基于可培養(yǎng)法與高通量測序?qū)Υ箢^菜致腐菌篩選及細(xì)菌結(jié)構(gòu)分析

刁體偉，陳曉姣，魏鑫，賴曉琴，冷銀江，馬懿

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

腌制大頭菜因獨(dú)特的人文因素和地理環(huán)境成為了川蜀之地家喻戶曉的醬腌菜，在口感上鮮、香、嫩、脆、甜、辣更是一絕[1]。隨著時(shí)代的發(fā)展和人們生活質(zhì)量的提高，對榨菜品質(zhì)的要求也逐漸提升，發(fā)酵調(diào)味品的低鹽化已經(jīng)成為榨菜行業(yè)的潮流熱點(diǎn)[2]。低鹽腌制大頭菜較高鹽量而言，能更好保留榨菜原生營養(yǎng)，降低和延緩亞硝酸鹽的峰值出現(xiàn)，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量安全；但在低鹽條件下較易被微生物侵染，貨架期縮短，很容易發(fā)生脹氣腐敗的現(xiàn)象[3]。工業(yè)榨菜滅菌方式多采用水浴加熱(85 ℃)滅菌，而每逢三、四月份貨架上低鹽真空袋裝大頭菜多出現(xiàn)“胖袋”現(xiàn)象，脹氣后的袋裝大頭菜脆度變軟、顏色發(fā)黑并且有刺鼻難聞的氣體，讓產(chǎn)品失去商業(yè)價(jià)值。若要延長低鹽大頭菜的保質(zhì)期，需對腌制大頭菜脹氣的原因與機(jī)理進(jìn)行深入研究和解決。現(xiàn)有研究顯示腌制榨菜脹袋主要是由微生物的繁殖代謝所導(dǎo)致[4]。

對于脹氣、產(chǎn)膜腐敗菌的篩選和鑒定多用傳統(tǒng)培養(yǎng)基法，且多數(shù)致腐菌為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌等[5]。而目前對低鹽大頭菜貨架期及脹袋菌群結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)還比較匱乏，僅依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)基法并不能完全揭示脹袋原因及其微生物演替變化，從而導(dǎo)致生產(chǎn)者缺乏有效的滅菌方法。高通量測序能很好揭示微生物物種組成和豐度信息，是研究樣品中微生物群落組成結(jié)構(gòu)的重要手段[6]。研究者們通過高通量測序檢測冷藏小龍蝦[7]與漲壺醋[8]中優(yōu)勢腐敗菌菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致腐原因多以細(xì)菌為主，真菌為輔。當(dāng)前研究鮮有用高通量測序法對脹袋低鹽腌制榨菜中細(xì)菌群落進(jìn)行分析，因此本試驗(yàn)以貨架期脹氣和未脹氣大頭菜為樣本，通過高通量測序從基因水平分析兩組大頭菜之間細(xì)菌組成的差異性和相似性，了解貨架期脹袋大頭菜菌群結(jié)構(gòu)組成，尋找和確定引起脹袋問題的優(yōu)勢腐敗菌；并用傳統(tǒng)培養(yǎng)法篩選、驗(yàn)證腐敗菌并進(jìn)行熱致死率探究。本研究致力于促進(jìn)低鹽腌制榨菜滅菌工藝改進(jìn)，同時(shí)為以后鑒別腌制榨菜產(chǎn)品優(yōu)劣提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集與保存

試驗(yàn)樣本采用同一批次貨架期脹氣和未脹氣低鹽腌制大頭菜，由無菌采樣袋于4 ℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)上將脹氣大頭菜組(3袋)和未脹氣大頭菜組(3袋)分別編號(hào)為R1(D1、D2、D3)和R2(D4、D5、D6)；在無菌環(huán)境下每個(gè)大頭菜用五點(diǎn)取樣法取樣待用。

1.2 材料與儀器

真空袋裝腌制大頭菜：宜賓戎陳坊食品有限公司。

HWS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BM1000型生物顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司；DSX-18L型手提式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；5020型PCR 基因擴(kuò)增儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Gene JET膠回收試劑盒 Thermo Scientific公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer New England Biolabs公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒 ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

采用CTAB法[9]對樣本的基因組總DNA 進(jìn)行提取，將樣本DNA稀釋成1 ng/μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物：515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3′)；PCR反應(yīng)在30 μL中進(jìn)行，使用15 μL的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)、0.2 μmol/L的正向和反向引物以及大約10 ng的模板DNA。熱循環(huán)包括98 ℃的初始變性1 min，然后98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min，最后于4 ℃保存。

1.3.2 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化[10]送往天津諾禾致源生物信息科技有限公司經(jīng)過文庫檢測合格后，使用ThermoFisher的IonTMS5XL進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理

使用Cutadapt[11]先對reads進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，根據(jù)Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，將reads序列與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列得到最終的有效數(shù)據(jù)(clean reads)[12-13]。利用Uparse軟件[14]對所有樣品的全部clean reads進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，用Mothur法與SILVA132的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行物種注釋分析。

1.3.4 致腐菌的篩選和鑒定[15]

在無菌操作臺(tái)(無氧和有氧)上取D1、D2、D3大頭菜10 g絞碎于90 mL無菌蒸餾水中，經(jīng)搖勻后制成樣品菌懸液。選擇合適稀釋梯度涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。將不同形態(tài)學(xué)菌落挑選出進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)3次，分離純化后的菌株進(jìn)行產(chǎn)氣(杜氏試管)產(chǎn)酸驗(yàn)證試驗(yàn)，再將篩選出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色。以細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCGCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)展。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并將其送至成都擎科生物科技公司進(jìn)行測序，將所得序列在NCBI上進(jìn)行序列比對。

1.3.5 致腐菌耐高溫探究

用水浴加熱滅菌和高壓蒸汽滅菌(121 ℃/103 kPa)對腐敗菌進(jìn)行耐高溫滅活探究。將基于培養(yǎng)基法篩選得到的腐敗菌培養(yǎng)24 h，每隔2 h測一次吸光度并繪制生長曲線，取生長旺盛時(shí)段(對數(shù)期)用水浴加熱法(85 ℃/5 min；90 ℃/5 min；95 ℃/5 min；85 ℃/10 min；90 ℃/10 min；95 ℃/10 min；85 ℃/15 min；90 ℃/15 min；95 ℃/15 min)和高溫瞬時(shí)法(121 ℃/45 s；121 ℃/60 s；121 ℃/75 s)進(jìn)行滅活試驗(yàn)。每個(gè)條件設(shè)立3個(gè)平行并用平板計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)，取平均值以探究腐敗菌的耐受性，新鮮腌制大頭菜也做相同高溫處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與OTU分析

對6個(gè)樣品16S V4區(qū)測序后，平均每樣品測得82176條reads，平均長度為410 bp，經(jīng)過質(zhì)控平均得到77866條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達(dá)94.72%，結(jié)果見表1，測序所得的有效序列達(dá)到細(xì)菌多樣性分析的要求。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，根據(jù)脹氣組(R1)和未脹氣組(R2)OTU制作韋恩圖(見圖1)，共得到678個(gè)OTUs；其中脹氣組OTU有370個(gè)，未脹氣組有629個(gè)，共同擁有321個(gè)，說明未脹氣和脹氣大頭菜在貨架期主要物種組成較為相似，R1組優(yōu)勢腐敗菌會(huì)抑制其他微生物的生長，其特有的49個(gè)OTU極有可能是引起大頭菜脹氣的主要原因。對OTUs序列與Silva 132數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，注釋結(jié)果中共有671(98.97%)個(gè)OTU注釋到門水平，有496(73.16%)個(gè)OTU注釋到屬水平。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results of sequencing data

圖1 脹氣組(R1)和未脹氣組(R2)OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram of the bulging-bagged group (R1)and the well-packed group (R2)

2.2 物種多樣性分析(Alpha)

Alpha Diversity 多樣性指標(biāo)可以反映樣本內(nèi)的微生物群落物種的豐富度、多樣性和測序深度。α-多樣性分析指數(shù)測定結(jié)果見表2，測定顯示樣本覆蓋率都達(dá)到99.9%，序列檢測全面充足。其中未脹袋D4、D5、D6的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)要高于脹袋D1、D2、D3,說明未脹袋大頭菜中微生物群落多樣性和豐富度要高。原因可能是腐敗菌繁殖抑制其他微生物的生長，導(dǎo)致其他微生物不易存活，脹袋大頭菜中腐敗菌成為優(yōu)勢菌，導(dǎo)致環(huán)境酸度過高，營養(yǎng)缺失過多。

表2 Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes

a

b

稀釋曲線(rarefaction curve)通過統(tǒng)計(jì)代表物種數(shù)目(OTUs)來描述組內(nèi)樣本多樣性，直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度[16]。由圖2中a可知，樣本測序數(shù)超過40000時(shí)，稀釋曲線趨于平緩，表明本次測序數(shù)據(jù)的合理性，已經(jīng)基本覆蓋樣本中所有物種。在相同的測序深度下，比較R1組和R2組榨菜中OTU數(shù)，結(jié)果顯示未脹氣大頭菜R2組中物種多樣性更高。

等級(jí)聚類曲線(rank abundance curve) 在水平方向曲線的寬度可反映物種的豐富度，在垂直方向曲線的平滑程度可以反映樣本中物種的均勻程度。由圖2中b可知，脹氣組R2橫坐標(biāo)跨度相對較大，表明其所含物種豐富度較大；垂直方向R2組曲線相對R1較為平緩，表明R2組中物種分布較為均勻，R1組中物種分布不均，原因可能是脹氣R1組中存在的腐敗菌群比例較大，位置較為集中。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基于門水平群落結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，選取豐度排名前十的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖(見圖3)，以便直觀查看R1組和R2組在門分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。

由圖3可知，脹氣組R1中門水平上含量大于1%的菌群群落有變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)；分別占77%、13.1%、5.6%、3.4%。未脹氣組R2中含量大于1%的有變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，分別占42%、44%、4.4%、3.6%、1.1%。相比較而言，兩組總體菌門物種大體相似，但是含量有很大差異。可見貨架期大頭菜從未脹氣到脹氣過程中，優(yōu)勢菌群發(fā)生了巨大改變，其中R1組優(yōu)勢菌變形菌門含量達(dá)77%，遠(yuǎn)高于未脹氣R2組中的含量；藍(lán)細(xì)菌門細(xì)菌比例減少。兩組厚壁菌門變化不大，原因可能是此門細(xì)菌能產(chǎn)生芽孢，易在高鹽高酸中生長，適應(yīng)較為極端環(huán)境而不易被抑制[17]。R2組大頭菜中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和異常球菌屬-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)占比微量，在發(fā)生脹氣后被抑制生長。

2.3.2 基于屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

在屬水平上物種相對豐度前三十的菌數(shù)見圖4，脹氣組R1中屬水平上含量較大的菌群群落有unidentified_Rickettsiales(65.9%)、unidentified_Cyanobacteria(13.2%)、肉胞菌屬(Carnimonas，8.9%)、谷氨酸桿菌(Glutamicibacter，2.0%)、芽孢桿菌屬(Bacillus， 1.3%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，0.6%)、假單胞菌屬(Pseudomonas， 0.5%)。未脹氣組R2屬水平上豐度較大的有unidentified_Cyanobacteria(44.5%)、unidentified_Rickettsiales(23.3%)、肉胞菌屬(Carnimonas，3.6%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.9%)、unidentified_Rhizobiaceae(2.1%)、馬賽菌屬(Massilia，1.7%)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas，1.3%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，1.2%)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，1.1%)。比較R1組與R2組的物種豐度，結(jié)果顯示R2組物種豐富度較高，組間物種豐度變化明顯。R1中unidentified_Rickettsiales豐度增加了21.4%，unidentified_Cyanobacteria豐度減少了10.1%，肉胞菌屬增加了5.3%，另外芽孢桿菌屬為新增菌屬，組間物種差異含量與新增菌屬芽孢桿菌極有可能就是引起腌制大頭菜脹氣的主要原因[18]。

圖4 脹氣組R1和未脹氣組R2物種相對豐度圖(屬水平)Fig.4 Relative abundance of bulging-bagged group R1 and well-packed group R2 (genus level)

2.3.3 樣本間差異性分析

基于OTU水平兩組大頭菜樣本的主成分分析(PCA，principal component analysis)結(jié)果展示見圖5，PC1和PC2分別在樣品差異性貢獻(xiàn)率上達(dá)到52.89%和20.77%，是差異的主要來源。R1脹氣組在PCA圖中的距離十分接近，說明3個(gè)樣本細(xì)菌群落組成相似度較高；未脹氣組R2的3個(gè)樣本距離相距較遠(yuǎn)，原因可能是在加工腌制時(shí)加鹽攪拌不均勻，滅菌不全面，導(dǎo)致每個(gè)樣本上市時(shí)初始環(huán)境有所差異從而影響細(xì)菌生長情況不一。總體而言，未脹氣組與脹氣組群落組成差異顯著。

圖5 脹氣組與未脹氣組PCA分析Fig.5 PCA analysis of bulging-bagged group and well-packed group

LEfSe(LDA effect size)結(jié)合統(tǒng)計(jì)意義和生物相關(guān)性可比較組間差異性顯著的物種，LDA值分布柱狀圖見圖6。脹氣組和未脹氣組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。通過對R1～R2的LEfSe分析，我們發(fā)現(xiàn)LDA值>4的biomarker共有12個(gè)。差異性顯著的物種有：在門水平上R2組中的藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和R1中的變形菌門(Proteobacteria)；在科水平上R2組中伯克氏菌科(Burkholderiaceae)和根瘤菌科(Rhizobiaceae)；在屬水平上R2組中unidentified_Cyanobacteria和unidentified_Rickettsiales。

圖6 LDA值分布柱狀圖Fig.6 LDA value distribution histogram

2.4 物種豐度聚類熱圖

根據(jù)樣本在屬水平上物種注釋和豐度信息選取排名前三十五的菌屬繪制成熱圖，以便分析出物種在R1組與R2組中的聚集和含量情況。兩組大頭菜對比結(jié)果見圖7，脹氣組R1相對于未脹氣組R2聚集較多的菌屬有：芽孢桿菌屬(Bacillus)、肉胞菌屬(Carnimonas)、類節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)、谷氨酸桿菌(Glutamicibacter)和束毛球菌屬(Trichococcus)。這些細(xì)菌可能是導(dǎo)致腌制大頭菜變酸脹氣的主要原因，更能適應(yīng)后期變質(zhì)后的生存環(huán)境。王向陽等[19]在腌制蘿卜干中發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是引起變質(zhì)的主要腐敗菌。未脹氣組R2中優(yōu)勢菌種類相對較多，有假單胞菌屬(Psedomonas)、 嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)等。總體而言，R1組相對于R2組中細(xì)菌多樣性較低，優(yōu)勢菌種較少，原因可能是脹袋中腐敗菌抑制了其他菌種生長發(fā)育。

圖7 屬水平上物種豐度聚類熱圖Fig.7 Clustering heat map of species abundance at genus level

2.5 傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果

從脹袋大頭菜中共篩選出2株產(chǎn)氣腐敗菌，對分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色(見圖8)和16S rDNA基因鑒定。結(jié)合NCBI比對結(jié)果(見表3)及菌落特征表明腐敗菌株為解淀粉芽孢桿菌(N3)和枯草芽孢桿菌(N5)，這與高通量測序結(jié)果相符。

表3 菌株16S rDNA基因比對結(jié)果Table 3 Compatison results of 16S rDNA genes of the two strains

圖8 N3和N5革蘭氏染色Fig.8 N3 and N5 Gram staining

2.6 致腐菌耐高溫結(jié)果

采用水浴滅菌(見圖9)和高壓蒸汽瞬時(shí)法(見表4)對N3和N5兩種芽孢桿菌(103CFU/mL)進(jìn)行滅活試驗(yàn)，結(jié)果顯示水浴滅菌法隨著溫度的升高和處理時(shí)間的延長滅菌效果越好，然而在95 ℃條件下處理15 min仍無法完全滅活兩種芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿耐熱性更強(qiáng)。此外，水浴高溫長時(shí)處理榨菜后硬度和脆度明顯降低，最佳口感喪失，因而工業(yè)生產(chǎn)僅依靠水浴加熱滅菌并不能完全殺死芽孢桿菌，仍可能會(huì)導(dǎo)致大頭菜在貨架期產(chǎn)生脹袋現(xiàn)象。高溫瞬時(shí)法60 s(121 ℃/103 kPa)基本能殺滅細(xì)菌且保持榨菜較好的口感，因而為解決脹氣問題，延長榨菜保質(zhì)期，高溫瞬時(shí)法或許可被考慮應(yīng)用于工業(yè)中。

表4 高壓蒸汽滅菌時(shí)間對N3、N5腐敗菌致死率的影響Table 4 Effects of high-pressure steam sterilization time on the lethal rate of spoilage bacteria N3 and N5

a.N3耐熱性測定

b.N5耐熱性測定

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)使用高通量測序技術(shù)對貨架期未脹袋和脹袋大頭菜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，探究大頭菜脹袋原因及腐敗細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)；再用培養(yǎng)基法對腐敗菌進(jìn)行篩選、驗(yàn)證及熱致死率研究。結(jié)果表明，樣本細(xì)菌測序得到77866條有效序列，聚類分析產(chǎn)生678個(gè)OTU，其中大頭菜未脹氣組(R2)細(xì)菌種群多樣性較高。R2在貨架期主要優(yōu)勢菌群有unidentified_Cyanobacteria、unidentified_Rickettsiales、肉胞菌屬、乳桿菌屬、unidentified_Rhizobiaceae、馬賽菌屬、嗜鹽單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等；脹氣大頭菜主要優(yōu)勢菌為unidentified_Rickettsiales、unidentified_Cyanobacteria、肉胞菌屬、谷氨酸桿菌、芽孢桿菌屬。在屬水平上、兩組相比較差異性顯著的菌群有unidentified_Cyanobacteria和unidentified_Rickettsiales，差異性顯著菌屬以及新增芽孢桿菌菌屬可能是引起大頭菜在貨架期脹氣的主要原因。為驗(yàn)證主要致腐菌及脹氣原因，以產(chǎn)氣產(chǎn)酸為指標(biāo)用培養(yǎng)基法在脹袋大頭菜中篩選出了解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌，與R1組高通量測序結(jié)果的芽孢桿菌相符，因而芽孢桿菌是引起榨菜脹氣的主要原因。兩種芽孢桿菌耐受熱性強(qiáng)，95 ℃條件下水浴加熱15 min仍不能完全滅活，而60 s高溫瞬時(shí)法(121 ℃/103 kPa)在保證大頭菜脆度的同時(shí)滅菌效果較好。高通量測序結(jié)果中還有大量微生物菌群不能被培養(yǎng)基篩出，兩種方法結(jié)果存在差異，其原因可能是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基法只能培養(yǎng)部分細(xì)菌，目前可培養(yǎng)微生物只占自然界微生物的1%，純培養(yǎng)基法無法全面地揭示樣本中所有菌群結(jié)構(gòu)[20]。腌制工藝的低鹽度能提升口感和營養(yǎng)，但不能忽略自身安全質(zhì)量問題，低鹽腌制確實(shí)會(huì)存在被微生物侵染、縮短貨架期的問題，傳統(tǒng)水浴滅菌不能保證低鹽榨菜較長貨架期。本次試驗(yàn)全面揭示了貨架期脹袋和未脹袋低鹽大頭菜的菌群結(jié)構(gòu)并進(jìn)行了差異性分析，可為后期研究抑制優(yōu)勢腐敗菌、延長低鹽大頭菜貨架期提供參考。