典型殺蟲劑類內分泌干擾物對水生溞類的毒性效應研究進展

趙倩，戚錢菊，郭家驊，李琦

西北大學城市與環境學院，西安 710100

隨著殺蟲劑的廣泛應用，環境中殘留著大量有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯和新煙堿類等具有內分泌干擾效應的殺蟲劑，對生物體具有顯著的生殖和發育毒性[1]。近年來，水體環境中殺蟲劑類內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)的檢出率和檢測濃度越來越高[2]，其檢出濃度可以高達0.7088 μg·L-1[3]，其潛在的生態毒性效應也已經成為熱點課題。殺蟲劑類EDCs是通過攝入、累積等途徑進入生物體，通過與雌激素、雄激素和甲狀腺素等激素受體結合、與其他受體結合以及非受體途徑干擾體內激素平衡并改變內分泌系統功能[4-5]，從而對水生生物的生長發育和存活率具有顯著的不良影響。如殘留的殺蟲劑會干擾溞類的產卵行為，影響其存活率等[6]，具有內分泌干擾效應的殺蟲劑還會與生物體內的生殖系統、神經系統和免疫系統中不同的內分泌激素受體相結合導致各系統的紊亂，從而影響生物體的表面形態、行為活動、生長繁殖和存活。

水溞是一種廣泛存在的淡水浮游動物，其中小型甲殼動物大型溞(Daphniamagna)屬于枝角目，由于它具有易于培養、繁殖周期短、對環境條件敏感等特點，是被廣泛用作毒理學研究的模式生物之一[7]。在過去的20年里，大量關于殺蟲劑對大型溞慢性毒性影響的研究表明，長期暴露于殺蟲劑會導致無脊椎動物出現形態異常，生殖改變、產生雄性后代、蛻皮頻率異常和基因差異表達的現象[8]。有研究發現大型溞致死現象與殺蟲劑的神經毒性密切相關[9]，但具體的作用機制仍有待進一步揭示。目前的研究主要集中于殺蟲劑類EDCs對大型溞的急性或慢性毒性，隨著組學技術的發展，人們通過應用DNA微陣列分析和高通量測序等技術將大型溞的表型生理變化與基因表達水平聯系起來[10]，為識別生物標志物和毒性作用途徑提供依據，提供了從宏觀到微觀角度系統分析殺蟲劑類EDCs對水生溞類生態毒性的新視角。

由于殺蟲劑的作用途徑十分復雜，本文旨在根據目前的研究現狀總結歸納典型的殺蟲劑類EDCs對大型溞的毒性效應和作用機制。通過繁殖、生長、蛻皮和性別比例等典型生理參數的變化直觀反映殺蟲劑類EDCs在生理層面對大型溞生長、發育和繁殖的影響，從酶活性變化的角度分析由此造成的氧化應激和神經系統損傷，識別潛在的生物標志物，并在基因表達水平上闡明殺蟲劑類EDCs改變的通路，揭示其毒性作用的分子機制，為進行生態環境風險評估和污染物質的管理提供依據。

1 殺蟲劑類EDCs對大型溞的急性毒性效應(Acute toxic effects of pesticides EDCs on Daphnia magna)

大型溞作為生態毒理學研究的模式生物之一，通常是根據經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)準則[11]獲得的不同殺蟲劑類EDCs急性毒性研究結果。通過檢索Elsevier Science Direct全文數據庫、Springer全文數據庫、Web of Science和美國化學學會(American Chemical Society, ACS)數據庫，歸納近25年有關淡水無脊椎動物的生態毒理學參數包括：半數效應濃度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)、半數致死濃度(lethal concentration for 50%, LC50)[12]等表征參數如表1所示。

對比表1中不同EDCs的急性毒性參數發現，具有保幼激素活性的殺蟲劑和有機磷類、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的急性毒性較強，48 h-EC50大多低于10 mg·L-1，表明實際環境濃度下的殺蟲劑會對水溞和小型水生動物的健康產生威脅。其中，吡丙醚作為防治公共衛生蟲害的殺蟲劑，應用廣泛。Ginjupalli和Baldwin[36]發現吡丙醚作為保幼激素的類似物，幼齡大型溞對其非常敏感，能顯著干擾幼體的生理發育和繁殖，當大型溞暴露于25 ng·L-1吡丙醚時就開始出現發育延緩和卵子的孵化率降低現象，從而導致大型溞死亡率升高和種群密度下降。此外，當大型溞暴露于250 μg·L-1的苯氧威時，水溞胚胎的孵化率會顯著降低，在高濃度下會出現完全不孵化現象[37]。這些毒性差異可能是由于不同化學物質的化學性質和環境中的累積量所導致的。由于大部分殺蟲劑對大型溞表現出強烈的毒性作用和過量毒性，這不僅僅與疏水性有關，還與極性比表面積、極性、分子體積和氫鍵堿度有關。這些特征共同表明具有保幼激素活性的殺蟲劑與大型溞生物活性大分子之間是基于配體-受體相關的特異性作用發揮毒性的[38]。

表1 典型的殺蟲劑類內分泌干擾物(EDCs)對大型溞的急性毒性Table 1 Acute toxicity of typical pesticides endocrine disrupting chemicals (EDCs) to Daphnia magna

2 殺蟲劑類EDCs對大型溞的慢性毒性效應(Chronic toxic effects of pesticides EDCs on Daphnia magna)

EC50值是用劑量-反應曲線表示不同化學物質的急性毒性，但是由于急性毒性并不能全面反映化學物質對模式生物長時間作用的結果，因此有必要研究更具現實環境意義的慢性毒性實驗，從而揭示化學物質的慢性毒性效應。慢性毒性實驗是在急性毒性實驗的基礎上，將水生動物暴露于一系列亞致死濃度的污染物質一定時間后，通過觀察水生溞類的生長(體長)、繁殖、蛻皮、畸形率和雌雄比例等的變化研究污染物質通過多種途徑對水生生物產生的毒性效應。通過查閱大量文獻整理了目前關于模式生物的毒性效應，重點總結了慢性暴露于環境相關濃度的殺蟲劑類EDCs后對大型溞不同生理指標的影響。

2.1 殺蟲劑類EDCs對大型溞的生長和繁殖的影響

雌性大型溞新生兒的個數作為典型的生理指標之一，可以有效評估殺蟲劑類EDCs的生殖毒性。多項研究表明，雌性大型溞新生兒的個數與殺蟲劑的濃度呈負相關關系。常見的殺蟲劑對大型溞繁殖的抑制效應如表2所示。例如，Oda等[39]將大型溞暴露于0.01 μg·L-1的苯氧威21 d后，雌性大型溞新生兒的個數相較于對照組減少了約85%；當暴露于100 μg·L-1苯氧威21 d后，雌性大型溞幾乎不產生后代。Abe等[40]對苯蟲醚的研究也發現了類似的結果。這些結果表明，大型溞新生兒的個數是極其敏感的生理指標，能夠直觀地反映殺蟲劑的慢性毒性效應。此外，環境中某些低濃度的固醇類化合物可能會影響水溞的繁殖能力，如有研究發現長期暴露于低濃度的雌二醇后，大型溞的繁殖力降低了25%左右，通過檢測體內的卵黃蛋白原濃度驗證了該現象是由于內分泌系統紊亂導致的[41]。由此可見，雌性大型溞新生兒的個數可作為殺蟲劑類EDCs對大型溞生殖毒性的標志指標之一，并可以此來預測其對溞類種群水平的影響。

體長是反映大型溞生長發育速率的一個重要指標，當大型溞暴露于殺蟲劑時，其生長速率會受到顯著的抑制。有研究者將大型溞慢性暴露于0.01 μg·L-1的苯氧威時發現，其體長相較于對照開始出現顯著抑制現象；當暴露濃度達到100 μg·L-1時，其體長相較于對照組減小了1/4[44]，由此發現對體長的抑制作用隨暴露濃度的增加而增強。氟他胺和氯丹等具有內分泌干擾效應的物質對雌性水溞的生長也有影響，成蟲體長與對照相比均有所下降[18]。通過測量體長，從形態學角度反映了化學物質對溞類的毒性效應。

2.2 殺蟲劑類EDCs對大型溞發育畸形的影響

此外，慢性暴露于殺蟲劑類EDCs后也會導致大型溞發育畸形。有研究表明殺蟲劑能夠通過抑制幼蟲變形來降低其成蟲的存活率，從而起到殺滅蟲害的作用。通過整理已有的研究發現，大型溞的發育畸形主要包括彎曲或未伸展的殼棘、腫脹的育雛室、發育不良的第二觸角、復眼渾濁、流產卵和四肢發紅等現象。例如，Kim等[44]發現大型溞在苯氧威中經過21 d的慢性暴露，出現了不同程度的畸形包括彎曲或未伸展的殼棘、腫脹的育雛室和發育不良的第二觸角；當大型溞發育的胚胎暴露于3 μg·L-1的苯氧威時，50%的胚胎會發育畸形如第二觸角不完全發育，進一步表明苯氧威會引起生物體功能的紊亂從而導致發育異常。

2.3 殺蟲劑類EDCs對大型溞性別分化的影響

目前的研究證據表明，性別決定系統可以從現象上分為2組：基因型性別決定和環境性別決定[49-50]。在適宜的環境條件下，大型溞屬于孤雌生殖。但是，一旦環境條件發生變化，大型溞就會改變繁殖策略開始產生雄性后代。大型溞的性別分化主要是通過第二觸角的形態來判斷，利用顯微鏡觀察發現雄性大型溞的第二觸角較長，而雌性大型溞的第二觸角短而粗[12]，由此能夠清晰地區分大型溞的性別。

水溞的性別鑒定發生在卵沉積前1 h左右的關鍵時期[51]，在大型溞雄性后代的誘導已被證明是檢測保幼激素類似物的高度特異性終點[52]。目前已經有文獻報道保幼激素會調節昆蟲的各種生理過程，包括性腺發育、繁殖和變形等，具有誘導雄性后代產生的保幼激素。目前，具有內分泌干擾效應的殺蟲劑對水溞性別分化的顯著誘導作用已經得到了廣泛的驗證，如表3所示，這是由于大部分殺蟲劑都屬于保幼激素類似物且具有保幼激素活性導致的，但其具體的作用機理尚不清晰。例如，Abe等[40]通過研究發現苯蟲醚作為一種保幼激素類似物能夠顯著誘導大型溞的性別分化，其誘導雄性后代的最低有效濃度為4 ng·L-1，且當暴露濃度為32 ng·L-1時能產生100%的雄性新生兒，表明雄性新生兒的比例與苯蟲醚的暴露濃度呈正相關趨勢。此外，在法尼酸甲酯、苯氧威和吡丙醚作用下均能誘導大型溞產生100%的雄性后代[53]，通過評價溞類在水環境中的繁殖策略將有助于監測人類活動對水生生態環境的潛在不良影響。影響大型溞繁殖的濃度差異可能歸因于化學物質所具有的毒性和保幼激素的活性。此外，大型溞對保幼激素類似物的敏感性具有遺傳差異[54]，因此由繁殖率下降和性別比改變引起的種群生長率的差異會可能會導致大型溞種群基因結構的改變從而對種群產生有害影響。

表2 常見的殺蟲劑類內分泌干擾物對大型溞的生殖毒性Table 2 Toxicity of common pesticides endocrine disrupting chemicals to the reproduction of Daphnia magna

表3 常見的殺蟲劑類內分泌干擾物對大型溞性別分化的影響Table 3 Effect of common pesticides endocrine disrupting chemicals on sex differentiation of Daphnia magna

分類Classification殺蟲劑Pesticide暴露時間/dExposure time/d生理指標Physiological index暴露濃度/(mg·L-1)Exposure concentration /(mg·L-1)結果Results其他Others蚊蠅醚Pyriproxyfen烯蟲乙酯Hydroprene保幼醚Epofenonane烯蟲炔酯Kinoprene烯蟲酯Methoprene法尼酸甲酯Methyl farnesate苯蟲醚Diofenolan阿特拉津Atrazine6每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0.00002～0.00180～1[31]12雄性新生兒的總個數Total number of male neonates0～0.00040～44.25[36]12雌性新生兒的總個數Total number of female neonates0～0.00048.9～87.64[36]16雄性新生兒的總個數Total number of male neonates0～0.000050～50.4[36]16雌性新生兒的總個數Total number of female neonates0～0.0000524.8～102[36]18雄性新生兒的總個數Total number of male neonates0～0.000050～5.83[36]18雌性新生兒的總個數Total number of female neonates0～0.000050～55.11[36]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0.13～3.30～0.96[54]21雌性新生兒的總個數Total number of female neonates0～0.00055.2～107.4[54]21雄性新生兒的總個數Total number of male neonates0～0.00050～40.4[58]21每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0～0.00050.06～1[58]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0.2～3.50～0.99[56]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates3.4～5.40.19～0.99[54]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0.37～0.770～0.95[54]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates6.3～8.30.1～0.98[54]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates5.8～7.40～0.95[54]6每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0.00016～0.160～1[31]8每窩中雄性后代的比例Proportion of male offspring per brood0～0.180.09～0.17[47]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～6.70～0.67[56]2總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～0.70～1[40]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～0.000060～0.99[40]21總新生兒的性別比Sex ratio of total neonates0～150～0.94[43]

2.4 殺蟲劑類EDCs對大型溞蛻皮的影響

蛻皮是指生物體在生長過程中脫去舊表皮并長出新表皮的過程，受蛻皮激素控制，蛻皮激素是由P450酶對膽固醇進行酶化修飾而產生的類固醇激素，是一種普遍的生理現象[59]。大型溞為了適應體型增長需要更大的外骨骼。因此，蛻皮是大型溞發育成熟所必需的生理過程之一。未暴露的母本動物平均在6 d后進行第4次蛻皮，這標志著幼年生命階段的結束。發育時間以及21 d后的繁殖量都與成功完成蛻皮周期有關，但在一定濃度的殺蟲劑作用下大型溞會出現明顯的蛻皮困難，因此蛻皮周期可以作為評價相關毒性的指標。

目前的研究已經表明部分與類固醇相似的殺蟲劑會導致大型溞出現蛻皮延遲、蛻皮數量減少和不完全蛻皮等現象。例如，有研究表明，將大型溞短期暴露于20-羥基蛻皮激素后，與對照組比較發現大型溞的蛻皮頻率會顯著降低，可能與蛻皮液中分解酶殼二糖酶的活性有關[60]。由于一些類固醇與蛻皮激素具有相似的結構，因此硫丹與蛻皮激素受體的結合阻止了蛻皮激素與蛻皮激素受體的特異性結合，從而導致大型溞蛻皮的延遲[61]。因此，蛻皮這一生理指標可以看作是反映類固醇類殺蟲劑對甲殼動物毒性效應的典型標志物之一。

3 殺蟲劑類EDCs對大型溞的毒性作用機制(The toxic mechanism of pesticides EDCs on Daphnia magna)

3.1 殺蟲劑類EDCs對大型溞生物酶活性的影響

3.1.1 殺蟲劑對氧化應激相關酶的影響

隨著分子生物學技術的發展，已有大量研究根據基因表達水平研究污染物對大型溞的生長、繁殖等方面的影響，以識別改變的生物途徑和潛在的生物標記物。當大型溞暴露于外源化合物時，可能會在亞致死和生態相關的水平發生氧化應激，而氧化應激會導致脂質過氧化、膜功能障礙、DNA和蛋白質損傷等[62]。已有大量研究表明，殺蟲劑會改變水生動物體內抗氧化酶的活性，誘導氧化應激的產生。例如，當大型溞暴露于增塑劑雙酚F時，大型溞會通過激活抗氧化系統中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽轉移酶(GST)來平衡細胞體內的活性氧；但是，過量活性氧的產生會導致顯著的氧化損傷包括抗氧化酶失活、DNA損傷和脂質過氧化等現象。其中脂質過氧化是導致細胞功能受損的主要機制，具體表現為脂質過氧化的產物丙二醛(MDA)含量的增加，如當大型溞暴露于0.1 μg·L-1的雙酚A時，MDA的含量相較于對照組增加了10%[63]。因此，脂質過氧化和抗氧化防御系統能作為生物標志物來評價環境中雙酚類物質的毒性作用。

3.1.2 殺蟲劑類EDCs對神經系統相關酶的影響

大部分殺蟲劑對大型溞具有神經毒性作用，具體表現為乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的抑制延長了神經傳遞，甚至在高劑量暴露下出現致死現象，對大型溞的健康和生存產生了嚴重的不良影響[64-65]。大量研究表明AChE活性已經被用于檢測有機磷殺蟲劑和氨基酸甲酯類殺蟲劑對無脊椎動物如大型溞的影響[37-38,66]。乙酰膽堿(ACh)是神經系統的重要神經遞質之一，存在于神經肌肉連接處、內臟運動系統的突觸和中樞神經系統等位置，對維持水生生物的肌肉功能具有重要作用，其含量的改變會顯著影響肌肉收縮進而改變行為活動[67-68]。AChE作為水解酶，存在于神經和肌肉細胞之間的突觸間隙，能使ACh快速水解有效地中止突觸傳遞[69]。當大型溞暴露于殺蟲劑胺甲萘時，AChE活性會忽然顯著下降，但由于補償機制即AChE合成的刺激，其活性會在20 h內恢復到60%左右，由于這種恢復是有限的，AChE活性會隨著暴露時間再次顯著下降，從而導致ACh在突觸間隙內的濃度升高誘導信號轉導紊亂[69-70]。AChE活性的抑制會導致神經末梢激活紊亂、神經傳導能力喪失和生物體癱瘓等現象，進而表現為多動、協調性喪失、抽搐和癱瘓等多種行為變化最終死亡[71]。Ren等[72]的研究驗證了上述結果，當大型溞暴露于高濃度敵敵畏時，AChE活性在6 h內顯著降低并表現出游泳能力喪失直至沉入容器底部。由上述研究可知，神經系統損傷會使大型溞喪失運動和攝食能力，從而造成致命影響，這可能是大型溞死亡率上升的主要原因。此外，隨著殺蟲劑種類的日益豐富，研究人員發現新煙堿類、有機氯類、苯基吡唑類和除蟲菊酯等殺蟲劑也能顯著抑制AChE活性，并對神經系統軸突、突觸前和突觸后的靶點具有不良影響[73]。因此，AChE活性可以作為大型溞響應殺蟲劑毒性作用的生物標志物，為揭示新興殺蟲劑對大型溞等水生動物的毒性作用機制提供了參考依據。

3.2 殺蟲劑類EDCs對大型溞生物基因表達的影響

隨著分子生態毒理學領域中組學工具的廣泛應用，通過常見的DNA微陣列技術、轉錄組測序技術和定量實時PCR驗證等組學技術手段來揭示污染物及其代謝產物與核酸和酶等生物大分子之間的相互作用關系，以識別改變的生物途徑和潛在的生物標記物[74]，為表征外源物質的毒性作用模式和識別作用途徑提供基礎。有研究將大型溞暴露于甲維鹽48 h后測定了整體轉錄組的變化和蛻皮受體的結合能力，發現改變了神經內分泌調節的蛻皮、擾亂了能量穩態、抑制DNA修復和誘導程序性細胞死亡途徑與大型溞的蛻皮頻率和存活率下降有關[75]。

通過基因表達水平的變化，以驗證生理指標與特定基因功能之間的關系，并揭示其作用機理，為生態風險評估提供依據。通過總結目前的研究進展發現，基于抗氧化防御中酶活性、基因組學和轉錄組學來揭示生物體表型變化與分子作用機制之間關系的研究較為廣泛。

通過整理文獻發現，已有大量的研究表明具有保幼激素活性的殺蟲劑能在分子水平上顯著地影響大型溞，并通過相關的生物標志物將轉錄組和有害表型反應聯系起來。例如，Kim等[44]利用寡核苷酸DNA微陣列技術發現，苯氧威的暴露濃度與卵黃蛋白原基因的表達水平呈負相關關系，當苯氧威的暴露濃度為0.01 μg·L-1時，卵黃蛋白原基因的表達水平比對照組低約75%。同時，Toyota等[16]也證明了大型溞暴露于保幼激素類似物后，新生兒數量的減少歸因于卵黃蛋白原基因表達的抑制，但具體的作用機理仍不清楚。由此可見，為胚胎發育提供能量的卵黃蛋白原基因可用作評估殺蟲劑對大型溞繁殖毒性的重要生物標志物。保幼激素酯酶和保幼激素環氧化物水解酶是2種保幼激素降解酶，主要用于維持昆蟲體內正常的保幼激素滴度[76]。有研究表明當大型溞暴露于烯蟲酯、保幼醚和中、高濃度的苯氧威時，保幼激素環氧化物水解酶的表達上調，而保幼激素酯酶的表達沒有變化[77]。然而，當大型溞暴露于苯蟲醚時保幼激素酯酶的表達會顯著上調。因此可知，保幼激素降解酶對具有保幼激素活性的化學物質具有不同的選擇性[40]，能夠用作殺蟲劑暴露下潛在的生物標志物。

將水溞的整個基因組表達水平的改變用于分析殺蟲劑的作用機理，了解孤雌生殖的遺傳基礎及其對基因方面的影響。然而，關于大型溞的雄性誘導機制和性別分化的相關研究仍然較少。法尼酸甲酯是一種內源性的保幼激素，它在雄性新生兒中的含量顯著高于雌性新生兒。此外，已經有研究證明法尼酸甲酯信號的傳導可以通過不利環境刺激來確定大型溞新生兒的性別[78-79]。淡水枝角大型溞在短日照條件下會產生雄性大型溞，這是由于NMDA型離子型谷氨酸受體信號的激活促進了法尼酸甲酯的合成。當大型溞暴露于外源性法尼酸甲酯時，蛋白激酶C可能與法尼酸甲酯信號的傳導有關[80]。此外，保幼激素含量在誘導大型溞性別決定中也發揮著重要作用。Masteling等[62]研究發現當大型溞暴露于硫丹硫酸鹽、烯蟲乙酯時會以濃度依賴的方式產生雄性后代。其中，當大型溞暴露于保幼激素Ⅲ并產生雄性新生兒時，基因Dsx1和Dsx2的表達均上調，這一過程有助于黃體形成過程中的性別決定，且當雄性新生兒發育至性成熟時，基因Dsx2的表達會顯著增加[81]。由此可知，具有保幼激素活性的殺蟲劑是通過干擾內分泌系統來影響大型溞的生殖發育。但就目前的研究現狀而言，仍有許多與性別分化與生殖相關的基因是未知的，需要通過基因組學和轉錄組學研究來進一步了解。

4 展望(Prospect)

近些年，關于殺蟲劑對大型溞的毒理學研究已經取得了顯著的進展，但目前的大多數研究僅局限于殺蟲劑對水生蚤類的表型影響，關于其生態毒性效應研究仍缺乏系統性，因此，今后可在以下2個方面做進一步的研究。

首先，已開展的研究大多是針對一種污染物對水生生物的毒性效應，關于2種及2種以上不同污染物復合毒性的研究相對較少。在自然環境中，通常是多種化學物質共同存在，考慮到所研究問題的現實性，應該更加關注殺蟲劑的復合毒性。例如，有研究通過構建模型等方法研究氟苯達唑與芬苯達唑對大型溞的混合毒性，能夠更準確系統地評價污染物質對生態環境所造成的危害[82]。

其次，殺蟲劑大多是難降解的污染物質，會在自然環境中長期存在并且不斷累積，因此會對生物體產生慢性毒性。但是，部分污染物質毒性較弱，需要經過多個世代的暴露后才會對后代產生毒性作用，因此有必要對污染物進行多代研究來更準確地揭示其作用機制，應用長期和多代暴露方法來評估殺蟲劑對生態環境的風險具有重要意義。

通訊作者簡介：李琦(1974—)，女，博士，教授，主要研究方向為環境有機污染物和重金屬的污染控制及修復、水資源和水環境安全。