功能基因組學在環境化學品毒性機制研究中的應用

田明明，夏普，張效偉,2,*

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023 2. 江蘇省生態環境保護化學品安全與健康風險研究重點實驗室，南京210023

了解化學品的毒性機制是開展化學品人類健康風險評估的基礎。化學品污染已經成為嚴重威脅人類健康的重要因素[1]。一些環境化學品的暴露可導致諸多人類慢性疾病，例如肺癌、神經退行性疾病等[2-4]。了解和掌握化學品的毒性機制是準確識別介導化學品有害效應的關鍵分子事件的基礎，而這對于指導檢測化學品的最大無效應劑量(no observed adverse effect level, NOAEL)是必要的[5-8]。毒理基因組學已經被廣泛應用于環境化學品的毒性機制研究中。而傳統的毒理基因組學方法，例如：轉錄組學，通過對差異表達基因的識別與相關的生物學通路的分析，可以提供化學品潛在的毒性機制信息[9-11]。但這些分子信息缺乏直接的生物學表型的關聯，因此不能直接將這些分子信息與化學品的有害效應和毒性機制關聯起來[11-13]。

掌握化學品有害效應的易感性機制是開展精準的人類健康風險評估的重要基礎[14-17]。由于人類個體易感性差異的存在，使得當前的化學品人類健康風險評估往往存在不確定性[5-6, 14, 18]。遺傳變異由于可以在親本和子代間進行傳遞，且可以直接在分子水平影響化學品暴露導致的有害效應，因此由遺傳變異介導的易感性差異受到普遍關注[14-15]。傳統的分子流行病學方法，例如：全基因組關聯分析研究(genome-wide association studies, GWAS)和基因組-環境關聯分析研究(gene-environment-wide association studies, GEWAS)基于關聯性統計分析，來研究表型與遺傳變異之間的關聯(圖1)，難以提供相關的分子機制的解析[17, 19]。另外，傳統的毒理基因組學也不能提供與遺傳易感性關聯的分子響應信息。通過測試細胞的表型，功能基因組學可以識別基因與化學品有害效應的直接關聯，進而揭示與化學品有害效應直接關聯的分子機制[20-22]，同時提供與遺傳易感性相關的分子響應信息[23]。功能基因組學已經被廣泛應用于環境化學品的毒性機制研究中。目前，依賴于基因編輯技術的發展，功能基因組學已經從傳統的單細胞生物(酵母)發展到人類細胞，同時實現了全基因組水平的基因敲除[13, 20]。這些功能基因組學方法擁有各自的優點與局限性，適合不同類型的化學品的生物學測試。

本論文綜述了功能基因組學的原理及其主要發展，介紹了不同功能基因組學方法的優點和局限性。重點詳述了CRISPR-Cas9功能基因組學的原理與特點，以及其在環境化學品毒性機制研究中的應用。最后，本論文對聯合運用CRISPR-Cas9功能基因組學與分子流行病學分析，開展化學品有害效應的易感性機制研究進行了展望。

1 傳統的功能基因組學(Conventional functional genomics)

1.1 功能基因組學的原理與特點1.1.1 功能基因組學的原理

功能基因組學通過檢測化學品暴露后的表型，篩選出與生物表型直接關聯的基因。其中所檢測的表型既可以是細胞活性，也可以是特定的細胞毒性終點，例如氧化應激、內質網應激等。通過分析篩選出的基因，可以獲取與特定生物表型或毒性終點直接關聯的生物學通路，進而獲取介導化學品有害效應的關鍵基因和分子通路[20]。目前，功能基因組學的篩選介質已經從傳統的酵母細胞[24]發展至活體動物[25]，但活體動物的篩選目前僅用于癌癥藥物研發，尚未應用于環境化學品的毒性測試。而功能基因組學所仰仗的基因編輯技術，已經從傳統的RNA干擾(RNA interference, RNAi)[26]發展至當前主流的CRISPR技術[27]。

功能基因組學的原理：依靠基因編輯技術，在細胞中敲除(knockout)或者敲降(knockdown)全基因組或者特定的基因集，并且實現一個細胞中只敲除或敲降一個基因。與環境化學品有害效應關聯的基因，它們的功能缺失會使細胞對化學品的有害效應更加敏感或者更具抗性，通過檢測化學品暴露后細胞的表型，可以將這些敏感性變化的細胞篩選出來。因為每個細胞內均有一個特定的標簽序列(barcode)，可以通過高通量測序的方法，識別篩選出的細胞中被敲除或者敲降的基因，進而將與環境化學品有害效應關聯的基因篩選出來(圖2)[12, 20, 28]。

1.1.2 功能基因組學的特點

功能基因組學的特點主要包括：

(1)功能基因組學識別的基因具有“表型錨定”。功能基因組學通過檢測化學品暴露后的細胞表型(這些細胞表型可以是細胞活性，或者是基于特定毒性終點的熒光信號)，識別敏感性變化的突變細胞，進而篩選出與化學品有害效應或者細胞毒性終點直接關聯的基因。這些基因的功能缺失使細胞對相應的化學品的有害效應變得更敏感或者更加抗性，體現在毒性機制上，這些基因的功能就是介導化學品細胞毒性或者抑制化學品的細胞毒性。因此，功能基因組學可以憑借構建基因與化學品的有害效應或者毒性終點的直接關聯，發掘環境化學品的新穎的毒性機制[12, 20]。

(2)功能基因組學可以提供基于遺傳變異的分子視角。功能基因組學通過基因編輯技術，尤其以CRISPR-Cas9為代表的當前主流的基因編輯技術，對基因的DNA序列進行編輯，使其產生突變，形成基因功能缺失。或者通過RNA干擾技術降低基因的表達。這些基因的表達被抑制，進而導致細胞對化學品的暴露產生敏感性變化。人體的有效應的遺傳變異，主要分為兩大類：一是影響基因的表達，二是影響蛋白的活性，而這2種效應突變均體現在了基因功能的變化上[29]。基因功能的變化進而導致人體細胞對化學品暴露的敏感性發生變化[14-15]。因此，功能基因組學可以提供具有遺傳變異視角的化學品毒性機制[30]。

圖1 全基因組關聯分析研究(GWAS)和基因組-環境關聯分析研究(GEWAS)通過相關性分析預測遺傳變異與疾病表型的關聯Fig. 1 The associations between genetic variants and disease phenotypes were predicted by genome-wide association studies (GWAS) and gene-environment-wide association studies (GEWAS) through correlation analysis

圖2 功能基因組學的原理Fig. 2 The mechanism of functional genomics screen

(3)功能基因組學同樣可以用于化學品高通量測試。利用流式細胞儀篩選和高通量測序，可以實現多種化學品多劑量暴露下的表型檢測和基因功能缺失的識別，進而可以開展更多的化學品的機制毒理學研究[20]。

1.2 經典的功能基因組學

早期的功能基因組學根據生物載體和基因突變的方式可以分為：單細胞生物的功能基因組學(大腸桿菌和酵母)、雞的DT40細胞的篩選、單倍體哺乳動物細胞的篩選和RNA干擾。這些傳統的功能基因組學有各自的優點，在對于某些特定作用機制的化學品，例如：遺傳毒性化學品的檢測，仍然具有較多的應用價值。但這些方法也存在不少局限性，主要集中于和人類之間的物種差異以及能否實現全基因組水平的基因敲除(表1)。因此，當前的功能基因組學篩選需要一種基于人類細胞的且可以實現全基因組水平的基因的特異性敲除的技術。由于大腸桿菌屬于原核生物，與人類的物種差異較大，在此，本文主要綜述真核生物的功能基因組學方法。

1.2.1 酵母的功能基因組學

以酵母作為生物載體的功能基因組學篩選，已經被廣泛用于環境化學品的毒性測試，尤其以遺傳毒性化學品為代表。酵母作為功能基因組學的生物載體，有以下優勢：(1) 酵母是一種常見的真核單細胞生物，無論是單倍體或者雙倍體，酵母均是一種易擴繁、易培養的非致病性微生物；(2) 酵母的基因組已經完全解析，比較容易實現全基因組的編輯和敲除[33, 45]。(3) 酵母的基因組在進化上與其他高等真核生物保持了較高的同源性，與人類遺傳疾病相關的一半的基因都具有酵母的同源基因。對于環境化學品的暴露，酵母細胞的基本響應的分子機制與人類細胞和其他高等真核生物是一致的[31, 46]。

在解析響應環境化學品暴露的基因功能的時候，酵母突變株的表型分析是一種有效的方法。構建酵母細胞的突變株，目前主要包括：遺傳印跡法、隨機突變法和基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)的基因突變法[20]。目前已有較多種類的商業化的酵母突變株細胞庫，包括刪除了5 916個基因(含有1 159個必需基因)的純合子和雜合子細胞庫，以及刪除了4 757個非必需基因的單倍體細胞庫。這些酵母突變株均含有特異性的標簽序列，可以開展細胞庫的篩選研究[32]。目前，已有大量研究使用酵母的突變細胞庫進行環境化學品的毒性測試，主要包括遺傳毒性化學品和抑制氧化磷酸化的化學品[20]，例如苯并芘、甲醛和砷[21, 47-48]。使用酵母突變細胞庫開展這些化學品的功能基因組篩選的優勢在于：這些化學品的作用機制是通過造成DNA損傷或是線粒體呼吸鏈傳遞的抑制，而這些生物學過程的分子機制在真核生物物種進化過程中比較保守，便于進行同源基因的物種外推[49-50]。

雖然酵母的功能基因組學篩選在識別環境化學品的比較保守的分子機制中可以發揮重要作用，但酵母突變株細胞庫在環境化學品的毒性測試中依然有局限性：(1) 酵母是一種單細胞生物，對于涉及細胞間相互作用的分子機制，無法依靠酵母的功能基因組學開展研究；(2) 酵母細胞可以忍受更高劑量化學品的暴露，它的一些效應濃度往往遠高于人體細胞相應化學品的效應濃度；(3) 雖然酵母基因組中有很多人類的同源基因，但會出現一個酵母基因同時對應多個人類基因的情況，這給分子機制的外推帶來了困難。因此，需要使用與人類物種差異更小的物種開展功能基因組學研究[20-21]。

1.2.2 雞DT40細胞的功能基因組學

在雞DT40細胞中可以通過靶向整合(targeted integration)技術較為容易地實現基因敲除，因為該細胞具有非常高的靶向整合效率[51]。目前，DT40細胞主要應用于遺傳毒性化學品的功能基因組學的篩選[52]。DT40細胞具有以下特點使其適合應用于遺傳毒性化學品的毒性測試：(1) DT40細胞分裂具有較長的S期，大概占細胞循環的70%，這意味著在遺傳毒性化學品的暴露期間，大多數的DT40細胞處于DNA合成階段，這使細胞的DNA更容易遭受損傷。(2) 因為DT40細胞P53基因功能缺失，DT40細胞的細胞循環的G1/S檢測點是沒有激活的，因此就會導致在G1期沒有被完全修復的DNA損傷會隨著細胞循環不斷積累，進而影響DNA復制。以上2個特征使DT40細胞對化學品的遺傳毒性相較于其他類型細胞更敏感[52]。

目前的DT40細胞的突變株主要遍及2類與DNA損傷修復相關的生物學通路。(1)DNA復制：跨損傷修復合成(translesion synthesis, TLS)、同源修復(homologous recombination, HR)、范科尼貧血修復通路(Fanconi anemia repair)、非同源末端連接(non-homologous end joining)、鏈間交聯修復(interstrand cross-link repair)、核苷酸剪切修復(nucleotide excision repair)和堿基剪切修復(base excision repair)；

表1 不同功能基因組學方法比較Table 1 Comparison between different functional genomics

(2)細胞循環：DNA損傷檢查點(DNA damage checkpoint)[52]。共有超過100種DT40細胞突變株遍及以上DNA損傷修復通路[35, 52]。DT40細胞突變株由于DNA損傷修復的基因功能缺失，導致無法修復遺傳毒性化學品的毒性效應導致的DNA損傷，進而抑制了細胞增殖，導致細胞死亡[53]。基于此原理，目前已經開展了較多利用DT40突變細胞庫進行遺傳毒性化學品毒性測試的研究。Ooka等[36]利用DT40細胞功能基因組學篩選發現，對于苯并芘(BaP)和N-亞硝基二甲胺(NDMA)，需要使用S9代謝激活才能顯示出遺傳毒性。跨損傷修復合成缺陷的REV3-/-DT40細胞對BaP和NDMA均表現出最高的敏感性，此外雙鏈斷裂修復缺陷的RAD54-/-/KU70-/-DT40細胞也對BaP表現出較高的敏感性。Ooka等[36]使用酵母的功能基因組篩選發現跨損傷修復合成通路在三氯乙烯代謝產物的遺傳毒性分子機制中扮演重要作用，此外，通過DT40的篩選發現，跨損傷修復合成通路缺陷的DT40細胞對三氯乙烯代謝產物更敏感，相比之下，同源重組修復缺陷的DT40細胞對三氯乙烯代謝產物抗性比野生型DT40細胞更強。Ji等[54]使用DT40篩選發現堿基剪切修復缺陷Polβ-/-和跨損傷修復合成缺陷REV3-/-DT40細胞對tetra-BDEs和OH-tetra-BDEs的敏感性比野生型更高。使用半胱氨酸預處理可以降低Polβ-/-和REV3-/-DT40細胞的敏感性，表明多溴聯苯醚(PBDEs)和羥基-多溴聯苯醚(OH-BDEs)通過引發氧化應激導致遺傳毒性效應。

DT40細胞的功能基因組篩選的局限性表現在：(1) DT40細胞來源于雞的淋巴B細胞，與人類存在物種差異，不利于進行跨物種外推；(2) DT40細胞的功能基因組學篩選不能覆蓋全基因組水平，只是集中于DNA損傷修復通路的基因的研究。

1.2.3 單倍體哺乳動物細胞的功能基因組學

人類近單倍體細胞的功能基因組學篩選已經被廣泛應用于識別與化學品細胞毒性相關的基因。人類KBM7細胞來源于白血病病人的骨髓，該病人患有近單倍體慢性髓系白血病[55]。P1-55亞克隆細胞系的構建，使得細胞的單倍體構型可以保持至少12周，此外，改良后的KBM7 (HAP1)[56]是貼壁生長細胞，其8號染色體為單倍體。這使得使用KBM7細胞系進行功能基因組學篩選成為可能[37]。Birsoy等[57]將其應用于溴丙酮酸的抗性機制的識別，溴丙酮酸是一種糖酵解抑制劑，所識別的關鍵基因MCT1所編碼的蛋白是溴丙酮酸的轉運蛋白，且MCT1的mRNA水平可以被用來預測癌細胞對溴丙酮酸的敏感性，因此也被看作為腫瘤的潛在生物標志物。Shen等[58]利用KBM7細胞的功能基因組學識別了與甲醛和格列衛的遺傳毒性相關的基因，實現了利用單倍體細胞的功能基因組學揭示遺傳毒性化學品的分子機制的先例。目前，人類近單倍體細胞的功能基因組學篩選往往以細胞死亡作為檢測表型，以非細胞死亡作為毒性終點的功能基因組學研究也已經發表。Duncan等[39]利用人類單倍體細胞篩選，基于細胞熒光檢測，通過篩選MHC1的細胞表面表達缺陷的突變細胞，識別了與MHC一類抗原呈遞相關的基因。Lee等[59]利用轉錄因子報告基因，篩選了KBM7細胞中參與NF-κB的激活抑制的基因，并發現了新的分子機制。

目前可以多代傳代的小鼠的單倍體胚胎干細胞已經被構建，這些單倍體細胞依然具有誘導分化的能力，且分化后依然保持單倍體核型。這些細胞的構建使得研究環境化學品對正常干細胞的毒性效應以及模擬早期生命暴露提供了可能[60-61]。Elling等[60]利用轉座子介導的近于全基因組的基因突變，識別了與介導蓖麻毒素相關的基因。此外，小鼠的單倍體胚胎干細胞的功能基因組學被應用識別與6-巰基嘌呤的毒性關聯的DNA錯配修復基因[40]和介導奧拉帕尼毒性的基因[38]。以上這些研究發掘了小鼠的單倍體胚胎干細胞的功能基因組學的應用價值和潛力，擴展了在多種細胞和篩選多種發育相關通路中的應用。但是小鼠胚胎干細胞對培養條件的要求較高，此為該方法的局限性。

使用KBM7細胞的功能基因組學具有如下局限性：(1)這些細胞不是完全的單倍體；(2)使用基因誘捕逆轉錄病毒介導的隨機突變的方法產生單倍體細胞突變株，無法完全覆蓋全基因組[62]。因此，需要靶向且針對特定基因的方法，例如RNA干擾和由核酸介導的基因編輯，對基因組進行系統性的敲除或者敲降。

1.2.4 使用RNA干擾(RNA interference, RNAi)的功能基因組學

RNA干擾是一項在眾多真核生物中比較保守的生物過程。通過與一種短的20 bp左右的序列特異地干擾RNA結合，進而導致了對轉錄產物的切割和降解[63]。通過向細胞轉染體外合成的siRNA、或者siRNA的前體(short-hairpin RNA, shRNA)以及雙鏈RNA (double stranded RNA)，來抑制基因的表達。轉染方式包括脂質體介導的轉染、電轉和病毒介導的轉染(慢病毒和逆轉錄病毒)[41]。RNAi已經被廣泛應用于功能基因組學篩選后的單基因功能驗證。通過抑制特定基因的表達，檢測表型的變化[49]。

RNAi技術也可以應用于功能基因組學篩選，其篩選方式包括混合篩選和陣列篩選[64]。混合篩選是指在細胞內轉染siRNA或者shRNA庫，實現基因組水平的基因表達抑制，然后進行化學品暴露，使用高通量測序或者流式細胞儀分選的方式，對細胞的表型進行檢測，細胞的表型既可以是細胞活性，也可以是關聯特定毒性終點的熒光。陣列篩選是指將細胞接種在不同的孔中，在不同的孔里面進行單獨的轉染、化學品暴露和表型的檢測，包括細胞活性檢測和熒光檢測。例如：可以使用高內涵細胞篩選的方法對已經標記過多個熒光標簽的細胞進行表型篩選[65]。目前，較為成熟的RNA干擾質粒庫，例如RNAi Consortium Lentiviral Library，可以靶向人類基因組17 200個基因，且每個質粒均含有一段標簽序列，已經被廣泛用于RNAi的功能基因組篩選中[42]。通過采用混合篩選的方法，采用慢病毒轉染，將質粒轉染到細胞中，構建全基因組水平表達抑制的細胞庫。在環境化學品的暴露下，特定基因的表達抑制會賦予細胞抗性或者敏感性，導致相應的細胞在細胞庫中的豐度發生變化。通過流式細胞儀篩選以及高通量測序的方法，獲取不同標簽序列的豐度信息，通過比較處理組與對照組的豐度，識別介導對化學品暴露抗性和敏感性的基因。RNAi功能基因組學篩選使用細胞系或者經過與特定表型關聯的改造后的細胞，已經被廣泛地應用于化學品細胞毒性的抗性(例如環境毒害重金屬[66-67])、特定的生物學過程以及病原物的響應相關的研究[68-71]。

和其他功能基因組學篩選方法一樣，RNAi篩選的局限性主要體現在：(1) RNAi存在顯著的脫靶效應[72]，部分siRNA會結合到與其只有部分序列匹配的轉錄產物上，導致基因表達抑制效應的特異性下降[43]。(2) RNAi存在對基因表達的抑制效率參差不齊的情況。首先，RNAi不能完全抑制基因的表達，有些基因的絕大多數轉錄產物即使被抑制，但依然會有顯著的蛋白表達。其次，有些siRNA對轉錄產物的抑制效率較低，這就需要對一個基因設計更多的siRNA來保證抑制效率[73]。

2 CRISPR功能基因組學(CRISPR functional genomics)

2.1 CRISPR功能基因組學的原理和特點2.1.1 CRISPR-Cas9基因編輯技術介紹

CRISPR-Cas9技術為在各種細胞類型中進行基因組編輯提供了一種有效的方法[28, 74]。與RNAi相比，這種RNA引導的基因編輯技術可以在基因組中產生永久性突變，導致基因功能喪失或獲得[74]。CRISPR-Cas9是一種經濟、快速、高效且特異性強的基因編輯方法。Cas9蛋白由一個單一的引導RNA(single guide RNA, sgRNA)引導并在特定的基因組位點誘導雙鏈DNA斷裂。切割位點的識別和靶向特異性由一個超過20 bp的與目標DNA序列匹配的sgRNA和一個與之相鄰的短核苷酸序列(一個序列為NGG的三核苷酸序列，其中N是任意核苷酸)決定[75]。DNA雙鏈斷裂(double-strand DNA breaks, DSB)通過非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ) DNA修復途徑或同源定向修復途徑(homology directed repair, HDR)修復[20]。NHEJ修復在DSB位點產生插入/缺失(indels)，導致轉譯框位移或提前終止密碼子，導致基因敲除。HDR途徑將修復模板(供體DNA)并入DSB，將特定核苷酸變化引入靶基因(圖3)。在線性同源修復供體存在的情況下，通過將2個sgRNAs與Cas9酶結合可有效引發高達10 kb的DNA的缺失[44]。

通過對寡核苷酸的引導序列sgRNA的大規模合成，可實現在全基因組水平上對基因功能的探究[76]。與shRNA庫僅介導基因敲降不同，sgRNA庫可與Cas9核酸酶結合用于產生基因敲除突變的細胞庫。Sander和Joung[77]運用電穿孔法、核裂解和脂質體轉染，在哺乳動物細胞中實現瞬時表達質粒DNA中的Cas9和sgRNAs，而慢病毒載體可用于人類和小鼠細胞中持續性表達Cas9和sgRNA。研究人員可以根據細胞的數量和細胞系的類型，從而選擇單一或雙載體用于轉導Cas9與sgRNA。在雙載體系統中，首先進行的是細胞Cas9的初轉導，然后篩選出陽性克隆體進行擴增，隨后進行sgRNA的轉導。例如，Sabatini和Lander的團隊開發了一種雙載體文庫，該文庫由73 151個sgRNA質粒組成，共靶向7 114個人類基因和100個非靶向對照基因[78]。使用單載體系統，Cas9和sgRNA在一個載體中被轉導入細胞。這種系統是由Zhang的團隊開發的，使用一個單獨的慢病毒載體將Cas9、sgRNA和嘌呤霉素選擇性標記物轉染進靶細胞[28]。Zhang的團隊最初開發了一個人類全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫(GeCKOv1)，包含64 751個特異導向序列，共靶向18 080個人類基因。該團隊對GeCKOv1文庫進行了改良，改良后的文庫含有123 411個sgRNAs，共靶向19 050個基因(GeCKOv2)[79](圖4)。GeCKOv2文庫比GeCKOv1文庫多靶向約1 000個基因，每個基因均擁有6個靶向的sgRNAs，且均保證了最小的脫靶效應。此外，v2文庫里sgRNA通過產生miRNA前體的發夾結構突變來使相應的miRNA產生功能缺失。在全基因組小鼠慢病毒sgRNA文庫開發方面，Koike-Yusa等[80]開發了包含87 897個特異sgRNA、共靶向19 150個編碼蛋白的基因文庫，而Sanjana等[79]開發了130 209個sgRNA、靶向20 611個基因的全基因組小鼠慢病毒sgRNA文庫。

圖3 非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復途徑(HDR)的原理[20]注：DSB表示DNA雙鏈斷裂，sgRNA表示單一的引導RNA。Fig. 3 The mechanisms of non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR)[20]Note: DSB stands for double-strand DNA breaks; sgRNA stands for single guide RNA.

2.1.2 CRISPR-Cas9功能基因組篩選工作原理和流程

目前廣泛使用的針對環境化學品的CRISPR-Cas9功能基因組學篩選均是混合篩選法。以下內容均以混合篩選法展開。

由慢病毒轉染介導sgRNA和Cas9進入哺乳動物細胞后，編碼sgRNA和Cas9蛋白的核酸會整合到細胞的基因組中，產生sgRNA和Cas9蛋白的穩定表達(圖4)。整合到細胞基因組當中的sgRNA序列可以發揮標簽序列的作用，進而對被轉染進sgRNA的細胞進行特異性的標記。由于基因的功能缺失，使得細胞在暴露于環境化學品的時候，參與介導化學品毒性效應的或者維持細胞穩態的生物學過程會發生改變，進而導致細胞對環境化學品的有害效應的敏感性發生變化，表現為細胞活性或者其他特定表型的不同。基于對這些變化的生物表型的檢測(細胞活性或者熒光標記)，可以將與特定表型關聯的基因功能缺失篩選出來。通過深度測序，可以通過識別每個細胞的基因組中的sgRNA序列來構建基因功能缺失與特定表型的關聯[12, 28]。

圖4 GeCKOv2的工作原理Fig. 4 The working mechanisms of the GeCKOv2 library

CRISPR-Cas9功能基因組學篩選工作流程主要包括以下6個環節(圖5)。

(1)合成靶向全基因組的基因的sgRNA質粒文庫。通過轉化大腸桿菌感受態細胞，對質粒文庫進行擴增，獲取每個sgRNA克隆數超過500的質粒文庫[81]。

圖5 CRISPR-Cas9功能基因組學篩選工作流程[11]Fig. 5 The workflow of CRISPR-Cas9 functional genomics screen [11]

(2)用以轉染人類細胞的慢病毒的制備。制備慢病毒需要將sgRNA載體質粒與慢病毒包裝質粒共轉染進HEK293T細胞(圖4)，通過超高速離心的方法收集慢病毒顆粒。同時需要測定純化后的慢病毒的滴度，一般需要超過1×108IFU·mL-1的滴度[81]。

(3)利用慢病毒將sgRNA和Cas9轉染進人類細胞系。因為同時需要考慮覆蓋所有的sgRNA，一般對于一個包含100 000個sgRNA的庫，在進行慢病毒轉染的時候，最少需要1.7×108個細胞。慢病毒轉染結束后，需要維持一定劑量的抗生素選擇壓力，去除掉那些沒有轉染進質粒的細胞。

(4)通過深度測序，進行細胞庫的質控。

(5)進行環境化學品的CRISPR功能基因組篩選。這種篩選分為2種：正向篩選(positive screen)和反向篩選(negative screen)[30]。

(6)通過深度測序，識別sgRNA標簽序列，構建基因功能缺失與特定生物表型的關聯。

2.2 CRISPR-Cas9功能基因組學在化學品毒性機制研究中的應用

基于CRISPR-Cas9技術開發的功能基因組學篩選可以實現在全基因組水平系統性基因敲除的基礎上，以人類細胞和高等哺乳動物細胞為生物載體，開展環境化學品的毒性機制研究。以此方法獲取的全基因組水平的分子響應信息可以提供基因與化學品有害效應的直接關聯，實現基因功能的表型錨定，進而發掘環境化學品的新的毒性機制，為在有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架下的環境化學品毒性預測與風險評估提供分子機制基礎。另外，由于CRISPR-Cas9功能基因組學的一個重要的表型檢測是細胞活性，即以細胞死亡為毒性終點，這恰恰是某些環境化學品產生有害效應的重要的中間事件。從AOP的角度看，細胞死亡往往是通往有害結局(adverse outcome, AO)的重要關鍵事件(key events, KE)。目前，以細胞死亡為關鍵事件的疾病，往往是一些死亡率較高且難以治愈的疾病，例如神經退行性疾病，包括帕金森、老年癡呆等，其重要病因是神經細胞的大量壞死，導致神經系統的功能退化[82]。近年來，這些疾病的發生和環境污染之間的聯系受到普遍關注[4, 83]。應用功能基因組學可以發掘環境化學品暴露導致的細胞死亡與基因功能之間的直接關聯，因此，CRISPR-Cas9功能基因組學篩選在研究環境化學品暴露導致細胞死亡的分子機制與相應疾病之間的聯系上，具有重大優勢[30]。

2.2.1 建立基因與化學品有害效應的直接關聯

目前，CRISPR-Cas9功能基因組學篩選已經比較廣泛用于藥物和有毒物質的生物學測試，包括治療癌癥的藥物、微生物毒素、有毒重金屬、農藥與空氣污染物的研究。對于藥物和微生物毒素的報道，Shen等[20]已做了較為完整的綜述。本文只綜述CRISPR-Cas9功能基因組篩選在環境化學品的毒性機制的研究。

GeCKOv1質粒庫首次被應用于識別化學品細胞毒性關聯基因。本課題組的Xia等[12]首次將CRISPR-Cas9功能基因組學篩選應用于環境化學品的毒性機制研究。他們利用GeCKOv1質粒庫構建了全基因組水平敲除的人類肝癌的HepG2細胞，通過暴露于3種不同劑量(細胞毒性的IC50、IC20、IC10)的三氯生(triclosan, TCS)，通過檢測以細胞死亡為毒性終點的表型，識別了一些已知的三氯生毒性機制，同時也發掘了三氯生的潛在毒性機制。排名靠前的2個重要基因FTO和MAP2K3的功能缺失均介導了HepG2細胞對三氯生引發的細胞死亡的抗性。三氯生低劑量反向篩選識別出的基因顯著富集了與免疫相關的生物學通路，這與低劑量三氯生暴露下的轉錄組提供的分子響應信息是一致的。通過聯合分析疾病數據庫(DisGeNET和CTD)，發現了FTO和MAP2K3與乳腺癌和肥胖的關聯。而流行病學研究表明乳腺癌和肥胖均與三氯生暴露相關[84-85]。該研究通過CRISPR功能基因組篩選發掘了三氯生的潛在毒性機制，并且提示了與三氯生暴露相關的疾病的遺傳風險因素。

基于GeCKOv2質粒庫的二次篩選增加CRISPR篩選結果的準確性。Sobh等[86]利用GeCKOv2質粒庫構建了全基因組敲除的人類白血病細胞K562，揭示了乙醛的潛在毒性機制。該團隊通過將sgRNA質粒文庫分成2個亞庫，并進行了2次反向篩選，通過第二次的篩選，對第一次的篩選結果進行了驗證，該方法是一種利用二次篩選對多個備選基因進行驗證的嘗試與創新。此外，OVCA2被識別出與細胞對乙醛的細胞毒性相關，OVCA2的基因功能缺失導致細胞對乙醛導致的細胞死亡敏感性增加，同時，OVCA2的缺失導致細胞在乙醛暴露下的DNA加合物積累的增加，提示OVCA2與乙醛介導的遺傳毒性有關。此外，該團隊還利用K562全基因組敲除的細胞庫識別了與三價砷細胞毒性相關的基因[87]，其中KEAP1和TXNDC17敲除會顯著增強細胞對三價砷細胞毒性的抗性。AQP3、ZNT1和MTF1的功能缺失也可以增強對三價砷的抗性，ABCC1的功能缺失可以增強細胞對三價砷的敏感性。硒代半胱氨酸代謝通路上的基因的功能缺失會顯著增強細胞對三價砷的抗性，提示細胞內的硒代謝與三價砷的相互關系會影響砷的細胞毒性。

通過檢測細胞熒光識別基因與低劑量化學品有害效應之間的關聯。Panganiban等[88]使用CHOP報告基因法為檢測終點，通過CRISPR全基因組篩選識別了功能缺失會增加內質網應激介導的細胞凋亡的基因。CRISPR全基因組篩選識別出L3MBTL2、MGA和microRNA-124-3是打分最高的基因。這3個基因的功能缺失會導致細胞對多種通過誘導細胞內質網應激導致細胞凋亡的化學品的敏感性增強，而這些基因的過表達，可以導致敏感性降低。L3MBTL2在未產生內質網應激的細胞中，與CHOP的啟動子結合，抑制CHOP的表達，但在發生內質網應激的細胞中，與CHOP啟動子分離。此外，miR-124-3直接靶向內質網應激信號通路的關鍵基因。

目前，CRISPR功能基因組篩選已經通過檢測細胞活性或者與特定毒性終點關聯的熒光，構建了基因與環境化學品有害效應的直接關聯。檢測細胞活性的CRISPR篩選可以識別與介導細胞死亡關聯的基因，而檢測與特定毒性終點關聯的熒光的CRISPR篩選可以識別與介導相應細胞毒性關聯的基因。前者基于檢測細胞活性，因此其識別的基因不受已有毒性機制的約束，可以在最大程度上獲取與介導細胞死亡關聯的基因。相比之下，檢測與特定毒性終點關聯的熒光的CRISPR篩選，其檢測指標是基于已知毒性機制設置的報告基因，可能導致識別的基因范圍受限。但這種篩選方法因為檢測細胞熒光，進行篩選所需要的化學品暴露劑量往往比較低，且暴露時間更短，便于進行對低劑量化學品或者基于環境暴露劑量的化學品的毒性機制研究。

2.2.2 識別導致細胞死亡的化學品毒性機制

由于以細胞死亡為毒性終點的表型檢測是CRISPR功能基因組學篩選最主要的檢測指標，因此，目前大多數CRISPR篩選研究均是識別與細胞死亡關聯的分子機制。這類研究主要分為對癌癥藥物和環境化學品暴露導致細胞死亡的功能基因組學篩選。而對于環境化學品的毒性機制研究，細胞死亡是相應化學品所導致有害效應的重要中間事件，這類化學品往往通過誘導氧化應激、線粒體損傷等而導致細胞死亡[89-90]。而與這類化學品暴露關聯的疾病的重要病因就包括靶細胞的死亡，因此，這類化學品導致細胞死亡的分子機制往往是導致疾病的重要機制或者是可以開發成治療靶標的生物標志物[91]。

CRISPR功能基因組學篩選可以識別導致細胞死亡的分子啟動事件。Reczek等[30]使用CRISPR功能基因組學篩選識別了與百草枯暴露導致細胞死亡關聯的分子機制。百草枯可以通過引發細胞氧化應激導致細胞死亡，而百草枯誘導細胞氧化應激的根源是不清楚的。該團隊使用覆蓋所有與代謝有關的基因的CRISPR-Cas9功能基因組學篩選，通過進行正向篩選(百草枯暴露濃度模擬百草枯急性暴露的人體內暴露劑量)，識別了POR、ATP7A和SLC45A4是百草枯暴露導致細胞死亡所必需的3個基因。此外，POR是百草枯誘導細胞產生氧化應激的來源。由于百草枯是誘導帕金森疾病的重要的環境污染物之一[92]，帕金森病是一種神經退行性疾病，其主要病因為多巴胺能神經元的損傷與壞死。這次報道中發現的POR基因所編碼的蛋白位于線粒體呼吸鏈，而線粒體的功能紊亂與帕金森疾病的病因有重要聯系[93]，此研究的成果對于開發治療帕金森疾病的藥物具有重要參考價值。

多時間點的CRISPR篩選完善了導致細胞死亡的分子機制。Shortt等[23]使用全基因組敲除的人類肝細胞系HUH7細胞開展了對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)導致肝損傷機制的研究。APAP是一種常見的感冒藥，用于鎮痛消炎，但其也是一種可以導致肝損傷的化學品。該團隊通過開展多時間點的CRISPR功能基因組學篩選，發現了眾多與介導肝細胞死亡和維持肝細胞活性的基因，例如BMPR1A和FCGR3A，這些基因富集了鈣離子信號通路、TNF信號通路和脂肪酸代謝通路。這些基因和生物學通路的識別為解析APAP導致的肝損傷分子機制提供了依據，同時也為肝損傷的治療提供了潛在治療靶標。

3 展望(Perspectives)

人類對化學品暴露的有害效應存在易感性差異，而不同個體間的遺傳變異是導致這種易感性差異的重要原因。目前，以GWAS為代表的分子流行病學研究依賴關聯性統計分析來獲取遺傳變異與疾病表型的關聯，但難以為這種關聯提供機制證據。同時，基于統計分析篩選出的備選基因往往數量較多，GWAS研究無法提供優先性評估。而CRISPR-Cas9功能基因組學可以提供基于遺傳變異視角的化學品的毒性機制[30]，通過聯合CRISPR篩選與分子流行病學分析，可以開展針對化學品有害效應的易感性機制研究，進而為有效識別易感人群提供機制證據，為開展環境化學品的精準風險評估奠定基礎(圖6)。

當前的CRISPR-Cas9功能基因組學依賴于CRISPR-Cas9基因編輯技術進行對基因的編輯或敲除。目前，針對于其在化學品毒性機制研究的應用，CRISPR-Cas9技術主要的局限性表現在脫靶效應[94]和物種的限制。脫靶效應可以通過生物信息學的計算，對sgRNA序列的設計進行優化，進而降低脫靶概率[94-95]。同時，可以通過技術改進，例如：可以事先將細胞系穩定表達優化設計的Cas9蛋白，然后將只含有sgRNA的質粒轉染進細胞中，這樣既增加了轉染效率，也可以降低脫靶概率[96]。另一方面，當前的CRISPR篩選主要應用于哺乳動物細胞，在其他物種中的應用較少。而這種限制不是來源于CRISPR技術本身，而是因為對其他物種的基因組的解析程度不足。目前，已有少量在非哺乳動物細胞中進行CRISPR功能基因組篩選的報道，例如家蠶[97]。隨著其他物種的基因組的不斷解析，可以實現CRISPR功能基因組篩選在更多生態物種中的應用，進而為該技術在生態毒理學中的廣泛應用奠定基礎。

分子流行病學利用基因組學測序，通過關聯性統計分析，建立遺傳變異與個體疾病表型之間的關聯。傳統的分子流行病學方法主要是全基因組關聯性研究(GWAS)。依賴于組學技術和高通量測序技術的進步，基于人群的環境化學品暴露的轉錄組學、代謝組學和表觀遺傳組學已經逐漸被應用于環境化學品的毒性機制研究。這些人群組學方法的最大優勢在于檢測人體樣本，可以直接基于個體疾病表型進行分組和分析[98-99]。雖然這些方法獲取的分子信息具有一定程度的表型錨定，但由于疾病的復雜性，以上組學方法獲取的分子擾動信息與疾病的關系不能準確確定，例如：獲取的生物學通路擾動的信息，不能準確確定其是導致疾病的原因還是疾病本身所產生的癥狀效應，因此，這種類型的表型錨定具有不確定性。此外，由于往往不能及時獲取化學品暴露后的人體樣品，所以基于外暴露濃度的劑量-關系效應往往具有不確定性，此時，必須使用對應的內暴露劑量，這又提高了研究的成本與難度。

因此，對于化學品有害效應的易感性機制研究，需要有一種低成本且高效的替代測試方法為分子流行病學研究所識別的遺傳風險因素(genetic risk factor)提供機制證據和優先性評估。這就要求這種替代測試方法具備以下功能[20]：(1) 可以獲取全基因組水平的分子響應信息；(2) 可以建立化學品有害效應與基因功能的直接關聯；(3) 可以提供基于遺傳變異的分子事件視角；(4) 可以實現高通量的化學品測試。而CRISPR-Cas9功能基因組學篩選就是一個可以同時滿足以上要求的替代測試方法。由CRISPR-Cas9介導的對基因的編輯，可以實現對基因特定片段的特異性敲除，進而產生相應的基因功能缺失，這種基因功能缺失可以導致細胞的某些代謝和功能的變化，進而導致細胞對化學品有害效應的易感性變化。這個過程與由遺傳變異介導的化學品有害效應的易感性變化類似。遺傳變異與基因編輯所產生的效應均體現為基因功能的變化，而化學品有害效應的易感性最終是歸因于基因功能的變化，因此CRISPR-Cas9功能基因組學可以提供基于遺傳變異的分子事件視角。

未來可將CRISPR-Cas9功能基因組學與分子流行病學分析聯合運用，來探究化學品有害效應易感性機制[13, 20]。Shortt等[23]使用全基因組敲除的人類肝細胞系HUH7細胞開展了對乙酰氨基酚(APAP)導致肝損傷機制的研究。通過將CRISPR篩選獲取的基因信息與GEO數據庫中人群在APAP暴露下的轉錄組數據和肝損傷個體的轉錄組數據進行比較分析，發現了一些相同的基因。此外，通過對比疾病數據庫，也發現了一些CRISPR篩選與人群肝損傷相關基因的相同基因。這些相同的基因可以作為APAP導致肝損傷的易感性機制的潛在研究對象。但該研究對GEO數據的分析過于簡單，只是簡單地將差異表達基因與CRISPR篩選識別的基因進行維恩圖分析，尋找其中的相同基因，并未對GEO數據進行深入的再分析。此外，針對與APAP暴露導致的肝損傷相關的遺傳變異，該研究尚無對這些單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)在人群中的基因頻率和藥物導致的肝損傷的患病率或者其他相關表型數據進行關聯性分析。因此，該研究后續仍需要進行更多深入的分子機制的驗證和相關分子流行病學數據的深入分析，以在更深層次揭示對APAP導致的肝損傷的易感性機制。

總之，不同的功能基因組學具有相應的優勢和局限性，可以根據具體的研究目的和化學品特性來選擇合適的測試方法開展環境化學品的毒性機制研究。同時，在化學品有害效應的易感性機制研究方面，則需要聯合其他的組學方法以及分子流行病學分析來開展相關研究。

通訊作者簡介：張效偉(1978—)，男，博士，教授，博士生導師，主要研究方向為生態毒理學和健康風險評估。