混合物毒性評價模型的選擇優(yōu)化

孫茹茹，王娜,*，馬曉妍，張歡樂，張靖坤

1. 西安科技大學建筑與土木工程學院，西安 710054 2. 西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院，西安 710055

隨著大量的工業(yè)廢水和生活污水排放到江河等地表水體之中，水中化學物質(zhì)的數(shù)目越來越多，進而導致地表水受到嚴重的污染。受污染的地表水體與人類的生活緊密相關，給人類和生態(tài)健康帶來極大的危害。大量研究表明，混合物對水體中各級生物體的聯(lián)合毒性往往大于單一物質(zhì)的毒性之和[1-2]。由于模型評價的差異性，同一組混合物可能得到截然不同的聯(lián)合作用結(jié)論[3-5]。因此要正確評價及預測混合物的聯(lián)合毒性，選擇合適的模型非常重要。目前，化學混合物毒性研究中最流行的加和參考模型是濃度加和模型(concentration addition model, CA)[6]和獨立作用模型(independent action model, IA)[7-8]。對于同一物質(zhì)中2個濃度組合成的虛擬混合物，CA模型雖然能合理解釋，但以物質(zhì)濃度與毒性之間具有線性關系為依據(jù)[9-10]。已有大量的研究表明，物質(zhì)的濃度和其毒性效應具有非線性關系[11-12]，因此對CA模型的使用要謹慎。IA模型雖然不是依據(jù)物質(zhì)濃度與毒性之間的線性關系，但僅僅依據(jù)概率與統(tǒng)計學原理，缺乏物理、化學和生物學的意義[9-10]。因此，迫切需要一種更簡單、更科學的模型作為混合物聯(lián)合毒性評價的補充。Gao等[13]建立的理論非線性聯(lián)合毒性評價模型(the theoretical non-linear combined toxicity assessment model, TNL)在評價重金屬二元混合物的聯(lián)合作用上有很好的可靠性。課題組前期采用毒性效應來衡量毒性的大小，該方法在原理上與TNL模型一致，通過評價不同類型的二元混合物發(fā)現(xiàn)，在劑量效應曲線范圍內(nèi)，該模型能滿足各種類型物質(zhì)的聯(lián)合作用評價，并可將應用范圍擴展到多元混合物[14]。

重金屬具有持久性、毒性和生物累積性，對水體生態(tài)系統(tǒng)和人類健康具有重大的威脅[15]，本研究選擇常見的重金屬鎘。表面活性劑在水體中會起泡，隔絕空氣與水，抑制水體復氧，高濃度的表面活性劑亦會對生物降解功能產(chǎn)生抑制[16]。本研究選擇最常見的直鏈烷基苯磺酸表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate, SDS)。農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)必不可少的一部分。生長型除草劑百草敵(dicamba, DIC)是世界上應用最廣泛的農(nóng)藥之一[17]，它具有潛在的基因毒性已被多種體內(nèi)、體外生物毒性評價證明[18-19]。廣譜抗生素鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride, TC)是一種便宜的獸用抗生素和飼料添加劑，其在水和食物中常被檢測到，對水生有機物具有抑制生長、發(fā)育的毒性[20]，影響人類的腸道菌群及增強耐藥性基因[21]。具有耐藥基因的生物體引起的感染越來越多，多肽類抗生素多粘菌素B(polymyxin B sulfate, PLB)作為人類應對感染的最后一招，常在臨床醫(yī)學中用到[22]。鹽酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride, DPH)臨床上常被用來治療各種過敏癥狀、蕁麻疹、失眠，天然水體、污水廠二級出水、土壤、魚類體內(nèi)均檢測到它的存在，對人類的健康和水體生物帶來負面影響[23]。隨著離子液體應用的普及，文獻中關于它們的生物毒性和環(huán)境危害性的報道越來越多[24-25]，離子液體1-十二烷基-3-甲基咪唑氯鹽(1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride, IL)被選擇用于本研究。

綜上，本研究選擇5類環(huán)境中常見的7種有毒物質(zhì)，采用等毒性溶液法[26]設計二元混合物。利用應用微板毒性分析法(microplate toxicity analysis, MTA)[27]測定了上述物質(zhì)對費氏弧菌(Vibriofischeri)的一元及二元急性生物毒性。通過分析3種模型的評價結(jié)果，進一步優(yōu)化混合物聯(lián)合毒性評價中模型的選擇。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器、試劑與樣品

Centrol IApc LB962微孔板式發(fā)光檢測儀(德國Berthold Technologies公司)，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司，中國)，國華BS-1EA型恒溫震蕩培養(yǎng)箱(中國)，12通道移液槍(德國Eppendorf公司)；費氏弧菌(V.fischeri)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；CdCl2·2.5H2O(分析純)、鹽酸苯海拉明(DPH, >98%)購自Sigma-Aldrich(中國上海)；鹽酸四環(huán)素(TC, >98.0%)、十二烷基硫酸鈉(SDS, >97.0%)購自TCI(日本)；敵百草(DIC，標準品)購自DR(德國)；1-十二烷基-3-甲基咪唑氯鹽(IL, 99%)購自安耐吉(中國)；多粘菌素B硫酸鹽(PLB, 95%)購自TRC(加拿大)。用超純水配制標準物質(zhì)母液并儲存于4 ℃冰箱備用，表面活性劑藥品提前配制并使用超聲波儀器混合均勻，避免起泡影響實驗結(jié)果。物質(zhì)基本信息如表1所示。

1.2 二元毒性實驗設計

等毒性溶液法(equal toxic solution method, ETS)是一種混合物設計方法，將不同物質(zhì)按照毒性比1∶1混合，根據(jù)預實驗結(jié)果選擇合適的稀釋因子，使二元混合物抑制率在EC5至EC90之間均勻分布。該方法具有簡單、快速、可視化的優(yōu)點，常用于研究二元混合物的聯(lián)合毒性作用[26]。

1.3 生物毒性測定方法

V.fischeri和毒性試驗方法按照課題組前期發(fā)表的文獻所述進行[28-29]。為保證V.fischeri測試菌懸液狀態(tài)相同，V.fischeri生長至菌密度(OD575)為1.2左右取出備用，重復實驗3次，保證3次測試結(jié)果誤差不超過10%。測試樣品對V.fischeri的急性毒性用相對發(fā)光抑制率表示，如式(1)所示。

(1)

式中：I為測試樣品的發(fā)光抑制率(%)；R0、R分別為空白樣品的發(fā)光強度平均值與測試樣品的發(fā)光強度平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析方法

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

通過Origin Pro 8.5(OriginLab, North-ampton, MA, USA)軟件，采用非線性最小二乘法(non- linear least square, NLLS)法對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)學擬合，以獲得每個單一化學品和二元混合物的劑量效應曲線(concentration response curves, CRCs)。由于所有的數(shù)據(jù)集都與Hill函數(shù)很好地吻合，Hill方程作為CRCs的數(shù)學表達式，如式(2)所示。

I=a×Cm/(bm+Cm)

(2)

式中：I為物質(zhì)對發(fā)光細菌的相對抑制率(%)；C為物質(zhì)濃度(mg·L-1)；a為極限濃度對應的效應(%)；b為a/2效應對應的濃度(mg·L-1)；m為表示斜率的參數(shù)(量綱為1)。

1.4.2 混合物分析模型

(1)CA模型

CA模型常常被用來預測具有相同或相似作用機制的毒性物質(zhì)的混合物[30]。其數(shù)學表達式如式(3)所示。

(3)

式中：n為多元混合物的組分數(shù)；ECx,i為第i個組分單一存在時，引起x%效應的濃度；ci為混合物中第i個組分的濃度。

(2)IA模型

IA模型是基于化合物組分具有相異的作用原理對其毒性進行預測和評估[31]。數(shù)學上IA表達式如式(4)所示。

(4)

式中：n為多元混合物的組分數(shù)；ci為混合物中第i個組分的濃度；cmix為混合物的總濃度；E(cmix)為混合物的總效應；E(ci)為表示第i個組分獨立存在且其濃度為ci時產(chǎn)生的效應。

(3)TNL模型[13]

TNL模型以理論抑制率與實測抑制率差異確定混合物的聯(lián)合作用強度。具體原理如圖1所示。

圖1 理論非線性聯(lián)合毒性評價方法圖解Fig. 1 Diagram of theoretical non-linear combined toxicity assessment method

TNL模型可實現(xiàn)對各種類型的混合物聯(lián)合作用的評價，同時也可實現(xiàn)對成分和濃度未知的天然污水構(gòu)成混合物聯(lián)合作用的評價[14]，原理上TNL可以解釋為：物質(zhì)A與物質(zhì)B分別在C1、C3濃度時可以達到抑制率x(x%≤50%)，在C2、C4濃度時可以達到抑制率2x(x%≤100%)。當二者混合，利用物質(zhì)A的C1濃度代替物質(zhì)B的C3濃度，使混合物濃度變?yōu)?C4-C3+C1)，如果抑制率依舊為2x，則說明二者作用是加和的。如果小于2x，則說明物質(zhì)A與物質(zhì)B發(fā)生拮抗作用；若大于2x，則說明物質(zhì)A與物質(zhì)B發(fā)生協(xié)同作用。

2 結(jié)果(Results)

2.1 7種化學物質(zhì)對V. fischeri的毒性

測定了7種化學物質(zhì)對V.fischeri的單一毒性，其CRCs如圖2所示。

由圖2可知，單一物質(zhì)對V.fischeri的CRCs呈現(xiàn)單調(diào)非線性趨勢，隨著物質(zhì)濃度的增加，抑制率也隨之增大。根據(jù)擬合結(jié)果來看，所有CRCs的修正的相關系數(shù)平方(Adj.R2)高于0.98，簡化卡方檢驗(Red.Chi-S)低于15，表示所有CRCs均能很好地被Hill函數(shù)擬合。以EC50來評價物質(zhì)毒性的大小，7種化學物質(zhì)的毒性順序為：IL>Cd2+>PLB>SDS>DIC≈TC>DPH。毒性最強的化學物質(zhì)是IL，毒性最小的化學物質(zhì)是DPH。在2種抗生素中，PLB生物毒性比TC高出27.3倍，該結(jié)果和PLB作為應對細菌最后一招的殺菌劑相一致。參數(shù)m值一定程度上反映了曲線的走勢，從擬合方程參數(shù)來看，7種物質(zhì)的CRCs差異較大，7種化學物質(zhì)的m值順序為：Cd2+>TC>IL>DIC>PLB>DPH>SDS。m越大，曲線中間段越陡峭，例如：Cd2+、DIC、IL、TC，m值在3.6～6.7之間變化。m值越接近1，曲線中間段越平緩，例如：SDS、DPH和PLB。

圖2 7種化學物質(zhì)對V. fischeri毒性的劑量效應曲線注：IL表示1-十二烷基-3-甲基咪唑氯鹽；PLB表示多粘菌素B硫酸鹽；DIC表示敵百草；TC表示鹽酸四環(huán)素；SDS表示十二烷基硫酸鈉；DPH鹽酸苯海拉明。Fig. 2 The concentration-response curves of seven chemicals on V. fischeriNote: IL stands for 1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride; PLB stands for polymyxin B sulfate; DIC stands for dicamba; TC stands for tetracycline hydrochloride; SDS stands for sodium lauryl sulfate; DPH stands for diphenhydramine hydrochloride.

2.2 二元混合物對V. fischeri的毒性

根據(jù)1.2節(jié)方法將7種化學物質(zhì)混合，用微孔板法測定了21組等毒性混合物對V.fischeri的急性毒性。二元混合物的CRCs均可用Hill方程較好地擬合。二元混合物的急性毒性擬合信息如表2所示，包括混合物濃度比、擬合參數(shù)、Adj.R2和Red.Chi-S。

由表2可知，所有的Adj.R2值都>0.98，Red.Chi-S值<9，說明Hill函數(shù)也能很好地擬合二元混合物。根據(jù)實驗結(jié)果來看，21種二元混合體系對V.fischeri表現(xiàn)出了不同的抑制作用，其中毒性最強的混合物是IL+PLB，毒性最小的混合物是Cd2++DPH。

表2 二元混合物擬合函數(shù)的統(tǒng)計參數(shù)Table 2 The statistic parameters of the binary mixtures fitting function

2.3 聯(lián)合毒性作用類型分析

利用CA、IA和TNL模型對21種二元混合物進行聯(lián)合毒性分析，通過比較二元混合物的實測的CRCs與IA模型預測的劑量效應曲線(IA-CRCs)、CA模型預測的劑量效應曲線(CA-CRCs)和TNL模型預測的劑量效應曲線(TNL-CRCs)的偏差，確定二元混合物的毒性聯(lián)合作用，二元混合物整個濃度區(qū)間的聯(lián)合作用分析如圖3所示。

由圖3可知，21組二元混合物的毒性評價，有14組實測CRCs與IA-CRCs、CA-CRCs、TNL-CRCs發(fā)生較大偏離，說明這些混合物產(chǎn)生了較強的相互作用(拮抗或協(xié)同)，占總數(shù)的67%。這一結(jié)果進一步驗證了課題組前期的研究結(jié)果，CRCs形狀差異較大的2種物質(zhì)組成的混合物易產(chǎn)生相互作用[32]。CA、IA和TNL這3種模型對二元混合物聯(lián)合作用評價結(jié)果不盡相同。按照IA-CRCs、CA-CRCs和TNL-CRCs在整個濃度區(qū)間的偏離程度，11組混合物，IA和TNL模型的評價結(jié)果更接近，例如Cd2++DPH、DIC+TC和SDS+PLB等，圖中以A類型標注；6組混合物，CA和TNL模型的評價結(jié)果更接近，例如Cd2++SDS、DPH+DIC和TC+IL等，圖中以B類型標注；3組混合物，CA和IA模型的評價結(jié)果更接近，例如，DPH+SDS、DIC+IL和TC+PLB，圖中以C類型標注，在高濃度區(qū)域，CA和IA模型對組合DIC+IL的評價差異增大。該現(xiàn)象在宋曉青等[33]和王滔等[34]的研究中也被發(fā)現(xiàn)。有1組混合物(DPH+TC)，CA和、IA、TNL這3個模型的評價結(jié)果均接近，圖中以D類型標注。通過比較A、B和C類型混合物各組分擬合曲線的參數(shù)m發(fā)現(xiàn)：A、B類型混合物，m值差異大，例如混合物Cd2++SDS的m值差異百分比為83.6%；混合物TC+SDS的m值差異百分比為76.6%；C類型混合物，m值差異小，例如混合物DPH+SDS的m值差異百分比為15.4%；混合物DIC+IL的m值差異百分比為5.3%。

3 討論(Discussion)

CA模型存在某些預測盲區(qū)，應用CA模型預測某個效應的混合物總濃度，就必須保證混合物中的各個組分單獨存在時有此效應濃度[6]。例如，由于組分PLB最高抑制率只能在65%左右，在高濃度區(qū)域沒有相應抑制率，Cd2++PLB、DIC+PLB和TC+PLB 3組混合物中CA模型并不能準確評價其高濃度混合物毒性。IA模型雖然不存在預測盲區(qū)，但是，IA模型是一個純粹的理論構(gòu)想：混合物中的所有組分通過不同的毒性作用模式和機制相互獨立地作用于靶點。實際上，在有機體內(nèi)任何復雜的、相互依賴的生理途徑中，這種情況是否會發(fā)生是有疑問的。此外，由于IA假設兩者的作用機制是完全不同的，那么在混合物中，任何涉及的成分有多個或非特定的機制就不能完全遵循IA模型[35]，而IA模型對混合物毒性評價結(jié)果也在高濃度區(qū)域的差別逐漸增大[36]。對于TNL模型無法解釋的由同一種物質(zhì)組成的“虛擬組合”，IA模型同樣不適用，例如物質(zhì)十二烷基硫酸鈉(SDBS)，其EC10對應濃度為34.9 mg·L-1，EC30對應濃度為44.6 mg·L-1，根據(jù)IA模型預測混合物效應為37%，但實測效應為98%，相差61%。在環(huán)境毒理學中，協(xié)同作用被認為是2種或2種以上環(huán)境化學品同時作用于機體所產(chǎn)生的生物學作用的強度遠遠超過各化學品單獨作用強度的總和，而拮抗作用指2種環(huán)境化學品同時作用于機體時，其中一種化學品可干擾另一種化學品的生物學作用，或2種化學品相互干擾，使混合物的毒作用強度低于各自單獨作用的強度之和[37-39]。TNL模型以二元混合物各組分的濃度和為自變量，以混合物的理論抑制率(各組分單獨存在時對應抑制率之和)為因變量，用理論抑制率與實測抑制率差異確定混合物的聯(lián)合作用強度，符合毒理學關于聯(lián)合作用的定義。Gao等[13]也從銅綠微囊藻體內(nèi)氧化酶的活性，活性氧、丙二醛濃度等角度證明了TNL對混合物聯(lián)合毒性評價結(jié)果的正確性。在實驗結(jié)果中，52%的組合TNL模型評價的結(jié)果與IA模型評價的結(jié)果更接近，24%的組合TNL模型評價的結(jié)果與CA模型評價的結(jié)果更接近。

CA、IA各自存在一定的不足之處，TNL模型可以作為補充模型，將CA、IA模型共同應用于混合物聯(lián)合作用評價。TNL模型的應用對象是不同物質(zhì)組成的混合物，不適用于“虛擬組合”。因此，當曲線形狀差異小時，CA模型評價結(jié)果與IA模型相近。由于CA模型相對保守[6, 35]，更適合混合物的毒性預測和生態(tài)環(huán)境的風險評估[40]，因此選用CA模型進行評價。若CA模型出現(xiàn)預測盲點時，直接選用IA模型；當曲線形狀差異大時，根據(jù)毒理學對聯(lián)合作用的定義，直接使用TNL模型來評價混合物的作用方式。

通訊作者簡介：王娜(1981—)，女，博士，講師，主要研究方向為生態(tài)毒理學。