咸味肽的制備技術研究進展

張康逸，屈凌波，溫青玉，張雨，董彩虹

(1.河南省農業科學院農副產品加工研究中心，鄭州 450002；2.河南省全谷物小麥制品加工國際聯合實驗室，鄭州 450002；3.河南省全谷物鮮食加工工程技術研究中心，鄭州 450002；4.鄭州大學 化學與分子工程學院，鄭州 450001；5.河南省安康食品科技研究院，鄭州 450006；6.河南省安康未來食品科技有限公司，鄭州 450040；7.中北大學 化學工程與技術學院，太原 038507)

咸味是一種非常重要的基本味，它在食品調味中是不可或缺的，是咸味食品的重要樞紐[1]，俗稱“百味之王”，是調制各種復合風味的基礎。但隨著食鹽攝入量的增加，居民的營養狀況和健康水平持續下降。據報道，人體過多攝入食鹽會增加患心臟病、高血壓等疾病的風險[2]。

為了降低患高血壓、心血管等疾病的風險，在國家提倡全民減鹽低鈉的同時，許多非鈉鹽類替代物、咸味肽、咸味增強肽、風味改良劑等食鹽替代物不斷涌現在市場上[3]，非鈉鹽類替代物與食鹽的性質最為接近，但只能降低一部分食品中的含鈉量，且存在應用上的局限性，使得其在市場上的應用存在一定的限制。風味改良劑在市場上的應用較為廣泛，能起到減鹽不減咸、減鹽不減鮮、修飾異味和增加風味的作用，但在營養方面存在一定的局限性。而咸味肽不失為一種健康營養的食鹽替代物[4]，可以通過酶水解或氨基酸合成得到，不僅能提供咸味，而且能補充人體所需氨基酸。因此，咸味肽的開發具有很大的市場價值，且對于需低鈉食品的特殊群體來說，咸味肽產品更是有著巨大的潛在利用價值。

目前，對于咸味肽的研究，其呈味機理、構效關系、制備技術以及應用成為當今社會的研究熱點之一[5]。為了能更好地開發出健康營養的咸味肽，對咸味肽的研究進展進行歸納總結，以期為促進咸味肽的深入機理研究和產品研發提供理論依據和參考。

1 咸味肽的研究必要性及結構特點

1.1 咸味肽研究必要性

世界衛生組織對食鹽的攝入量提出以下建議，即人均日攝入量應不超過6 g，而我國的人均日攝入量已達12 g，超過建議食鹽攝入量的2倍[6]，且研究結果表明較高的鈉離子攝取量與高血壓、心血管疾病等有直接的關系[7]，因此開發出既能保證咸味，避免口味上的不足，又能降低鈉離子攝入的咸味肽是必要的，也是未來開發食鹽替代物的必然趨勢。1984年，Tada等[8]在酪蛋白水解物中首次發現咸味二肽Orn-β-Ala的咸味強度與NaCl相當，2008年，Zhu等[9]在無鹽醬油的研究中提取了3種咸味肽，氨基酸序列分別為Ala-Phe、Phe-Ile、Ile-Phe。彭增起等[10]通過對大豆蛋白進行酶解、分離純化，得到一種純凈的咸味肽，其氨基酸序列為Gly-Lys。2020年，Zheng等[11]在FA31中發現Asp-Asp、Glu-Asp、Asp-Asp-Asp、Ser-Pro-Glu和Phe-Ile 5種咸味肽。由此證明，對咸味肽的研究尤為重要，咸味肽產品的開發也成為重中之重。

1.2 咸味肽結構特點

天然蛋白質中存在的氨基酸除甘氨酸外均為L型，氨基酸本身及其鹽類大多呈苦味、甜味，少量呈鮮味、咸味和酸味，D型氨基酸幾乎都呈甜味[12]，咸味肽則主要是由L型氨基酸組成，且主要是2個及以上氨基酸肽鍵銜接而成，咸味二肽結構見圖1[13]。

圖1 咸味二肽Asp-Asp的結構圖Fig.1 The structure diagram of salty dipeptide Asp-Asp

咸味肽具有刺激性小、延續時間短、消失速度快、強弱對比差異明顯、閾值和差閾都較小等特點，咸度隨咸味肽濃度的變化而迅速發生變化，并且人感受咸味的濃度可變范圍小，會與其他呈味發生協同相互作用，這也是咸味常作調味主味的重要原因之一。

2 咸味肽分類

咸味肽是從食物中提取的、由氨基酸組成的、呈咸味的多肽。按食物來源分，咸味肽可分為動物源咸味肽、微生物源咸味肽和植物源咸味肽，主要是以動物源咸味肽為主。

2.1 動物源咸味肽

動物源咸味肽是從動物性食物中通過生物酶解技術制備得到的咸味肽。目前，咸味肽的動物性來源主要包括雞骨、豬骨、牛骨、魚肉、蝦蟹等。近年來，針對動物源咸味肽的研究不斷涌現，王欣等[14]研究表明通過木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的協同作用，不僅能充分水解哈氏仿對蝦蛋白，也能提取更多的咸味肽。吳迪等[15]研究表明通過響應面優化法得到酶解小黃魚制備咸味肽的最優工藝。

2.2 微生物源咸味肽

微生物源咸味肽是從微生物中制備得到的咸味肽，但目前研究報道相對較多，主要來源是醬油、奶酪、酵母、雙孢菇等。Zhu等在無鹽醬油的研究中提取了3種咸味肽，氨基酸序列分別為Ala-Phe、Phe-Ile、Ile-Phe。吳陽[16]以雙孢菇為原料，采用高溫蒸煮法、超納濾膜分離法、葡聚糖凝膠層析法和反高效液相色譜法制備呈現咸鮮味的濃厚呈味肽。Zheng等在天然酵母FA31中發現Asp-Asp、Glu-Asp、Asp-Asp-Asp、Ser-Pro-Glu和Phe-Ile 5種咸味肽。

2.3 植物源咸味肽

植物源咸味肽是從植物蛋白中通過生物酶解技術制備得到的咸味肽。目前研究表明，從植物蛋白中提取咸味肽的研究較少，主要來源是藻類、海帶、大豆等。彭增起等通過對大豆蛋白進行酶解、分離純化，得到一種純凈的咸味肽，其氨基酸序列為Gly-Lys。我國是農業大國，農業資源豐富，從植物蛋白中提取咸味肽會成為未來咸味肽發展行業的必然趨勢。

3 咸味肽受體與機制

3.1 咸味肽受體

目前研究發現，咸度受體包括瞬時受體電位香草酸亞基和上皮Na+通道(ENaCs)兩種受體，其中ENaCs是主要咸度受體[17]，由3個亞基組成，分別為α，β和γ，依次在舌的輪廓、葉狀和菌狀乳頭的味覺受體細胞(taste receptor cell, TRC)中表達，并形成孔狀結構，發揮ENaCs的作用，但由于β和γ亞基在輪廓乳頭和葉狀乳頭的TRC中表達較少，所以ENaCs主要定位表達在舌前部的菌狀乳頭的TRC中。ENaCs咸味傳感受體見圖2。

圖2 ENaCs咸味傳感受體Fig.2 ENaCs saltiness sensor receptors

3.2 咸味機制

咸味肽電離出陽離子，一些味覺傳導過程將化學信號轉變成分子第二信使，促使陽離子與味覺受體細胞發生相互作用，激活其表面的離子通道，引發味覺受體細胞去極化和Ca2+釋放，進而傳送給大腦產生“咸味”信號，咸味機制由此產生[18]。咸味傳導機制見圖3。

圖3 咸味傳導機制Fig.3 The saltiness transmission mechanism

4 咸味肽構效關系

咸味肽的呈味特性與氨基酸的組成、性質、空間結構、肽鏈的長度及氨基酸的序列密切相關，其形成結構式見表1。

表1 咸味肽、咸味肽類似物和咸味增強肽的結構式Table 1 The structural formulas of salty peptides, salty peptide analogs and salty enhancing peptides

4.1 氨基酸性質

咸味肽的呈味特性與組成氨基酸的性質有關。天然蛋白質存在的氨基酸除甘氨酸外均為L型，20種氨基酸中組成咸味的氨基酸主要有天冬氨酸和谷氨酸，咸味增強肽主要由精氨酸組成，而咸味肽類似物主要由瓜氨酸(Orn)等堿性氨基酸組成。

4.2 氨基酸組成

目前報道的咸味肽主要為咸味二肽和咸味三肽，其味感主要取決于由天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸連接而成的二肽、三肽，其中肽鏈越長，咸味越不明顯[22]，且不同的氨基酸組成所呈現的咸味閾值不同，如Asp-Asp 咸味二肽的咸味閾值為4.79 mol/L，Glu-Asp咸味二肽的咸味閾值為3.14 mol/L[23]。

同時，部分呈味肽本身不具有咸味，但具有增咸效果，這類肽稱為咸味增強肽。咸味增強肽的氨基酸組成與咸味肽不同，咸味增強肽增咸效果顯著，不同增咸肽的組合具有不同的增咸效果[24]。

4.3 氨基酸序列

不同特性的氨基酸殘基在肽鏈中的位置對咸味肽的呈味特性有著重要影響。多肽中氨基酸組成相同的咸味肽，也會存在呈味強度的較大差異甚至是呈味特性的差異。同時，在咸味五肽的研究中發現，五肽分子必須具有帶正電分子團、帶負電分子團等極性氨基酸，但是這一結論并不適用于其他大小的肽段。

4.4 肽的空間結構

對于含3個氨基酸以上的呈味肽，必須考慮呈味肽的空間構象[25]。肽鏈長度直接導致結構和電荷分布差異，或結構中含有羰基、羧基或分子中含有較多酸性氨基酸，這些因素導致很難從簡單的一級結構清楚地解釋預測咸味肽結構和呈味特性的關系。關于肽的空間結構，可從肽與受體的結合研究咸味肽的呈味特性，但目前未見報道。

綜上所述，咸味肽的呈味特性與氨基酸的性質、不同氨基酸組成、肽的空間結構及氨基酸的序列密切相關，從咸味肽的構效關系中研究咸味肽，能使咸味肽的開發得到較好的發展。

5 咸味肽制備合成技術

咸味肽的制備技術主要包括化學水解法[26]、酶水解法[27]、基因工程法[28]和微生物發酵法[29]，合成技術主要包括固相合成和液相合成。制備技術中常用的方法主要是酶水解法和微生物發酵法，而合成技術中常用的方法是固相合成法。

5.1 制備技術

5.1.1 化學水解法

化學水解法主要包括兩種，分別為酸水解法和堿水解法，其中酸水解法不易控制時間和溫度對水解度和多肽得率的影響，水解后產生大量游離氨基酸和少量多肽，蛋白原料中含有碳水化合物時會產生酸味，未精制的水解產物也會產生臭味或者其他異味[30]，同時，易破壞敏感性氨基酸，有一定的毒性、致癌性，因此，酸水解法不宜成為制備咸味肽的方法。而堿水解法則易生成L型和D型的氨基酸多肽混合物，易引起消旋性和破壞敏感性氨基酸，導致營養成分的流失，且設備要求高，易造成環境二次污染。因此，這兩種制備方式在實際生產中應用較少。

5.1.2 酶水解法

酶水解法是以蛋白質為底物，選擇適當的蛋白酶，在最適條件下與底物結合來獲得大量具有多種特性的呈味肽[31]。此方法酶解后生成游離氨基酸和大量不同分子量的肽，水解度較高時，會生成大量小分子肽，此時酶解液會呈現明顯的鮮咸味。此方法具有反應條件溫和、過程可控、酶專一性強、肽得率高及副反應少等優勢，特別是在風味和營養方面，能夠得到最大保留，在制備呈味肽方面具有獨特的優勢，因此，咸味肽的制備技術通常采用酶水解法。

5.1.3 基因工程法

基因工程法指從動植物的基因組分離出帶有目的基因的DNA片段，而后將此DNA片段以適當的載體和特定方式導入受體細胞，通過受體細胞表達得到所需的呈味肽[32]。該方法原料廉價、效率高、產量大，所制備的肽具有高產率和高特異性。但該技術在DNA重組過程中對滅菌處理有嚴格要求，目前尚不成熟，有待進一步研究。

5.1.4 微生物發酵法

微生物發酵法是利用微生物通過發酵底物來生產呈味肽，其通過微生物發酵將原料經特定代謝途徑產生可充分水解底物的酶，通過此酶將蛋白質水解為呈味肽[33]，該方法幾乎不需要使用化學試劑，無化學殘留風險，生產成本較低，菌種易培養，培養周期短，便于工業化生產和大規模推廣。同時，酶解產物中會產生發酵香味，能進一步提高呈味肽的感官性能，為咸味肽產品的開發提供一種特殊的風味體現，但該方法中不同菌種效果差異明顯，不易控制。

5.2 合成技術

化學合成技術主要是通過氨基酸縮合反應形成酰胺鍵來實現多肽合成[34]，在合成的過程中，能夠保證目標多肽的定向性，大量合成所需要的目的多肽，主要分為固相合成法和液相合成法。

5.2.1 固相合成技術

固相合成技術是將目標多肽的第一個氨基酸的C端與固相載體相連，再以其N端作為合成起點，經過脫去、反應、接長，重復操作，達到所需的目標多肽鏈長度，再將其從樹脂上裂解下來，分離純化，最后得到目標多肽[35]。固相合成技術主要分為Boc合成法和Fmoc合成法。Boc合成法在多肽不斷合成的過程中，需反復用酸切除Boc保護基，引入一些副反應產物，而Fmoc合成法采用溫和的堿處理進行脫保護，此方法反應條件溫和、副反應少、產率高，因此，Fmoc合成法在多肽固相合成技術領域應用十分廣泛。目前，固相合成法被廣泛應用于多肽和蛋白質的合成及研究領域，特別是小分子多肽的合成[36]。此方法技術成熟，由原來的手工操作合成轉變為全自動多肽合成儀合成。因此，咸味肽的合成多采用固相合成法，且合成的咸味肽被用于驗證鑒別從食物中提取的咸味肽。咸味肽固相合成流程見圖4。

圖4 咸味肽固相合成流程圖Fig.4 The flow chart of solid-phase synthesis of salty peptides

5.2.2 液相合成技術

液相合成技術是利用多肽片段在溶液中的化學專一性和選擇性，自發連接合成長肽的合成技術[37]，此技術用于合成長肽，具有純度高、易于純化等特點。多肽液相合成技術又可分為逐步合成法和片段合成法。逐步合成法操作簡易迅速，主要應用于生物活性肽的合成。片段組合法又分為兩種，即天然化學連接和施陶丁格連接，主要用于長肽合成。由于咸味肽的肽段越長，咸味越不明顯，因此，多肽液相合成技術在咸味肽的制備中應用較少。

6 咸味肽分離純化鑒定技術

6.1 咸味肽分離純化技術

目前分離純化咸味肽的技術越來越成熟廣泛，常用于咸味肽分離純化的方法主要包括離子交換色譜、超濾以及凝膠過濾色譜等分析技術。咸味肽分離純化技術主要是依據酶解產物的組成、特點、性質等多種因素決定。為得到較為純凈的咸味肽，一般將多種分離純化技術手段聯合使用，達到對咸味肽分離純化的目的。

6.1.1 超濾技術

超濾(ultra-filtration,UF)技術是通過超濾膜表面的孔結構對不同大小分子量的物質進行選擇性分離和濃縮的高新技術手段[38]。其原理是在密閉容器中的兩類或者多類大小不同的物質溶液在適當空氣壓力的作用下促使其透過超濾膜，小于超濾膜孔直徑的小分子溶質可透過膜被收集，而大于超濾膜孔直徑的大分子溶質則被薄膜截留濃縮被回收，最終實現不同大小溶質溶液的分離和濃縮，常用于分離不同分子量的肽段，主要用于10，5，3，1 kDa分子量肽段的分離。超濾是一種快速、有效獲得并濃縮目標分子質量的肽的方法[39]，其不能得到純化的肽，需進一步用色譜分離純化方法得到單一純化的肽。Liu等[40]利用超濾技術對大豆蛋白的美拉德產物進行分離純化，最終制備得到大豆蛋白抗氧化活性肽。

6.1.2 凝膠過濾色譜技術

色譜法是利用流動相中的不同物質在不同固定相的選擇性分配，通過流動相中的混合物流經固定相的選擇性不同進行洗脫，不同的物質會以不同的流速沿固定相流出，最終實現對不同物質之間的分離，收集所需要的物質[41]。常用于分離咸味肽的色譜分析技術主要是凝膠過濾色譜技術，依靠各物質的分子大小不同而分離，進一步分離純化咸味肽。張順亮等[42]通過對比Sephadex G-15和Sephadex G-50凝膠色譜柱分離牛骨酶解產物得到咸味肽，結果表明，不同凝膠色譜柱制備的咸味肽咸度較強，且均有相對分子質量為849.38的咸味多肽。

6.2 咸味肽鑒定技術

隨著呈味肽鑒定技術的快速發展，越來越多高效快速的方法可用于鑒定咸味肽，目前主要的鑒定技術有液相色譜-質譜聯用技術、電噴霧離子化、基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀、核磁共振技術和二元色譜法等，促進咸味肽呈味特性的進一步挖掘，且有助于解釋食品產生微妙風味的機理。同時，有利于提高食品品質，提高生產效率。

6.2.1 質譜法

質譜法(mass spectrometry，MS)，即用電場和磁場將運動的離子按質荷比分離后進行分析檢測的方法[43]。隨著質譜技術的發展，質譜分析的每個階段都有多種方法可供選擇。電離有基質輔助激光解吸電離、電噴霧離子化等[44-45]，質量分析器主要有離子阱、飛行時間、四級桿以及四級桿串聯飛行時間等[46-47]，不同質譜技術的組合構成了不同特性和不同層次的質譜檢測平臺，在靈敏度、準確性、通量、操作等方面具有不同的特性。質譜法具有高靈敏性、高準確性、高通量性、高精度性、定量動態范圍大、操作快捷方便等優點，可以準確測出咸味肽氨基酸序列和相對分子質量。李迎楠等[48]通過超濾裝置、Sephadex G-25凝膠色譜柱、高效液相色譜分析儀對牛骨酶解產物中的咸味肽進行分離、純化、收集及初步分析，再借助于質譜儀對咸味肽進行分析鑒定，得到咸味肽的相對分子質量可能為679.5109。

6.2.2 核磁共振技術

隨著二維、三維以及四維核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術的廣泛應用，分子生物化學、計算機技術的快速發展，NMR圖譜在蛋白多肽中的分析應用較多，目前，已逐漸成為蛋白多肽分析的主要技術之一[49]，可用于鑒定咸味肽的氨基酸序列及混合物中各組分的含量等。

6.2.3 傅里葉變換紅外光譜技術

傅里葉變換紅外光譜技術(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)是通過特定波長的紅外光照到呈味肽樣品上被反射或吸收的紅外光譜技術[50]。這種技術可以在多種不同環境下采集不同大小的咸味肽的光譜數據。咸味肽的不同結構區域會產生不同的特征吸收帶，這些信息可以被解析來確定咸味肽的二級結構。這種二級結構的主要組成部分是β折疊和α螺旋，它是呈味肽結構中最重要的一個方面[51]。

7 咸味肽應用研究

咸味肽作為呈味肽的一種，具有味感細膩溫和、醇厚濃郁等特點，味感和咸度效果均優于鹽類和氨基酸類咸味劑。目前，咸味肽的應用越來越廣泛。按其應用可分為增咸食用鹽、咸味增強劑、咸味香精。

7.1 增咸食用鹽

增咸食用鹽是為響應國民減鹽而開發的一種具有增強食鹽咸味、減少食鹽攝入的咸味肽開發產品，主要應用于調味品領域。咸味肽的加入能夠顯著提高食鹽的咸度，減少食鹽中鈉離子的含量，進而減少因人體攝入大量鈉離子而引發的高血壓、心血管等疾病的發病率。遲韻等[52]通過添加一定比例的精制食鹽、水果有機酸、酵母提取物和抗結劑，提供了一種天然、綠色、健康和提高精制鹽咸度的增咸食用鹽技術配方。在減少食鹽和不引入鉀鹽的情況下，增強人體味蕾對咸度的感知，真正做到減鹽而不減咸。

7.2 咸味增強劑

咸味增強肽是通過蛋白生物酶解技術制備的蛋白酶解產物，口感鮮咸，能夠增加咸味，且具有營養保健等功效，可用于開發具有營養功能的調味品。Schindler等[53]通過在對魚精蛋白進行酶解、分離、純化的研究中發現，制備的精酰胺二肽具有明顯的增咸效果。王欣等通過木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的協同作用水解哈氏仿對蝦提取咸味肽，得到的咸味肽能將10 mmol/L NaCl溶液的感官咸度提高到55 mmol/L NaCl溶液的感官咸度，具有明顯的增咸效果。陳瑞霞等[54]利用木瓜蛋白酶酶解淘汰蛋雞雞肉制備咸味增強肽，結果表明酶解液的加入能將55 mmol/L NaCl溶液的咸度提升26.2%。

7.3 咸味香精

近年來，咸味香精發展迅速，占據香精市場的核心地位，是我國香精市場的主導產品。目前，咸味香精的原料主要來源于動、植物的氨基酸和還原糖，通過酶解和美拉德反應等工藝制備而成，其中美拉德反應是制備香精的重要反應，利用美拉德反應生產咸味香精成為重要研究內容，相比調制的香精，其制備的咸味香精香氣更加醇厚，口感更加細膩。咸味香精是咸味肽與還原糖的美拉德反應產物，能夠增強食品的咸鮮味、醇厚感和持續感，通常被用于制作調味料。鄭家倫等[55]以大豆粕酶解液為基料，通過美拉德反應制備咸味香精，并利用HPLC和GC-MC對咸味香精的氨基酸組分和香氣成分進行分析，檢測出對生成肉香味具有重要作用的癸醛、2-癸酮、2-己基呋喃等揮發性物質。

8 展望

咸味肽的開發與其原料來源、結構、構效關系、制備合成技術、分離純化鑒定技術的發展有著密切的聯系。咸味肽受其原料來源的不同，制得的咸味肽咸度以及氨基酸序列也不同，在產品加工中也會有不同的應用和限制，如從蝦蟹中提取的咸味肽，對于那些海鮮過敏的人群來說，用其加工的產品將不能食用。此外，咸味肽受其氨基酸的組成、性質、空間結構、肽鏈的長度及氨基酸的序列的影響，造成咸味強度和閾值不同，且相同氨基酸組成的咸味肽因其結構序列和空間結構不一致，咸度閾值也不同，這為咸味肽的深入機理研究及合成技術提供了參考。目前，食鹽中鈉離子的攝入量受到嚴格控制，因此對于咸味肽的研究及產品開發尤為重要。咸味肽可以應用于增咸食用鹽、咸味增強劑和咸味香精等調味產品的開發中，不僅能夠降低鈉離子的攝入量，保證食物具有明顯咸度，而且能夠在適當的條件下替代食鹽用于食物調味，可以更好地被人體消化吸收利用，其開發與應用前景廣闊。