腺苷酸活化蛋白激酶通路在老年糖尿病性骨質疏松中調控機制研究

柳 雯， 殷雪嬌， 王靈納， 陳宏丹， 林德文， 梁榮珍

海南醫學院第二附屬醫院 老年醫學科，海南 海口 570100

骨質疏松(osteoporosis，OP)為中老年常見病，主要表現為骨量減少、骨脆性增加，進一步導致骨折風險增加。有研究報道，OP多由骨吸收及骨形成的平衡被打破引起，與成骨細胞和破骨細胞的活性狀態有關[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)相關信號通路作為細胞內傳感器，可通過對核因子kB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor KB ligand，RANKL)的調控作用促進成骨細胞的增殖、分化及骨生成功能，抑制破骨細胞生成及功能[2]。骨骼與葡萄糖代謝水平密切相關，糖尿病患者的骨轉化率相對更低，易繼發糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis，DOP)[3]。AMPK參與細胞內信號傳導、細胞增殖和分化等。有研究表明，AMPK信號通路對骨代謝有重要的調控作用，可影響骨代謝活動[4]。也有研究發現，高糖水平會抑制破骨細胞分化生成和骨吸收，通過上調RANKL表達，降低骨保護素(osteoprotegerin，OPG)表達對骨分化情況進行調控[5]。有研究證實，AMPK可抑制破骨細胞分化生成中的關鍵信號聯級，抑制破骨細胞生成[6]。但現階段研究并未闡明AMPK在葡萄糖水平對成骨細胞及破骨細胞分化生成及功能影響中的調控作用。本研究旨在探討AMPK相關通路在老年DOP患者中的調控機制。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2019年1月至2021年1月海南醫學院第二附屬醫院收治的157例老年DOP患者作為DOP組。納入標準：(1)年齡>60歲；(2)符合2型糖尿病診斷標準；(3)符合OP診斷標準，骨密度值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值2.5個標準差(T<-2.5)。排除標準：(1)1型糖尿病者；(2)伴糖尿病急性合并癥者；(3)伴惡性腫瘤、肝腎功能異常及影響鈣磷代謝的疾病者；(4)入組前3個月內服用過影響骨代謝的藥物者；(5)因結締組織病、長期感染等其他因素造成的OP者。另選取同期157例健康體檢者納入健康組。本研究經醫院倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 骨密度測量 兩組采用雙能量X射線骨密度儀(深圳市艾克瑞電氣有限公司)檢測腰椎L2～L4、股骨頸的骨密度。

T值=測量值-參考值(正常人群峰值)/標準偏差

1.2.2 骨代謝指標 采集空腹肘靜脈血，3 000 r/min離心15 min后留取血清，應用酶聯免疫法檢測血清骨特異性堿性磷酸酶(bone alkaline plaosphatase，BALP)、骨鈣素(osteocalcin，OC)、Ⅰ型原膠原N-端前肽(procollagenⅠtype N-terminal peptide，PINP)，采用電化學發光法檢測β-膠原降解產物(β-cterminal telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTX)水平。

1.2.3 外周血單個核細胞的分離 采集2 ml空腹外周靜脈血，1 500 r/min離心10 min后留取上清液。取15 ml上清液于離心管中，加等體積PBS稀釋，加等體積淋巴細胞分離液。用滴管將稀釋血液沿管壁加于分離液表面，低溫下2 000 r/min離心20 min。用吸管吸出單個核細胞層于離心管中，加3倍體積的PBS液洗滌，1 500 r/min離心10 min后移去上清液，加入PBS液懸浮沉淀。

1.2.4 實時熒光定量PCR (1)RNA獲取：用PBS沖洗外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)，加1 ml的TRizol后混勻，放置10 min使細胞裂解。每毫升的TRIzol樣品中加0.2 ml氯仿，上下反復充分混勻15 s，靜置3 min等待分層。置于冷凍離心機中離心(4℃、1 2000 r/min、15 min)，轉移上層至無RNA酶管中，用等體積異丙醇沉淀RNA，混勻后靜置10 min，再次于冷凍離心機中離心，移去上清液后加75%乙醇清洗RNA沉淀。置于室溫下干燥10 min使RNA變為半透明。最后加40 μl無RNA酶的焦碳酸二乙酯水吹打使其完全溶解，所得RNA溶液置于-80℃下備用。(2)cDNA合成：配置反應體系，將溶液于1 000 r/min下短暫離心使其混勻，70℃下水浴3 min后，冰水浴至溫度在0℃左右時加逆轉錄酶，37℃下60 min，取出后立即95℃、3 min，所得cDNA于-80℃下備用。(3)以GAPDH作內參進行實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)，反應體系：cDNA 2 μl、上游和下游引物各0.8 μl、滅菌蒸餾水6.4 μl、SYBR Green Master Mix 10 μl。引物序列：GAPDH上游5′-AGGCCGGTGTGAGTATGTC-3′，下游5′-TGCCTGCTTCACCACCTTGT-3′；AMPK上游5′-TGATGATGAGGVTGTGAA-3′，下游5′-TAGAGGCGAGGTAGAACT-3′；OPG上游5′-GCTGTTCCTACCAAGATTATAC-3′，下游5′-CTACACTCTCTCGGCATTCA-3′；BMP-2上游5′-GAATCAGAACACAAGTCAGT-3′，下游5′-GACCTGCTAATCCTCACA-3′；RANKL上游5′-GCGTACCTACAGACTATC-3′，下游5′-GGACACCTGAATGCTAAT-3′。將反應體系混勻并快速離心，反應條件：95℃、1 min，之后95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、45 s(40個循環)，重復3次取均值，繪制熔解曲線。

2 結果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組男性比例、年齡、體質量指數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。DOP組股骨頸骨密度、腰椎骨密度低于健康組，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 兩組研究對象血清指標比較 DOP組BALP、OC、PINP低于健康組，血清β-CTX高于健康組，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血清檢測結果比較

2.3 兩組研究對象mRNA水平比較 DOP組PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA表達水平低于健康組，RANKL mRNA表達水平高于健康組，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組研究對象mRNA水平比較

2.4 相關性分析 股骨頸骨密度與PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA均呈正相關(r值分別為0.296、0.271、0.304，P<0.05)，與RANKL mRNA呈負相關(r值為-0.322，P<0.05)。腰椎骨密度與PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA均呈正相關(r值分別為0.289、0.277、0.313，P<0.05)，與RANKL mRNA呈負相關(r值為-0.331，P<0.05)。

3 討論

由于老年人群骨代謝退行性改變，骨骼失養，骨形成減少，易發生OP。本研究中，DOP患者股骨頸骨密度、腰椎骨密度明顯低于健康者，與既往研究[7]結果一致。有研究表明，高血糖會引起骨膠原特性改變，骨密度下降，加之代謝紊亂造成骨代謝異常，骨轉化率下降，使得老年糖尿病患者成為OP的高發人群，這也是DOP患者腰椎與股骨頸骨密度大幅降低的主要原因[8]。

人體骨骼中破骨細胞與成骨細胞處于動態平衡是維持骨骼正常強度和彈性的關鍵，這種動態平衡一旦被打破，就會導致骨丟失、骨密度下降，繼而形成OP[9]。骨轉換標志物是骨組織分解與合成的代謝產物，其中BALP、OC、PINP是成骨細胞活動及骨形成的代謝產物，反映骨形成情況與成骨細胞活性；而β-CTX是破骨細胞活動及骨吸收時的代謝產物，反映骨吸收情況與破骨細胞活性。本研究結果顯示，DOP組的血清BALP、OC、PINP低于健康組，血清β-CTX高于健康組，進一步說明了骨過度吸收與骨形成下降打破成骨細胞與破骨細胞的動態平衡造成的骨代謝異常是引發DOP及骨密度下降的主要原因之一。

AMPK被證實參與細胞的凋亡、增殖和分化，其被激活后會抑制葡萄糖誘導的胰島素分泌，使存活的胰腺B細胞減少，成為糖尿病的臨床治療靶點之一[10]。AMPK可通過多種途徑促進成骨分化和礦化，增加骨形成[11]。有研究發現，小鼠敲除AMPK亞基基因后出現骨量下降的情況[12]。但AMPK通路調控DOP患者骨代謝的相關分子學機制的研究較為缺乏。有研究證實，OPG、RANKL、BMP-2基因對骨代謝有明顯影響，其表達會間接調控成骨細胞與破骨細胞活性，影響骨分化與骨吸收[13]。本研究結果顯示，DOP組PBMCs中AMPK、OPG、BMP-2的mRNA表達低于健康組，RANKL mRNA表達高于健康組，且股骨頸骨密度及腰椎骨密度與PBMCs中AMPK mRNA、OPG mRNA、BMP-2 mRNA均呈顯著正相關，與RANKL mRNA呈顯著負相關，提示DOP患者骨密度的變化可能與AMPK激活后對OPG、RANKL、BMP-2等基因表達的調控有關。OP的發生與氧化應激反應、炎癥反應等多種因素有關[14-15]。DOP患者長期處于高血糖狀態，機體產生氧化應激與炎癥反應等促進機體相關細胞因子的分泌增加，刺激AMPK表達下調，同時下調c-Fos及活化T細胞核因子c1的表達，促進RANKL表達上調與OPG表達下調，使OPG-RANKL體系失衡，促進RANKL與破骨細胞前體細胞表面的活化因子結合，抑制成骨細胞分化成熟。有研究證實，高糖水平會刺激增加RANKL表達上調、OPG下調，從而影響成骨分化[16]，與本研究結果一致。此外，AMPK表達下調會進一步抑制BMP-2表達，形成AMPK/BMP-2信號通路來抑制成骨細胞的形成與分化。國外研究證實，AMPK表達下調引起的BALP活性降低、BMP-2表達抑制均可被靶向AMPK的siRNA抑制[17]。也有研究表明，糖尿病通過降低BMP-2表達來抑制成骨細胞的增殖及功能[18]。

綜上所述，DOP患者的AMPK表達明顯下調，并可通過AMPK/OPG/RANKL及AMPK/BMP-2通路對患者骨代謝進行調控，使骨密度與血清BALP、OC、PINP下降，血清β-CTX升高。