納米二硫化鉬促進糞腸球菌中信息素誘導質粒介導的耐藥基因接合轉移

周宏瑞，楊雨桐，楊曉波，王尚，薛斌，李辰宇，趙辰，張曦，諶志強，王景峰，邱志剛

軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050

細菌耐藥已經成為人類健康的一大威脅，具有抗生素抗性的細菌引起的感染每年導致全球約70萬人死亡，估計到2050年，每年有超過1 000萬人死亡[1]。耐藥問題之所以發展得如此迅速，主要原因之一是抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)可以通過水平轉移的方式進行傳播。水平轉移可以發生在任何環境中，特別是當細菌密度較高時，例如，在土壤、污水處理廠以及人和動物的腸道微生物群中[2-7]。水平轉移方式包括轉化、轉導和接合轉移[8]，其中接合轉移是水平轉移的主要方式[9]。

自20世紀80年代以來，由于糞腸球菌的耐藥性不斷增強，糞腸球菌菌株越來越多地與醫院獲得性感染有關[10-12]。糞腸球菌在環境中分布也十分廣泛，養殖場廢水、生活污水、自然水源、土壤、飼料和糞便中都有分布[13]，其對多種抗菌藥物具有耐藥性，也容易被誘導產生獲得性耐藥[14]。糞腸球菌間的ARGs主要通過信息素誘導的接合質粒進行轉移傳播，典型的信息素響應質粒有pCF10、pAD1、pAM373和pMG2200，其中pCF10質粒是最有代表性的一種[15]。其轉移機制是由受體菌分泌一種cCF10信息素，供體菌識別到信息素后開始啟動質粒的接合轉移過程[16]。pCF10質粒的轉移頻率可以達到10-2～10-1[17]，主要發生在可引起嚴重院內感染的腸球菌間，能夠使腸球菌獲得對被稱為最后一種抗生素的萬古霉素的耐藥性[15]。糞腸球菌耐藥性的傳播不僅給臨床中細菌感染的治療帶來巨大挑戰，也嚴重影響到生態安全。經過抗生素治療的動物的污水和糞便污染水源，可導致ARGs傳播，可以傳播到水產生物，并通過食物鏈逐級傳遞，最終影響整個生態環境[18]。

水環境是ARGs的巨大儲存庫[19]，在水環境中還會有一些納米材料[20]。已有研究表明納米材料可以促進ARGs的傳播[21]。一些新興納米材料的生物效應和生態安全性有待深入研究。納米二硫化鉬(molybdenum disulfide, MoS2)是一種新興的過渡金屬二硫化物，由1層鉬和2層硫組成，是類似石墨烯的二維材料。因其具有高的比表面積、優異的光熱轉換性能、易于功能化等優點，已在催化、傳感、載藥和疾病治療等領域得到廣泛應用[22]。隨著納米MoS2應用的增多，其在環境中的殘留水平可能增加，與其他納米粒子一樣，納米MoS2的積累對生態環境和人類健康構成了威脅。本文研究了納米MoS2對糞腸球菌中信息素誘導的耐藥質粒接合轉移的影響，并初步研究了其機制。為研究納米MoS2的生物效應及其安全應用提供理論指導。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 菌株、質粒及培養條件

本實驗中用到的糞腸球菌OG1RF[23](ATCC 47077，NCBI:txid474186)購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，信息素誘導質粒pCF10由美國明尼蘇達大學Gary Dunny教授惠贈。受體菌為糞腸球菌OG1RS，由糞腸球菌OG1RF經本實驗室誘導獲得鏈霉素抗性，并命名為OG1RS；供體菌為糞腸球菌OG1RF(pCF10)，其攜帶信息素調控質粒pCF10[24]，該質粒編碼四環素抗性基因。供體菌、受體菌均利用BHI液體培養基培養，并添加相應的抗生素(受體菌：3 000 μg·mL-1鏈霉素(S8290，Solarbio)，供體菌：10 μg·mL-1四環素(A500731，Sangon Biotech))。菌液在37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養10 h后，將菌液按1∶10的比例轉接至新鮮的BHI培養基中，置于37 ℃恒溫恒濕培養箱中4～5 h生長至對數期后備用。

1.2 接合轉移實驗

菌液在4 ℃條件下6 000 r·min-1轉速離心5 min(Eppendorf Centrifuge 5804R，Eppendorf，德國)，棄上清后用含2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)重懸菌液并洗滌3次，最后用LB液體培養基重懸菌液并調整菌液濃度至1.5×108CFU·mL-1。供、受體菌按1∶1的比例混合后加入納米MoS2懸液(NM000310，Solarbio)，使其終濃度為1、5、10、25、50、100和200 mg·L-1，并用振蕩器振蕩混勻，每組3個重復。將接合菌液放入37 ℃恒溫恒濕培養箱培養。2 h后取100 μL菌液利用含2 mmol·L-1EDTA的PBS溶液梯度稀釋，取合適稀釋梯度的10 μL菌液分別滴在含有10 μg·mL-1四環素和3 000 μg·mL-1鏈霉素的雙抗BHI瓊脂培養基上篩選接合子，含有3 000 μg·mL-1鏈霉素BHI瓊脂培養基上篩選受體菌、含有10 μg·mL-1四環素的BHI瓊脂培養基上篩選供體菌，37 ℃倒置培養36 h左右計數形成的單菌落，并計算接合頻率(接合頻率=接合子數量/受體菌數量)。

1.3 不同因素對接合轉移的影響

分別研究不同時間、不同溫度和不同pH條件下的接合轉移規律。將納米MoS2加入接合體系中，使終濃度為25 mg·L-1，在培養箱放置不同時刻然后對接合子計數，計算接合頻率；將接合體系在不同溫度下(16、26、30和37 ℃)接合2 h，計算接合頻率；用NaOH溶液和HCl溶液調節接合體系的初始pH，使pH分別為6、7和8，在37 ℃條件下接合2 h，計算接合頻率。

1.4 納米MoS2作用后活性氧水平檢測

對數生長期的菌液用PBS洗滌2次，再用液體LB培養基重懸，并稀釋至108CFU·mL-1。裝載DCFH-DA探針(CA1410，Solarbio)終濃度為2 μmol·mL-1，37 ℃放置20 min后用PBS洗掉多余探針，加入納米MoS2使終濃度為25 mg·L-1，作用2 h，用酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax M5，美國)檢測熒光強度(激發光488 nm，發射光525 nm)。

1.5 納米MoS2作用后細胞膜通透性檢測

對數生長期的菌液用PBS洗滌2次，再用液體LB培養基重懸，并稀釋至108CFU·mL-1。供、受體菌按1∶1的比例混合后加入納米MoS2懸液，使終濃度為25 mg·L-1(空白對照組加入等量雙蒸水)，作用2 h后，稀釋至107CFU·mL-1。取1 mL加入5 μL的PI染液(E607306，Sangon Biotech)，37 ℃培養箱避光放置20 min，用流式細胞儀(Cell Sorter S3e，BioRad，美國)檢測。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應定量基因表達

實驗組和對照組接合2 h后收集菌體用RNA提取試劑盒(DP430，天根)提取總RNA，再用反轉錄試劑盒(KR116-02，天根)將RNA反轉錄得到cDNA。以cDNA作為模板，用PowerUp SYBR Master Mix(A25742，Thermo)在CFX96 BioRad qPCR系統(CFX96 Optics Module，BioRad，新加坡)上進行實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)，定量基因的表達。qPCR反應體系如下：10 μL PowerUp SYBR Master Mix，7 μL ddH2O，上下游引物各1 μL，模板1 μL；qPCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min，40個循環的95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，72 ℃終止10 min，熔解曲線65 ℃升至95 ℃。qPCR中所有引物使用DNAStar 7.1設計，由上海生工合成，序列如表1所示。

實驗中基因的表達量由絕對定量的方法計算獲得，并利用16SRNA作為內參基因修正體系中的細胞含量。相關基因的標準曲線如圖1所示。

1.7 掃描電鏡觀察細菌形態

實驗組和對照組接合2 h后在4 ℃條件下6 000 r·min-1離心5 min，棄上清后加入2.5%戊二醛(PH9003，Phygene)在4 ℃條件下固定48 h，PBS離心洗滌3次，依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%無水乙醇梯度脫水，其中100%無水乙醇脫水2次。每次脫水10 min，然后6 000 r·min-1下離心3 min，最后置于冷凍干燥機(FDU-1200，EYELA，上海，中國)中凍干，用掃描電鏡(Sigma300，ZEISS，德國)觀察并用能譜儀(Xplore 30，OXFORD，英國)進行元素掃描分析。

2 結果(Results)

2.1 納米MoS2濃度對pCF10質粒接合轉移的影響

接合2 h后，空白對照組的接合頻率為3.7×10-3，與空白對照組比較，經過納米MoS2處理后接合頻率都有所提高，最高可以達到2.4×10-2。納米MoS2的作用具有濃度效應，促進效果呈現先增大再減小的趨勢，其中25 mg·L-1納米MoS2的促進效果最明顯，接合頻率可以達到空白對照組的5倍～8倍(圖2(a))。但對供、受體菌的生長無影響(圖2(b))，說明納米MoS2只影響了接合轉移過程。

2.2 納米MoS2作用時間對pCF10質粒接合轉移的影響

將納米MoS2加入接合體系中，使終濃度為25 mg·L-1，對不同時刻的接合子計數，計算接合頻率。空白對照組在4 h到達接合終點，接合頻率最高，達到1.4×10-2。納米MoS2作用后與對照組比較，1～8 h的接合頻率都有所提高，最高可以達到3.7×10-2，并且將接合終點由4 h提前到2 h。綜合來看納米MoS2在不同時刻的促進效果不同，其中2 h時促進效果最明顯，可以將接合頻率提高6倍(圖3)。

2.3 納米MoS2作用下溫度對pCF10質粒接合轉移的影響

將接合體系在不同溫度下接合2 h，計算接合頻率。對照組在16 ℃的接合頻率較低為7×10-6，26 ℃接合頻率提高到1.3×10-3，26～37 ℃溫度升高后接合頻率基本不變。納米MoS2作用后隨著溫度升高接合頻率增加，37 ℃接合頻率最高，達到4×10-3。實驗組與對照組比較，37 ℃時促進效果最顯(圖4)。

2.4 納米MoS2作用下pH對pCF10質粒接合轉移的影響

調節接合體系的pH，在37 ℃條件下接合2 h，pH=6～8范圍內，隨著pH的升高，實驗組與對照組的接合頻率都增加，分別為2.3×10-3和3.7×10-3。pH為8.0時促進效果最明顯(圖5)。

2.5 納米MoS2對細胞膜通透性的影響

質粒的接合轉移需要供體菌和受體菌細胞膜間的接觸融合，這一過程與細胞膜狀態直接相關。為了確定納米MoS2影響接合轉移的機制，對納米MoS2處理后的細胞膜通透性進行了測定。PI染液是一種細胞核染色試劑，不能通過完整的細胞膜，但可以通過破損的細胞膜對核染色。通過檢測對照組與實驗組的熒光細胞的比例，可以反映細胞膜通透性的變化。經檢測，空白對照組中熒光細胞比例為0.55%；MoS2作用2 h后熒光細胞比例為0.66%(圖6)。熒光細胞比例只發生微小變化，二者沒有統計學差異，說明納米MoS2沒有對細胞膜通透性產生明顯影響。

2.6 納米MoS2對細胞活性氧水平的影響

納米材料的小粒徑及高生物活性，可以使細菌產生羥基自由基(·OH)，進而產生活性氧(ROS)反應，利用DCFH-DA探針可以檢測細胞內活性氧水平。DCFH-DA探針進入細胞后，在活性氧存在的條件下，被氧化生成熒光物質，通過檢測對照組與實驗組的熒光強度，可以反映細胞內活性氧水平。經檢測，MoS2作用2 h后，供體菌和受體菌中熒光強度值都在800左右(圖7)，說明納米MoS2沒有對細胞活性氧水平產生明顯影響。

2.7 納米MoS2對pCF10質粒接合轉移調控基因表達的影響

納米MoS2可以促進pCF10質粒接合轉移的發生，濃度為25 mg·L-1的納米MoS2，在37 ℃、pH=8.0的條件下作用于接合體系2 h后pCF10質粒的接合轉移頻率可升高5倍～8倍。因為接合轉移過程受到一系列基因的調控，用熒光定量PCR的方法對調控基因的表達情況進行定量。ccfA和prgQ分別是編碼信息素cCF10和iCF10的基因，prgA和prgB是編碼黏附蛋白的基因，prgZ是負責信息素導入的基因，prgY是供體自誘導的調控基因。25 mg·L-1的納米MoS2作用于接合體系2 h后，與空白對照組比較，這些基因的表達都無明顯變化(圖8)，說明納米MoS2不會影響基因的表達，這是因為納米MoS2是惰性材料，有良好的生物相容性。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 qPCR實驗中基因的標準曲線注：CT值表示擴增程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數(cycle threshold)。Fig. 1 Standard curves of genes in qPCR experimentsNote: CT represents the corresponding amplification cycle threshold when the fluorescence signal of the amplification product reaches the set fluorescence threshold during the amplification process.

圖2 納米MoS2對接合轉移的影響注：(a)不同濃度納米MoS2對pCF10質粒接合轉移的影響規律；(b)納米MoS2對供體菌和受體菌的影響；MoS2表示二硫化鉬，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 2 Effect of nano-MoS2 on conjugation transferNote: (a) Effects of different concentrations of nano-MoS2 on pCF10 plasmid conjugation and transfer; (b) Effects of nano-MoS2 on donor bacteria and recipient bacteria; MoS2 stands for molybdenum disulfide, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖3 納米MoS2作用時間對pCF10質粒接合轉移的影響注：*表示P<0.05。Fig. 3 Effect of MoS2 action time on pCF10 plasmid conjugation transferNote: *represents P<0.05.

圖4 納米MoS2作用下溫度對pCF10質粒接合轉移的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 4 Effect of temperature on pCF10 plasmids conjugation transfer under nano-MoS2Note: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖5 納米MoS2作用下pH對pCF10質粒接合轉移的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Effect of pH on pCF10 plasmids conjugation transfer under nano-MoS2Note: *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖6 納米MoS2對細胞膜通透性的影響Fig. 6 Effect of nano-MoS2 on cell membrane permeability

圖7 納米MoS2對細胞活性氧水平的影響Fig. 7 Effect of nano-MoS2 on the level of reactive oxygen species in cells

2.8 納米MoS2促進細菌聚集

細菌聚集是接合轉移發生的重要前提，糞腸球菌自身的黏附蛋白可以促進細菌的黏附和聚集，但納米MoS2作用后并沒有使黏附蛋白編碼基因上調。通過掃描電鏡發現，納米MoS2加入到接合體系中會附著在細菌表面(圖9)，能譜儀元素分析的結果也顯示在團聚的細菌表面有鉬(molybdenum, Mo)元素和硫(sulfur, S)元素分布(圖10)。因為納米MoS2本身具有吸附性能，而且MoS2是片層狀的結構，不容易進入細胞內部，這使得納米MoS2會吸附在細菌表面。與空白對照組比較，表面吸附了納米MoS2的細菌會變得更加聚集(圖9)，進而促進了接合轉移的發生，使接合頻率提高。

圖8 納米MoS2對質粒接合轉移調控基因表達的影響注：(a) 納米MoS2對編碼cCF10信息素的ccfA基因的影響；(b) 納米MoS2對編碼iCF10信息素的prgQ基因的影響；(c) 納米MoS2對編碼黏附蛋白的prgA基因的影響；(d) 納米MoS2對編碼黏附蛋白的prgB基因的影響；(e) 納米MoS2對供體自誘導調控基因prgY的影響；(f) 納米MoS2對負責信息素導入的prgZ基因的影響。Fig. 8 Effect of nano-MoS2 on gene expression of plasmid conjugation transferNote: (a) Effect of nano-MoS2 on ccfA gene encoding cCF10 pheromone; (b) Effect of nano-MoS2 on prgQ gene encoding iCF10 pheromone; (c) Effect of nano-MoS2 on prgA gene encoding adhesive protein; (d) Effect of nano-MoS2 on prgB gene encoding adhesive protein; (e) Effect of nano-MoS2 on donor self-induced regulatory gene prgY; (f) Effect of nano-MoS2 on prgZ gene responsible for pheromone import.

3 討論(Discussion)

糞腸球菌是一種通常生活在人類和其他動物胃腸道中的細菌，也會作為益生菌添加到飼料中[25]。由于糞便污染和飼料浪費，最終會導致環境中糞腸球菌的數量增加。同時革蘭氏陽性菌中的腸球菌、鏈球菌和葡萄球菌是引起醫院感染最常見的病原體，在公共衛生方面需要特別關注致病性革蘭氏陽性菌中耐藥性的傳播。例如萬古霉素的耐藥性，這在腸球菌中很常見，雖然腸球菌感染一般不會危及生命，但萬古霉素耐藥基因一旦傳播給金黃色葡萄球菌等細菌就會導致致命疾病[26]。臨床上腸球菌已成為引起醫院感染的第二大致病菌[27]，并可以通過接合轉移的方式傳播ARGs[16]，使其對人類健康和環境安全的風險日益增加。然而，目前人們往往關注于革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌中耐藥基因的接合轉移研究，而忽視了革蘭氏陽性菌中耐藥基因的接合轉移。因此本研究中建立了革蘭氏陽性菌糞腸球菌中pCF10質粒介導的耐藥基因接合轉移模型。

圖10 納米MoS2附著在細菌表面 注：(a) SEM圖像；(b) Mo元素分布；(c) S元素分布；Mo表示鉬元素，S表示硫元素。Fig. 10 Nano-MoS2 attached to the surface of bacteria Note: (a) SEM images; (b) Distribution of Mo element; (c) Distribution of S element; Mo stands for molybdenum element, and S stands for sulfur element.

pCF10質粒是信息素誘導質粒，接合轉移過程受到信息素的調節[16]，對編碼信息素的ccfA和prgQ基因，以及與信息素相關的prgY和prgZ基因的表達進行定量分析，發現納米MoS2并沒有對這些基因的表達產生影響，說明納米MoS2沒有影響信息素的產生和轉運。另外黏附蛋白在pCF10質粒的接合轉移過程中也發揮重要作用，它使供體菌與受體菌可以緊密地結合在一起。對編碼黏附蛋白的prgA和prgB基因的表達進行定量分析，發現納米MoS2同樣沒有對這些基因的表達產生影響。

一些納米材料會通過影響活性氧系統和改變細胞膜的通透性影響質粒的接合轉移。例如納米氧化鋁可以使革蘭氏陰性菌中羥基自由基的生成增加，同時細菌的總抗氧化能力、過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽還原酶活性也隨著納米氧化鋁水平的升高而升高。另外還會破化細胞膜結構并進入細菌細胞[21]。對本實驗中納米MoS2作用后糞腸球菌的活性氧水平和細胞膜的通透性進行了測定，發現納米MoS2對活性氧系統和細胞膜的通透性均沒有影響，這一結果與基因表達的結果一致。這可能是由于糞腸球菌是革蘭氏陽性菌，細胞壁較厚，納米材料不易進入細菌細胞，另外納米MoS2是片層狀的二維結構，比納米顆粒更難進入細胞；納米MoS2還具有良好的生物相容性，這些性狀使得納米MoS2不會影響細菌生長和細菌結構，因此分子水平和細胞膜水平沒有發生變化。

掃描電鏡和能譜分析結果表明，納米MoS2會黏附在細菌表面，促進細菌聚集，為細菌之間的接合轉移提供良好的條件，最終導致接合轉移頻率增加。也有報道稱在轉化過程中細菌的黏附和運動會使細菌攝入外界DNA[28]，接合過程也是受體菌獲取受體菌之外的DNA，而且接合過程需要供體菌與受體菌接觸，然后通過Ⅳ型分泌系統將供體中的質粒傳遞給受體[29]，所以細菌的聚集為接合轉移的發生提供了很好的環境。納米MoS2正是因為促進了細菌聚集才導致接合轉移頻率增加。

作為一種類石墨烯材料，MoS2的規模化生產和市場化發展迅速[30]。可能會有大量的MoS2從實驗室中排出，此外，清潔產品和潤滑劑的應用會將數以噸計的納米MoS2釋放到環境中[31]，MoS2在環境中的釋放將對生物體和人類健康構成潛在風險[32]。雖然納米MoS2具有良好的生物相容性，但是較高的濃度會對生物體表現出顯著的毒性。目前關于納米MoS2的環境殘留濃度還未見報道，有一些關于納米MoS2生物毒性的研究發現：50 mg·L-1的MoS2對A549細胞活力的抑制率為25.6%[33]；>25 mg·L-1的MoS2納米片通過干擾細胞表面受體和mTOR途徑誘導LC3-GFP U87細胞自噬[34]；飼料中150 mg·kg-1MoS2可引起腸道炎癥，擾亂小鼠腸道氨基酸代謝和腸道微生物群落[31]。本研究通過研究納米MoS2對糞腸球菌中接合轉移的影響，進一步完善了納米MoS2的生態環境風險評價，為納米MoS2的應用提供了更豐富的理論指導。

通訊作者簡介：邱志剛(1979—)，男，博士，研究員，主要研究方向為納米材料生物安全性及細菌耐藥基因。