酶解法制備低值魚調味料基質的工藝研究

趙敏，楊保衛

(江蘇食品藥品職業技術學院 酒店學院，江蘇 淮安 223003)

我國淡水資源豐富[1]，根據相關資料顯示，我國2008年淡水魚類的總產量約為1998.4萬噸，到2015年總產量升至2715.01萬噸，而淡水魚占所有魚類總產量的比值也從69.8%攀升至88.5%[2-3]。可見不光是淡水魚產量不斷在提升，淡水魚占我國魚類總產量的比值也在不斷攀升，而在淡水水產中，低值魚的占比每年都能穩定在15%～20%左右，產量也不容小覷，具有很大的開發潛力[4]。

低值魚泛指形體較小、可食用部分較少的各式小雜魚，這類魚的單種產量均不高，且市場價值都比較低，一般不作為單獨種類上市出售，整體利用價值有限，可以理解為“低價值”的魚，嚴格意義上來說是缺乏單種整體利用價值，但綜合利用起來還是有一定價值的[5]。常見的淡水低值魚種類有中華鳑鲏(RhodeussinensisGunther)、麥穗魚(Pseudorasboraparva)、棒花魚(Abbottinarivularis)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)等[6]。這些淡水魚總體產量可觀，但實際直接產生的經濟價值較低，在捕撈后漁民一般將其直接丟棄或者以廉價出售作為禽類飼料、廢料，不僅沒有帶來經濟價值而且污染環境、浪費資源。隨著食品加工技術的進步，現階段也有不少關于低值魚深加工產品的研究，例如魚粉[7]、魚糜[8]、魚松[9]、魚蛋白水解制品[10]等，但目前的相關研究與低值魚產量逐年增加、資源浪費嚴重的現狀相比，還存在著極大的不協調。

本研究以低值魚為原料制備調味料基質，與傳統海水魚制備魚露的方式不同，淡水低值魚類更易受腐敗菌影響，一般使用加鹽發酵法制備淡水水產調味料，但此種工藝下生產的調味料極不穩定。本文擬采用現代酶解技術制備低值魚調味料基質，首先對比幾種單酶對低值魚蛋白液水解度(degree of hydrolysis, DH，%)的影響，從中選取合適的單酶制劑進行兩兩復配，最終以復配酶組合形式進行復配酶解實驗。利用單因素實驗、響應面實驗等重點對低值魚復配酶水解工藝進行優化，提高低值魚蛋白DH值，酶解所獲得的酶解蛋白底液，再通過干燥即可制得調味料基質蛋白粉。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

洪澤湖低值魚，品種包括中華鳑鲏魚(身長3～6 cm之間，單體重約5 g)、白條魚(身長10～20 cm，單體重約15～30 g)、麥穗魚(身長3～10 cm，單體重約5～10 g)、棒花魚(身長5～8 cm之間，單體重約5 g)：淮安益地農業發展有限公司提供；堿性蛋白酶(400000 U/g)、中性蛋白酶(270000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g)、風味蛋白酶(60000 U/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司；無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、95%乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；甲基紅、甲基綠：上海展云化工有限公司；次甲基藍：天津福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

HH-6型恒溫水浴鍋 常州潤華儀器制造有限公司；DHG-9053A型恒溫鼓風干燥機 無錫瑞瑪特科技有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；TD5A型低速臺式離心機 常州金壇良友儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機、LP502B型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計 上海葉拓科技有限公司；SVAC1-2 SHELLAB真空干燥箱 美國SHELLAB公司；FOSS KJELTEC 2300全自動凱氏定氮儀 珠海市造鑫企業有限公司；RE-1002旋轉蒸發儀 上海秉越電子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

去內臟→清洗→瀝干→打漿→酶解→滅酶→離心→反壓濃縮→真空干燥→半成品。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 酶解

參照文獻[11]的方法，首先進行多種單酶對比實驗，在此基礎上進行混合酶制劑的復配，酶解過程中生成的苦味物質與酶解時間有關，復合酶的使用有利于縮短酶解時間，從而降低苦味物質的生成量。

1.3.2.2 離心

設置離心轉速為5000 r/min，溫度為4 ℃進行低溫離心，取少量上浮的油脂待用，取上清液，余下沉淀物質待用。

1.3.2.3 反壓濃縮

設置真空度為0.1 MPa，壓縮溫度為83 ℃，蒸發速率約為20 mL/min，不同液體量蒸發速率有差異。

1.3.3 單酶對魚蛋白水解度的影響

1.3.3.1 不同種類酶制劑的選擇

根據現有相關研究，選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶4種蛋白酶進行單酶水解實驗，分別在不同酶制劑最適的酶解條件下對比其對低值魚蛋白水解度(DH，%)的大小[12]。各種酶制劑最適反應條件詳見表1。

表1 不同酶制劑的最適酶解條件Table 1 The optimum enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.3.2 水解度測定

參照國家標準GB 5009.5-2016[13]以及梁凱等[14]研究的相關描述，氨基酸態氮含量的測定采用甲醛滴定法，而總氮含量則采用自動凱氏定氮法測定。

1.3.4 復合酶對魚蛋白水解度的影響

分別在4種單酶最適的pH環境下進行酶解實驗，各實驗組魚蛋白樣品中均加入3倍質量的無菌水，控制其他條件不變(時間5 h、溫度50 ℃、加酶量1%)，通過對比實驗優選出水解效果較好的酶。

組合復配多種酶制劑對蛋白質的酶解作用相較單一酶而言要更顯著，水解液的風味受復配酶制劑協同作用的影響較大，一般而言酶制劑種類越多，水解參數越復雜，形成酶解溶液的穩定性也越難把控[15]。故而進行復配酶酶解實驗，以水解度為評價指標，酶制劑復配比、復配酶用量、酶解pH、酶解溫度這4個因素為自變量，在單因素實驗的基礎上進行響應面優化實驗。

1.3.5 復配酶水解工藝優化

1.3.5.1 復配酶水解單因素實驗

在上述預實驗的基礎上采用控制變量法進行單因素實驗，4個單因素的梯度分別設置為：酶制劑復配(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；復配酶用量0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%；酶解pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5以及酶解溫度45，50，55，60，65 ℃。固定參數為酶解時間5 h、酶制劑復配比1∶1、復配酶用量1%、酶解pH 7.0以及酶解溫度50 ℃。

1.3.5.2 響應面實驗優化水解工藝

在單因素實驗的基礎上進行4因素3水平的響應面實驗，優化確定最佳的復配酶水解魚蛋白工藝參數，因素水平設置詳見表2。

表2 響應面因素水平表

1.4 數據分析

運用Design Expert 8.0軟件、IBM SPSS Statistics 21.0以及Origin 7.5等軟件進行響應面實驗設計、統計學分析以及繪圖。所有實驗均為3次平行實驗后的平均值。

2 結果與討論

2.1 單酶對魚蛋白水解度的影響

魚蛋白的水解度受不同單酶制劑的影響見圖1，由于酶切點不同，各酶制劑的酶解效果也不一樣[16]。

圖1 單酶對魚蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of single enzyme on the degree of hydrolysis of fish protein

由圖1可知，各單酶酶解魚蛋白的總體變化趨勢相似，隨著酶解時間的延長，DH均呈現上升趨勢。其中，對魚蛋白水解效果最好的是堿性蛋白酶，而最差的是風味蛋白酶，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的效果居中。而且當酶解時間在0～1 h范圍內時，魚蛋白的DH值上升最為顯著，當酶解時間超過3 h之后，魚蛋白的DH值上升趨勢逐漸趨于平穩。綜合考慮，剔除酶解效果最差的風味蛋白酶，下一步實驗選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶這3種酶制劑進行兩兩復配。

2.2 不同復配酶對魚蛋白水解度的影響

圖2 復配酶對魚蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of complex enzymes on the degree of hydrolysis of fish protein

由圖2可知，不同復配酶的酶解效果隨著酶解時間的延長呈現逐漸增強的趨勢，整體趨勢與單酶酶解類似，但具體幅度存在差異，當酶解時間在0～2 h范圍內時，DH值的上升幅度最大，當酶解時間超過2 h時，隨著時間的延長，3組復配酶對DH的增強效果均趨于平緩。其中，中性蛋白酶+木瓜蛋白酶復配組的水解效果最好，水解效果最差的是堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶復配組，堿性蛋白酶+中性蛋白酶復配組水解效果居中。究其原因可能是各個單酶制劑的最佳酶解條件和酶切肽鏈點各不相同，將不同單酶復配后可能產生協同作用，但也可能產生拮抗作用，所以出現不同單酶復配后酶解效果差異較大的局面[17]。綜合考慮，選擇木瓜蛋白酶+中性蛋白酶的組合進行下一步的復配酶解實驗。

2.3 復配酶水解魚蛋白單因素實驗

2.3.1 復配酶配比對魚蛋白DH的影響

圖3 復配酶配比對魚蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of ratios of complex enzymes on the degree of hydrolysis of fish protein

在前期實驗的基礎上，選擇中性蛋白酶+木瓜蛋白酶的復配組合，考察在不同復配比例下對魚蛋白DH的影響效果。由圖3可知，在復配酶(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)配比由1∶1變化至1∶6的范圍區間，魚蛋白的DH值由34.3%下降到28.8%，且呈現逐漸下降的趨勢。綜合考慮，選擇中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶復配配比1∶1～1∶3為下一步響應面優化的實驗范圍。

2.3.2 復配酶用量對魚蛋白DH的影響

圖4 復配酶用量對魚蛋白水解度的影響

由圖4可知，當復配酶用量由0.25%增加至1.5%時，魚蛋白的DH值總體呈現逐漸上升的趨勢，而且加酶量在0.25%～1%的范圍內時，DH值上升幅度較大、速率較快，當加酶量超過1%時，DH值呈現較為平穩的上升趨勢，增長速率明顯變慢，這是因為當復配酶濃度增加到一定程度時，水解溶液已趨向于飽和狀態，魚蛋白的DH值不會隨著加酶量的增加而明顯上升。另外，從水解過程成本控制的角度出發，綜合考慮后選擇復配酶用量0.75%～1.25%為下一步響應面優化的實驗范圍。

2.3.3 酶解pH對魚蛋白DH的影響

圖5 pH對魚蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis of fish protein

根據中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的建議反應條件確定復配酶水解魚蛋白pH值單因素范圍為6～8.5。由圖5可知，隨著pH值的增加，魚蛋白的DH值呈現先上升后逐漸下降的趨勢，在pH值為7時，即溶液達到中性環境時，DH達到最大值，為34.8%；當酶解pH值大于7時，即溶液向堿性趨近時，DH值呈現顯著下降趨勢(p<0.05)。綜合考慮，選擇酶解pH值7為下一步響應面實驗的中心點。

2.3.4 酶解溫度對魚蛋白DH的影響

圖6 溫度對魚蛋白水解度的影響

由圖6可知，魚蛋白DH值隨著溫度的變化而產生了較大變化，隨著溫度由40 ℃升高至65 ℃的過程中，DH值的變化呈現先上升后緩慢下降的趨勢，這是因為適當的溫度能有效提升酶促反應速率，加劇蛋白質水解反應程度[18]，DH值在反應溫度為55 ℃時達到最大值35.2%，當溫度超過55 ℃時，DH值逐漸下降。綜合考慮，選擇酶解溫度55 ℃作為下一步響應面實驗的中心點。

2.4 復配酶水解魚蛋白響應面優化

2.4.1 響應面設計結果及方差分析

使用Design Expert 8.0軟件進行BBD實驗組合設計4因素3水平的響應面優化實驗，以魚蛋白DH值為響應值Y，設計方案及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 The design and results of BBD experiments

續 表

表4 方差分析結果Table 4 The results of variance analysis

對實驗設計組配的29組數據進行響應面擬合以及統計學分析，可得魚蛋白的DH值關于所選4個因素的擬合回歸方程，具體如下：

Y(DH，%)=34.86-0.98A+0.59B-0.44C-1.12D+0.45AB+0.30AC-1.20AD-0.40BC+0.63BD+0.83CD-0.51A2-2.09B2-2.17C2-1.90D2。

由表3和表4所得數據可知，所構建的模型的p<0.0001，表明該模型極顯著，而失擬項的p=0.0731，>0.05，說明失擬項不顯著(p>0.05)，模型的擬合程度良好，該回歸方程可用于描述復配酶配比(A)、加酶量(B)、酶解pH值(C)以及酶解溫度(D)和魚蛋白水解程度的關系。方差分析結果顯示相關系數R2=0.9486，遠大于0.9，說明模型預測值與真實值的相關性很高[19]。比較F值大小可得，4個因素中，對魚蛋白DH值影響程度的大小依次為D>A>B>C，與單因素實驗結果契合，其中一次項A、B、D和二次項B2、C2、D2極顯著(p<0.01)，而顯著項有一次項C和交互項CD(p<0.05)，其余各項不顯著(p>0.05)。

2.4.2 響應曲面與等高線分析

Box-Behnken響應面優化法在生物培養基優化、藥劑制備以及食品加工工藝優化中已被廣泛應用。3D響應曲面直接顯示出了各因素對魚蛋白酶解工藝的影響趨勢，而平面等高線圖中線與線之間的疏密度則表現了兩個不同因素交互對魚蛋白酶解工藝的影響程度，3D曲面圖坡度越陡、等高線呈橢圓形且越密集，說明該交互項對魚蛋白酶解工藝的影響越大[20]。呈顯著性的交互項等高線圖及響應曲面圖見圖7。

a

b

由圖7可知，圖7中b的響應面坡度較圖7中a的要陡峭，且等高線也較為密集，這說明復配酶配比、酶解溫度這兩個因素之間的交互對魚蛋白酶解工藝的影響最為顯著，這與表4中方差分析所顯示的結論一致。而其余各因素之間的3D響應曲面圖、等高線圖較為稀疏。

2.4.3 復配酶最佳水解工藝及驗證

使用Design Expert 8.0軟件對響應面實驗結果進行最終優化求解，將目標值魚蛋白的DH設為最大值，所得復配酶最佳水解工藝見表5。

表5 復配酶最佳水解工藝

軟件顯示第一組的酶解工藝參數最優，在此參數下進行5組平行實驗，最終得到的DH值為35.41%的可能性高達93.5%。根據實際操作情況，確定復配酶水解魚蛋白的工藝參數為：復配酶配比1∶1、加酶量1%、酶解pH 6.9、酶解溫度55 ℃，在此條件下再進行驗證實驗，最終結果顯示魚蛋白的DH值為(35.32±0.21)%，與預測值的差異僅為0.25%，由此可驗證本研究所得的理論模型與實際情況有較好的擬合度，能有效地反映出復配酶配比、加酶量、酶解pH以及酶解溫度等因素與魚蛋白DH值的關系，可用于指導復配酶水解魚蛋白的實際生產。

3 結論

本研究用現代酶解技術制備低值魚調味料基質，首先對比了中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶這4種單酶對魚蛋白DH值的影響，選取了堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶這3種酶制劑進行兩兩復配，最終選擇木瓜蛋白酶+中性蛋白酶的組合進行復配酶解實驗。以魚蛋白的DH值為目標值，在單因素實驗的基礎上進行響應面實驗，優化低值魚蛋白復配酶水解工藝，響應面實驗所得模型擬合程度良好(p<0.0001)，得出最終的最優水解工藝參數為：復配酶配比(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)1∶1、加酶量1%、酶解pH 6.9、酶解溫度55 ℃。驗證實驗證明，在此工藝條件下進行水解，魚蛋白DH值最高，為(35.32±0.21)%，較優化之前的各組有顯著提升(p<0.05)。該研究為酶解法制備低值魚調味料基質提供了科學指導，不僅對價值較低的魚類資源進行了有效利用，而且對豐富調味品市場的產品種類提供了新方向。