菌9-2 更傾向于以正構烷烴做為碳源，這與前人的研究結果相一致[24]。

圖9 不同組分石油烴的降解率Fig.9 Degradation rates of different components of petroleum hydrocarbon

另外，為了更進一步地分析石油烴降解菌9-2對長鏈、中長鏈、短鏈正構烷烴和多環芳烴的降解特性，分別計算了降解14 d 前后不同碳數的正構烷烴的相對含量和不同芳烴衍生物的相對含量及其降解率（圖10~12）。經過14 d 降解后nC13到nC20的正構烷烴分別被降解了38.85%、69.88%、82.84%、90.38%、94.69%、98.13%、98.58% 和98.45%。降解前nC21到nC33正構烷烴在石油烴中占到43.62%，降解后其含量均小于檢出限，說明正構烷烴基本被完全降解。這可能是由于菌株9-2 對nC21以上中長鏈及長鏈的正構烷烴利用率相對較高；也可能是長鏈烴在降解過程中被分解成短鏈烷烴，導致短鏈烷烴降解率較低。Throne￣Holstet al.[10]在一株能降解nC10-nC40正構烷烴的不動桿菌中分離出了參與長鏈烷烴降解的基因almA，這表明不同編碼基因決定了不同細菌對長鏈烷烴和短鏈烷烴的降解潛力不同。但菌株9-2 降解中長鏈烷烴的具體途徑還有待進一步的研究。

圖10 菌株9￣2 降解原油前后不同碳數正構烷烴在飽和烴中的相對含量對比Fig.10 Comparison of relative contents of n￣alkanes with different carbon numbers in saturated hydrocarbons before and after crude oil degradation by strain 9￣2

對于芳烴，14 d 內菌株9-2 對萘、芘、菲、芴、?、苯并（k）熒蒽及苯并（e）芘及其衍生物分別降解了51.49%、62.41%、72.54%、60.86、74.53%、76.35% 及79.21%。?、芘、苯并芘、苯并熒蒽等4環以上芳烴降解率高于2~3 環。在微生物對石油烴各組分的降解中，一般對多環芳烴的降解要難于對單環芳烴和低分子量烷基芳烴的降解[25￣26]，因此高環數多環芳烴的降解也是多環芳烴污染修復的重點之一。但并非所有多環芳烴降解菌都遵循此規律，如閆雙堆等[27]以焦化廠周邊土壤為菌源篩選的11株降解菌對芘的降解率均高于對蒽的降解率，其中六株對菲的降解率高于對萘的降解率，一株對芘的降解率高于對萘的降解率，Govarthananet al.[28]分離得到的多環芳烴降解菌對芘的降解率（63.21%）高于對萘的降解率（60.12%）。在石油烴降解菌9-2的芳烴降解途徑中，結果也顯示芘系列等高環數芳香族物質相比于萘系列等低環數物質降解率更高。已有多個研究證明，某些高分子量多環芳烴具有轉化為低環數多環芳烴的降解途徑[29]。在菲的降解中，有生成萘衍生物中間體萘-1，2-二羧酸酸酐的潛力[30]。苯并[a]芘也可以通過還原生成7，8，9，10-四氫苯并[a]芘再生成芘，在4，5位上加氫生成4，5二氫芘生成中間體菲[31]。同時，苯并[a]芘也可以先生成中間體?，進而再生成菲，最終降解為CO2和水[32]。因此，各多環芳烴衍生物降解率的差異也可能是新的低環數中間體的生成導致的。本研究所用的原油中，高環數多環芳烴的相對含量遠低于低環數多環芳烴系列衍生物的相對含量。濃度不一致的情況下，盡管高環數多環芳烴的降解率大于低環數多環芳烴，但并不能證明石油烴降解菌9-2 對高環多環芳烴的效率高于低環數多環芳烴。然而，實驗結果表明石油烴降解菌9-2具有降解高環多環芳烴的潛力，具體的降解途徑和機理還需進行進一步實驗探究。

2.6 菌株9-2的抗逆性

2.6.1 菌株的pH耐受結果

通常酸堿度是影響菌株生長的重要外部因素之一。一般微生物在pH 在6.0~8.0 內擁有較高的活性和降解率，超過此范圍微生物的性能和活性都會逐漸降低[11]，因此，只有篩選出能適應當地弱堿性土壤條件的高效石油烴降解菌才能能大大提高其污染去除效率。在30 ℃、150 r/min下記錄石油烴降解菌9-2在不同pH條件下的生長曲線（圖13）。研究發現，菌株在pH為7.0和8.0時快速進入對數生長期，此時菌株生長速度最快。在24 h 后，菌株濃度達到OD600=1.7 左右，此時菌株進入衰亡期，開始出現菌株濃度下降的情況。而菌株濃度為OD600=1.5時進入生長穩定期，說明衰亡期可能是由于受外界影響的同時營養物質不足，菌株分解代謝超過合成代謝導致的。40 h后，菌株又重新進入生長期，這可能是由于外界影響因素解除導致的。同時發現，石油烴降解菌9-2在pH為3.0和4.0時不能生長；在pH為11.0時，菌株生長遲緩；在pH 為5.0~10.0 均表現出很高的生物活性，這表明該菌株能適應的pH 范圍較寬，完全能適應我國西北干旱地區土壤的堿性特征，適合作為西北地區石油污染的原位修復菌劑使用。

圖11 降解前后原油中不同芳烴及其衍生物的相對含量Fig.11 Relative contents of different polycyclic aromatic hydrocarbons and their derivatives in total polycyclic aromatic hydrocarbons in crude oil before and after degradation

圖13 菌株9￣2 在不同pH 條件下的48 h 生長曲線Fig.13 48￣hour growth curve of strain 9￣2 at different pH values

圖12 菌株9￣2 對芳烴及其衍生物的降解率Fig.12 Degradation rates of polycyclic aromatic hydrocarbons and their derivatives by strain 9￣2

2.6.2 菌株的鹽度耐受結果

鹽度同樣是是影響菌株生長重要條件之一，鹽度過高往往會導致細菌細胞膜內外滲透壓改變，影響細菌生長，甚至導致細菌脫水死亡。目前對于石油烴降解菌的耐鹽性也成為學者研究的重要方向之一：張寶寶等[33]從陜北地區石油污染土壤中分離的三株石油降解菌，對鹽度耐受度最高可達6.0%。Shiet al.[34]在餐廚油污中提取的銅綠假單胞菌P.aeruginosaM4 耐鹽度可達到7.0%。因此，為了篩選適合我國西北鹽堿地區石油烴降解菌株，本研究也進行了菌株的鹽度耐受試驗，在30 ℃、150 r/min條件下，記錄了石油烴降解菌9-2在不同鹽度條件下的生長曲線（圖14）。在鹽度為0.5%~4.0%的范圍內菌株9-2 生長均表現良好，尤其在鹽度為0.5%時以對數生長期生長，其生長最快，此時菌株濃度最高可達到OD600=1.728。16 h 后，鹽度在4.0%以下的培養基中菌株生長進入衰退期，可能是由于營養物質不足造成的，而鹽度在5.0%~6.0%的培養基中菌株生長進入穩定期。研究結果發現，石油烴降解菌9-2在0.5%~5.0%鹽度下生長最適，在6.0%時生長相對減緩，在7.0%鹽度下生長遲緩。據文獻調查，我國西北地區的鹽度范圍大致在0.2%~3.1%[35￣36]，而菌株9-2可耐受6.0%以下的鹽度，這表明該菌株能可完全適應西北干旱地區土壤的鹽度特征，適合作為西北地區石油污染的原位修復菌劑使用。

圖14 菌株9￣2 在不同鹽度下的48 h 生長曲線Fig.14 48￣hour growth curve of strain 9￣2 at different salinities

3 結論

（1）從慶陽市油井附近石油污染土壤中篩選出的4 株石油烴降解菌，經分子生物學鑒定確定為醋 酸 鈣不動桿 菌5-5（Acinetobacter calcoaceticus）、不動桿菌5-X（Acinetobactersp.）、蒙氏假單胞菌9-2（Pseudomonas monteilii）及乳酸不動桿菌10-3（Acinetobacter lactucae）。

（2）四株降解菌在降解過程中均出現培養基原油乳化現象，其降解率分別達到了50.92%、51.27%、78.30%及44.39%。另外，石油烴降解菌9-2 的降解效果最顯著，可降解94.65%正構烷烴，69.73%異構烷烴和59.07%多環芳烴，并且對nC21以上中長鏈及長鏈烷烴和高環數多環芳烴的降解度更高。

（3）抗逆性試驗結果表明，石油烴降解菌9-2 的酸堿度耐受范圍為pH 為5.0~10.0，鹽度耐受范圍為0.5%~6.0%。菌株9-2表現出優越的降解率和耐鹽耐堿特性，可為西北地區鹽堿土壤石油污染微生物修復提供一定的科學依據。

致謝 感謝國家自然科學基金面上項目（No.42072180，41772147，41272147）及中國科學院儀器設備功能開發技術創新項目（No. E0280101）的聯合資助；感謝中國科學院西北生態環境資源研究院馬曉峰老師、李樹同老師為本實驗提供原油；同時感謝審稿專家對文章提出的寶貴意見。