親環(huán)素A在人卵巢癌組織中表達情況及臨床意義

嚴京哲， 梁衍濤， 袁 勇， 周 莉

吉林省腫瘤醫(yī)院1.腹部腫瘤二科；2.骨及軟組織腫瘤外科；3.婦瘤二科，吉林 長春 130021

卵巢癌是常見的女性生殖器官惡性腫瘤，因卵巢位于盆腔深部，早期病變不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀時已處于晚期。卵巢上皮性癌病死率居婦科惡性腫瘤第1位[1]。因此，尋找特異性的卵巢癌治療及預后標志物有助于卵巢癌的早期診治，進而改善患者預后。親環(huán)素A(Cyclophilin A，CypA)是免疫抑制劑環(huán)孢霉素A在細胞內(nèi)的作用靶點[2-3]。有研究表明，多種實質(zhì)性腫瘤組織中CypA蛋白均高表達[4-8]；而卵巢癌與CypA蛋白相關(guān)性的研究較少。因此，本研究通過手術(shù)切除人卵巢癌組織標本，采用免疫組化法分析人卵巢癌組織中CypA蛋白表達與其病理分級、臨床分期及預后的相關(guān)性，探討CypA蛋白作為輔助標志物診斷人卵巢癌的可行性。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取吉林省腫瘤醫(yī)院自2000年1月至2012年12月收治的37例接受婦科手術(shù)切除并病理證實為卵巢癌的患者為研究對象。卵巢癌患者年齡32～71歲，平均年齡(47.3±8.8)歲；病理分級高(G1級)、中分化(G2級)13例，低分化(G3級)24例；臨床分期Ⅰ/Ⅱ期15例，Ⅲ/Ⅳ期22例；均為初發(fā)，且術(shù)前未接受過放化療。收集卵巢癌患者的卵巢癌組織。另選取同期10例接受婦科子宮肌瘤手術(shù)的患者作為對照。子宮肌瘤患者年齡36～60歲，平均年齡(46.0±8.2)歲。收集子宮肌瘤患者的正常卵巢組織。患者及家屬均知情同意。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。組織標本甲醛40 g/L固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約5 μm。DAB、ABC復合物、羊抗兔二抗購自Vector公司，兔抗人CypA多克隆抗體ab41684購自abcam公司。

1.2 實驗方法 (1)常規(guī)脫蠟、水化切片；(2)用pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液0.01 mol/L抗原修復1～2次；(3)用含H2O230 ml/L的甲醇800 ml/L室溫條件下封閉切片20 min，目的在于消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響；(4)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時間5 min，加入0.3% Triton X-100，置于室溫條件下孵育30 min，目的在于提高細胞的通透性；(5)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時間5 min，加入CypA多克隆抗體(1∶200)，置于4℃條件下24 h；(6)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時間5 min，加入二抗(1∶400)，置于室溫條件下孵育2 h；(7)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時間5 min，加入ABC復合物(1∶400)，置于室溫條件下孵育2 h；(8)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時間5 min，用蒸餾水迅速沖3次，然后再加入DAB-H2O2顯色3 min，蘇木精復染，脫水、封片。將PBS溶液0.01 mol/L代替一抗作空白對照。

1.3 結(jié)果判定 CypA蛋白表達結(jié)果判定：陽性細胞為細胞有棕褐色、棕色、淺黃色顆粒；以陽性顆粒定位好，細胞結(jié)構(gòu)清洗、著色與背景對比清晰為陽性染色細胞條件。觀察5個(400倍)高倍視野陽性細胞所占比例，其中，(-)表示陽性細胞數(shù)<1%或無陽性細胞，(+)表示陽性細胞數(shù)1%～10%，(++)表示陽性細胞數(shù)11%～50%，(+++)表示陽性細胞數(shù)>50%。

1.4 隨訪 采用信訪和電話隨訪方式，于患者手術(shù)之日開始，隨訪至2013年6月。統(tǒng)計資料除外隨訪期內(nèi)死于卵巢癌以外原因或術(shù)后3個月內(nèi)死亡者。記錄患者生存時間。

2 結(jié)果

2.1 CypA蛋白表達情況 子宮肌瘤患者的正常卵巢組織CypA蛋白陰性表達(圖1a)；病理分級G1～G2級卵巢癌細胞胞質(zhì)有棕黃色細顆粒，染色淡，陽性細胞少(圖1b)；病理分級G3級卵巢癌細胞陽性細胞多，且胞質(zhì)棕黃色著色較深(圖1c)。37例卵巢癌組織中，CypA蛋白表達22例，陽性率為59.5%(22/37)；10例正常卵巢組織中，CypA蛋白表達0例，陽性率為0(0)。卵巢癌組織CypA蛋白表達陽性率明顯高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CypA蛋白表達22例患者中：(1)病理分級G1～G2級4例，陽性率為30.8%(4/13)；病理分級G3級18例，陽性率為75.0%(18/24)。G3級卵巢癌組織CypA蛋白表達陽性率明顯高于G1～G2級卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)臨床分期Ⅰ/Ⅱ期5例，陽性率為33.3%(5/15)；臨床分期Ⅲ/Ⅳ期17例，陽性率為77.3%(17/22)。Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌組織CypA蛋白表達陽性率明顯高于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 卵巢組織CypA蛋白表達情況[a.正常卵巢組織，CypA蛋白表達陰性，200倍；b.人卵巢癌病理分級G1級組織，CypA蛋白表達弱陽性(+)，400倍；c.人卵巢癌病理分級G3級組織，CypA蛋白表達強陽性(+++)，400倍]

2.2 CypA蛋白在人卵巢癌組織中表達強度與預后相關(guān)性 37例卵巢癌患者平均隨訪43.54個月(3～87個月)。15例患者CypA蛋白表達陰性(-)，7例患者弱陽性(+)，6例患者中度陽性(++)，9例患者強陽性(+++)。CypA蛋白表達陰性(-)患者平均生存時間(62.55±14.32)個月，弱陽性(+)(44.29±13.33)個月，中度陽性(++)(31.83±7.78)個月，強陽性(+++)(19.11±10.79)個月，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CypA蛋白表達強度與患者生存時間呈負相關(guān)(r=-0.792，P<0.05)。

3 討論

有研究報道，CypA蛋白在胰腺癌[4]、肺癌[5-6]、大腸癌[7]等多種腫瘤細胞中高表達，與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。多項研究證實，癌組織中CypA蛋白表達增高，在子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌中，CypA的表達與病理分級、預后密切相關(guān)[8-9]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中CypA蛋白的表達在胰腺癌的生長、侵潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[10-11]。

本研究結(jié)果顯示：CypA蛋白在正常卵巢組織中表達陰性，而在人卵巢癌組織中表達陽性率高，主要為胞漿著色；卵巢癌組織CypA蛋白表達陽性率高于正常卵巢組織，病理分級G3級卵巢癌組織CypA蛋白表達陽性率高于G1～G2級卵巢癌組織，臨床分期Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌組織CypA蛋白表達陽性率高于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CypA蛋白表達強度與患者生存時間呈負相關(guān)(r=-0.792，P<0.05)。即隨著卵巢癌惡性程度增長，CypA蛋白表達水平呈升高趨勢，不同病理級別、臨床分期卵巢癌組織的CypA蛋白表達差異明顯，且CypA蛋白表達與患者生存時間密切相關(guān)。這提示，人卵巢癌組織中CypA蛋白的表達可反映卵巢癌的病理級別、臨床分期及預后等因素，CypA蛋白表達水平可以作為判斷人卵巢癌惡性程度的指標之一。

綜上所述，人卵巢癌組織中CypA蛋白的表達強度與腫瘤的惡性程度及預后相關(guān)，檢測CypA蛋白表達對于判斷人卵巢癌的性質(zhì)和預后具有一定價值，其可能為癌癥治療方式的發(fā)展提供新的藥物靶點。