長江口及其鄰近海域表層沉積物中有機污染物復合毒性與多環芳烴毒性貢獻

楚蘭蘭，解滿俊，王茜,*，李娟英

1. 上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306 2. 上海海濱污水處理有限公司，上海 201302

長江口是我國重要的三大河口之一。近年來由于人口增多，工農業迅速發展，大量的有機污染物，通過直接排放、雨水沖刷以及大氣沉降進入水體，并由于其低溶解性和疏水性，富集在沉積物中。沉積物中這些有機污染物并不是單一存在的，而是以混合物的形式存在，污染物之間又可能存在相互作用，產生相加或協同等復合效應，對人類和底棲生物造成的危害可能遠大于單一污染物。多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類環境中普遍存在的持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)，對人體具有“三致”效應(致癌、致畸和致突變)[1-2]，美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)于1976年將16種PAHs列為優先控制污染物。PAHs通過工業廢水排放、海上運輸以及石油泄漏等途徑進入長江口及其相鄰水域，并富集在沉積物[3-4]。然而，PAHs及其他未知污染物在復合污染中對生物的毒性作用貢獻仍不明確。2019年長江流域全面實施“長江大保護”戰略，長江經濟帶11省市強力推進長江生態系統保護修復。因此，明確表層沉積物中復合污染的生物毒性作用，評估PAHs的毒性貢獻，并確定長江流域污染物削減控制重點，了解污染物濃度、風險和毒性的變化，對確定區域特征污染物變化，進一步有針對性地制定污染控制策略有重要意義。

由于有機化合物以混合物的形式存在，很難根據它們各自的濃度來評估沉積物中有機污染物的危害。此外，可能還存在一些由于方法或技術限制而未被檢測到的污染物。因此，Escher等[5-6]建立了Iceberg模型，該模型基于生物分析當量濃度(BEQ)，利用細胞毒性實驗，綜合評估環境樣品中已檢測到的或未檢測到的化學物質對復合毒性效應的貢獻程度。它可以評估沉積物中有機污染物的潛在危害，并廣泛應用于地表水[7]、沉積物[8]和廢水樣品[9-11]中有機污染物的毒性貢獻評估。通過比較生物分析的BEQ值(BEQbio)和化學分析的BEQ值(BEQchem)，確定已檢測到或未檢測到的化學物質對混合物毒性效應的貢獻程度[7]，從而明確環境介質中的特征污染。

目前，對長江口沉積物中有機污染物的研究，主要集中在對其組成、分布及來源的分析[3-4,12-15]，而對其復合毒性以及各個組分貢獻程度的研究卻尚未有報道。因此，本研究在長江口近海海域采集表層沉積物樣品，運用氣相色譜-質譜聯用儀測定長江口沉積物中16種PAHs的濃度。在此基礎上，分析其時空分布特征、發光細菌毒性當量以及PAHs毒性貢獻，并就其環境風險進行評估，以期為控制和削減該區域PAHs的污染提供理論基礎及科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：冷凍干燥機(FreeZone 6，美國LABCONCO公司)、電子天平(ML104T/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，中國)、微波消解儀(CEM MARS CLASSIC，美國CEM公司)、氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 8890A/5975C，安捷倫科技(中國)有限公司)、干式氮吹儀(QYN100-2，上海巧躍電子有限公司，中國)、渦旋振蕩器(H-101，上海康禾光電儀器公司，中國)、立式高壓滅菌器(LDZX-30KPS，上海申安醫療器械廠，中國)、馬弗爐(KSL-1200X-H，合肥科晶材料技術有限公司，中國)、電熱鼓風干燥箱(DHG-9070A，上海一恒科學儀器有限公司，中國)、低速大容量多管離心機(LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠，中國)、超聲波清洗器(KQ3200DB，昆山市超聲儀器有限公司，中國)、多功能微量移液器(Transferpette?S-12 Dig. 30～300 μL，普蘭德(上海)貿易有限公司，中國)、純水機(Milli-Q?Express 40，默克化工技術(上海)有限公司，中國)、醫用低溫保存箱(DW-86L578J，成都壹科醫療器械有限公司，中國)。

試劑：正己烷、丙酮(色譜純，默克化工技術(上海)有限公司，中國)；二氯甲烷(色譜純，上海阿達瑪斯試劑有限公司，中國)；層析硅膠(60～100目，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)置于馬弗爐中650 ℃下灼燒4 h，冷卻后轉移至干燥器中待用；0.7 μm玻璃纖維濾膜(GF/F，英國Whatman公司)；銅片(高純試劑，5N，國藥集團化學試劑有限公司，中國)；高純氮氣(99.99%，上海利旦工業氣體有限公司，中國)；氯化鈉(NaCl，分析純，上海柯靈斯試劑有限公司，中國)；六水氯化鎂(MgCl2·6H2O，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)；氯化鉀(KCl，分析純，99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)；3-N-嗎啉丙烷磺酸(MOPS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)；氫氧化鈉(NaOH，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)；鹽酸(HCl，優級純，上海柯靈斯試劑有限公司，中國)；二甲基亞砜(DMSO，純度>99.5%，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，中國)；費氏弧菌凍干粉(北京海富達科技有限公司，中國)；16種多環芳烴混合標準溶液(濃度為2 000 μg·mL-1，BePure)購自Sigma-Aldrich公司(NIST1647F)，于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 樣品采集

于2019年和2020年12月對長江口海域沉積物進行了2次調查采集(圖1)。其中2019年航次共調查采集17個站點(S1～S17)，2020年航次共調查7個站點(L1～L7)。利用彼得森抓斗式采泥器(DXCN1/40，廈門登迅儀器設備有限公司)采集表層6 cm以上的沉積物，將其置于干凈的鋁箔袋中密封。置于加入冰袋的保溫箱中，運回實驗室后于-20 ℃冰箱保存。

圖1 2019—2020年長江口采樣點圖Fig. 1 Map of sampling points in the Yangtze Estuary from 2019 to 2020

1.3 樣品萃取

將沉積物樣品冷凍干燥，用研缽研磨，過100目篩并存放于鋁箔袋中，避光儲藏待測。

1.3.1 沉積物中PAHs的萃取

稱取3 g凍干并過篩的沉積物樣品，用濾紙包好置于微波萃取管中，加入15 mL二氯甲烷，萃取完成后，將萃取溶液轉移至10 mL玻璃離心管內，再用5 mL二氯甲烷溶液洗滌萃取管2次，轉移至玻璃離心管內。再將2次萃取液濃縮并合并。每個離心管中加入1片銅片，濃縮至2 mL左右過濾。用硅膠柱凈化上述溶液，二氯甲烷洗脫(10 mL)，最后用氮氣吹至近干，正己烷定容至0.5 mL，待測。

1.3.2 沉積物復合污染物的萃取

稱取3 g凍干并過篩的沉積物樣品，用濾紙包好置于微波萃取管中，加入10 mL二氯甲烷，萃取完成后，將萃取液轉移至30 mL玻璃離心管內；再向微波萃取管中加入10 mL丙酮∶正己烷(V∶V=1∶1)混合液，萃取完成后，將萃取液轉移至的玻璃離心管內，用5 mL丙酮∶正己烷(V∶V=1∶1)混合液洗滌萃取管2次，轉移至玻璃離心管內。然后以3 000 r·min-1離心10 min；離心結束后，用0.7 μm玻璃纖維過濾器過濾并濃縮至2 mL左右合并，再氮吹至近干，用丙酮∶正己烷(V∶V=1∶1)混合液定容至1 mL，待用。

1.4 化學分析

采用安捷倫公司氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 8890A/5975C)對樣品中16種優先控制PAHs單體進行定量測定。色譜柱為HP-5-MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速為1 mL·min-1，進樣口溫度260 ℃，進樣量1 μL，進樣方式不分流；柱溫：70 ℃保持1 min，然后以10 ℃·min-1的速率升至160 ℃ ，再以5 ℃·min-1的速率升至280 ℃，保持5 min，最后以20 ℃·min-1的速率升至280 ℃，保持5 min。質譜條件：離子源類型為EI；離子源溫度為280 ℃；溶劑延遲為5 min；掃描方式為選擇離子；掃描類型為MS2全掃，MSM保持5 min，MS1 SIM保持36.5 min；掃描時間為107 ms。

1.5 生物分析

采用美國伯騰公司Synergy H1多功能微孔板檢測儀對底泥樣品總體毒性進行定量測定。向1 L純水中加入0.3 g KCl、2.035 g MgCl2·6H2O、0.3 g MOPS、20 g NaCl和0.2 g NaOH配制緩沖液，將pH調節至7.0±0.2，高溫滅菌后儲存備用。取200 μL沉積物提取液轉移到棕色小瓶中氮吹至干，將殘留物重新溶解在DMSO中，并轉移到緩沖液中。在透明96孔板中進行梯度稀釋后，將100 μL緩沖液中的樣品加入到白色96孔板中的50 μL的費氏弧菌(Vibriofischeri)菌液中。在加入樣品之前和培養30 min后，測量細菌的發光度。

1.6 數據評估

按照ISO標準方法11348-3[16]和Escher等[17]計算生物發光抑制率的方法，用公式(1)計算效應中值濃度(EC50)，其中s為濃度-效應曲線的斜率[18]。每種化學品的EC50值以mol·L-1為單位，而環境樣品的效應濃度(EC)用相對富集因子(REF)表示[19-20]。樣品REF(公式(2))是生物測定法(公式(3))的稀釋因子與樣品富集因子(公式(4))的乘積。沉積物提取物(kgsed, dw的富集因子為以提取物最終體積提取的沉積物質量，并根據公式(4)計算。每種生物測定的稀釋因子均使用公式(3)計算[21-22]。

(1)

REF=稀釋因子生物測定× 富集因子沉積物

(2)

(3)

(4)

樣品中化合物i的相對效應效價(REPi)用于計算不同化學物質之間的相互作用以及預測已知化學混合物的混合作用，由公式(5)獲得。其中，EC50(參照化合物)指的是參照化合物效應濃度，EC50(i)指的是化合物i的效應濃度[6-7,11,23]。其中，本文中所用的參照化合物為苯酚溶液，化合物i為多環芳烴各單體，其EC50來自于相關參考文獻[24]。

(5)

發光細菌毒性測試得到的生物分析當量BEQ值(BEQbio)，可以由參照化合物的EC50除以樣品的EC50計算得到(公式(6))[6-7,11,23]。

(6)

化學分析得到的化學分析當量BEQ值(BEQchem)可以計算為REPi與所有被測化合物i的濃度(Ci)的乘積之和(公式(7))[5-6,11,25]。

(7)

將BEQbio和BEQchem進行比較，確定檢測到的化學物質對混合物效應的貢獻程度(公式(8))[5, 10]。

(8)

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 長江口表層沉積物中PAHs的時空分布及環境風險

2019年和2020年長江口表層沉積物中16種PAHs的總濃度(ΣPAHs)的時空分布如圖2所示。2019年長江口表層沉積物中16種PAHs的ΣPAHs范圍為32.84～283.47 ng·g-1，平均值為123.16 ng·g-1。站點S3(283.47±29.94) ng·g-1濃度最高，其次是站點S7(279.07±16.75) ng·g-1和S16(234.15±0.80) ng·g-1，其原因可能是S3和S16這2個站點都靠近漁港，它們分別緊鄰呂四漁港和沈家門漁港，船只過往頻繁，匯集了船舶燃油及工業排放等多來源的污染物[26-27]；而站點S7濃度較高是由于該站點ANY(30.38±1.04) ng·g-1、BkF(5.99±0.28) ng·g-1濃度較高。ANY與石油源污染有關，BkF與液體化石燃料燃燒有關[28]，很可能是船舶燃油燃燒以及燃油泄漏導致該處的多環芳烴濃度較高。站點S6(43.86±3.54) ng·g-1和S9(32.84±1.30) ng·g-1附近海域PAHs濃度最低，主要由于該區域遠離陸地，受陸源影響較小，并且沒有突發污染事故發生。其他采樣點沉積物中濃度范圍為66.64～106.59 ng·g-1(S1=(93.18±0.070) ng·g-1、S2=(83.33±5.47) ng·g-1、S4=(66.64±2.41) ng·g-1、S5=(106.59±0.35) ng·g-1、S8=(75.66±2.18) ng·g-1、S10=(102.62±6.89) ng·g-1、S14=(97.4±12.74) ng·g-1、S15=(95.96±9.03) ng·g-1和S17=(88.08±2.81) ng·g-1)，空間分布均勻，點位之間無顯著差異(OneWay ANOVA,P<0.05)，說明研究區域的大部分點位受到長江口水流沖刷的影響，PAHs濃度得到一定程度的稀釋。

2020年長江口表層沉積物中16種PAHs的ΣPAHs范圍為66.93～132.64 ng·g-1，平均值為98.91 ng·g-1。2020年站點L6(132.64±9.95) ng·g-1和L7(130.14±8.55) ng·g-1的表層沉積物中PAHs濃度比較高，與2019年相比，2020年L6(2019年S15)附近區域PAHs濃度有所上升，可能存在某些污染源排放或突發原油泄漏。而在站點L3(68.01±5.8) ng·g-1和L5(66.93±6.22) ng·g-1處，沉積物中PAHs濃度有所降低。從時間變化來看，2020年PAHs的總體濃度有所降低。2019年的S1和S11站點分別與2020年的L1和L3站點重合。2020年的PAHs濃度在站點L1為(89.99±0.79) ng·g-1，在L3為(68.01±5.8) ng·g-1，比2019年數據S1=(93.18±0.070) ng·g-1和S11=(146.88±10.75) ng·g-1有所降低，可能與2020年新型冠狀病毒疫情暴發，沿海港口受到影響，PAHs排放相對較少有關。將本研究與長江口其他年份調查研究對比，發現本研究PAHs濃度與2013年長江口及浙江省沿岸海域PAHs(31.8～384) ng·g-1[3]濃度相當，并遠低于2009—2010年的調查結果[29]，呈現出一種逐年降低的趨勢，可能與“長江大保護”的實施有關，長江經濟帶的生態環境得到逐年改善。

圖2 2019—2020年長江口表層沉積物中PAHs含量時空分布注：(a) 2019年，(b) 2020年；ΣPAHs為多環芳烴總濃度。Fig. 2 Temporal and spatial distribution of PAHs in the sediments from the Yangtze River Estuary in 2019 and 2020Note: (a) In 2019, (b) In 2020; ΣPAHs stands for the total concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons.

根據沉積物質量基準(SQGs)提出的風險效應低值(effects range low, ERL)和風險效應高值(effects range median, ERM)，本研究進一步評估了調查海域表層沉積物中PAHs的生態風險(表1)。結果表明，2019年部分點位的FLU濃度(S11～S17)和ANA濃度(S3、S10～S11、S14)以及2020年部分點位的FLU濃度(L1～L2、L6～L7)和ANA濃度(L3)處于ERL和ERM之間，說明以上站點表層沉積物中PAHs可以引發潛在生態風險。剩余站位的PAHs各單體濃度均低于ERL值，說明這些站點海域的沉積物中PAHs引發生態風險的可能性較低。2020年長江口沉積物的生態風險略低于2019年，這也與前文對PAHs總濃度的分析結果一致。對于BbF、BkF、IPY和BPF，由于沒有最低安全值，因此這些物質只要存在對環境就會產生毒副作用[3, 30]。而在本次調查研究中，這些組分在各個站點(2019年S1～S17；2020年L4～L7)有部分檢出，其中檢出率最高的是BbF，其次是BkF，這可能是海上來往船只燃油燃燒導致的，需引起重視。

表1 長江口沉積物中PAHs的生態風險評估Table 1 Ecological risk assessment of PAHs in sediments of the Yangtze Estuary

2.2 長江口表層沉積物中疏水性有機污染物的發光細菌毒性當量(BEQbio)

本研究采用發光細菌毒性測試法評估長江口表層沉積物中有機污染物復合污染的細胞毒性效應，其量化指標為生物分析當量濃度(BEQbio)。長江口表層沉積物毒性效應的時空分布如圖3所示，不同采樣位點的BEQbio濃度存在一定的空間差異。在2019年采集的表層沉積物中，BEQbio值的范圍在30.45～604.62 mg·kg-1之間，平均值為128.20 mg·kg-1。最大值出現在S6點，為604.62 mg·kg-1；其次是S5和S11，其BEQbio分別為427.13 mg·kg-1和267.15 mg·kg-1；最小值出現在S14處，其BEQbio為30.45 mg·kg-1；在站點S1～S4、S7～S10、S13、S15～S16處，沉積物中BEQbio含量水平相對較低，且較為接近，空間分布也較為均勻，表明該區域沉積物受外界有機污染影響較小。2019年S6處的BEQbio值最大，但其ΣPAHs濃度(43.86±3.54) ng·g-1卻很低，表明PAHs并不是該站點海域主要的污染貢獻者。該站點遠離陸地，受陸源影響較小，污染物可能來源于洋流攜帶、大氣沉降或某種污染物運輸過程的突然泄漏，因此需要進一步篩選該區域的特征污染物。2020年采集的表層沉積物中，BEQbio值的范圍在23.15～122.87 mg·kg-1之間，平均值為98.91 mg·kg-1。最大出現在L1點，為122.87 mg·kg-1；其次是L4，其BEQbio為81.06 mg·kg-1。最小值出現在L5處，其BEQbio為23.15 mg·kg-1。

2019年的S1和S11站點分別與2020年的L1和L3站點重合。二者相比，2020年的細胞毒性BEQbio在站點L1為(122.87±18.29) mg·kg-1，在L3為(37.16±3.77) mg·kg-1，與2019年數據S1=(45.30±2.62) mg·kg-1和S11=(267.15±4.60) mg·kg-1相比，L1處有所升高，L3處有所降低。這與PAHs濃度變化有所不同，說明PAHs總濃度與底泥的復合毒性不存在明顯的相關性。

圖3 長江口表層沉積物中有機提取物的毒性當量BEQbio的空間分布注：(a) 2019年，(b) 2020年；BEQbio為生物分析當量濃度。Fig. 3 Spatial distribution of toxic equivalent BEQbio of organic extracts in the surface sediments from the Yangtze River EstuaryNote: (a) In 2019, (b) In 2020; BEQbio stands for biological analysis equivalent concentration.

2.3 長江口表層沉積物中PAHs的化學分析毒性當量(BEQchem)及毒性貢獻

本研究使用濃度加和概念將檢測到的化學物質的水平轉換為BEQchem，并計算了沉積物提取物中PAHs的毒性當量及毒性貢獻(表2)。結果發現，BEQchem在0.39～26.51 mg·kg-1之間。其中，2019年長江口表層沉積物中PAHs的毒性當量BEQchem在0.39～26.51 mg·kg-1之間，最大值出現在S2處，該處的PAHs毒性貢獻占比最高，為37.59%，其中低環芳烴ANY(BEQchem=(23.75±31.43) mg·kg-1)的毒性貢獻最多，約占89.60%，表明該站點受到石油源的污染較重；最小值出現在S9處，該處的PAHs毒性貢獻占比相對較低，為1.00%，表明該站點受到PAHs和有機污染物影響較小。2020年長江口表層沉積物中PAHs的毒性當量BEQchem在0.56～7.47 mg·kg-1之間，最大值出現在L3處，該處的PAHs毒性貢獻占比最高，為20.10%，其中芳烴BaA(BEQchem=(0.95±0.17) mg·kg-1)貢獻最多，約占12.69%，該站點附近的海上油井內噴出的天然氣發生自燃，導致該處的高環芳烴濃度較高；最小值出現在L5處，該處的PAHs毒性貢獻占比相對較低，為2.42%，表明該站點受PAHs及有機污染物影響較小。

在2019年長江口沉積物的細胞毒性測試中，S6點BEQbio最高，但是通過對其PAHs的BEQchem計算，可知PAHs對其貢獻極少，僅為0.081%，其他未知的有機污染物占毒性貢獻的99.9%，說明PAHs不是該站點的特征污染物。2020年的L1點也存在這種情況。

在長江口沉積物毒性當量濃度中PAHs所占比例較小，將本研究中PAHs的毒性貢獻數據與其他研究進行了比較。Hwang等[33]的研究表明，PAHs在沉積物中的毒性貢獻在Yellow Sea(韓國管轄海域)為0.02%～9.4%(1.8%)、Yellow Sea(中國管轄海域)為0.09%～246%(18.9%)、中國渤海為0.30%～1 991%(93.3%)；Jin等[34]的研究表明，PAHs在PM2.5中的毒性貢獻為北京(26.5%)、廣州(16.7%)；而本研究2019年和2020年PAHs的毒性貢獻分別為4.46%和4.25%，與以上研究結果相比，本研究PAHs的毒性貢獻偏低。該結果也表明，本研究中檢測到的PAHs僅能解釋所觀察到的復合毒性效應的一小部分，還需要進一步對其他未檢測的化學物質進行測試分析。

表2 長江口表層沉積物中有機提取物的毒性當量BEQ的質量濃度Table 2 The mass concentration of the toxic equivalent BEQ of organic extracts in surface sediments at the Yangtze River Estuary (mg·kg-1)(以干質量計 Based on dry mass)

綜上所述，本研究表明：

(1) 長江口及其鄰近海域表層沉積物中PAHs分析結果表明，2019年采集的表層沉積物樣品中PAHs在漁港附近呈現較高濃度，2020年則在舟山島附近呈現較高濃度；與2019年相比，2020年PAHs的總體濃度有所降低，且生態風險也略低于2019年。

(2) 2019年采集的表層沉積物中，BEQbio值在30.45～604.62 mg·kg-1之間(平均值為128.20 mg·kg-1)。其中，S6處毒性最強，S14處毒性最弱；而2020年的BEQbio值在23.15～122.87 mg·kg-1之間(平均值為66.62 mg·kg-1)，其中，L1處毒性最強，L5處毒性最弱。

(3)在采集的表層沉積物中，2019年PAHs毒性貢獻占比最高的是站點S2(37.59%)，其主要貢獻者是來自石油源的低環芳烴ANY，約占S2的89.60%；而2020年的是站點L3(20.10%)，其主要貢獻者是來自附近海上油井內噴出的天然氣發生自燃產生的芳烴BaA，約占L3的12.69%。在長江口沉積物毒性當量濃度中，2019年和2020年的PAHs所占比例較小，其平均占比分別為4.46%和4.25%，表明檢測到的PAHs僅能解釋所觀察到的復合毒性效應的一小部分，還需要進一步對其他未檢測的化學物質進行測試分析。

通訊作者簡介：王茜(1987—)，女，博士，講師，主要研究方向為有機污染物的環境行為、生物積累以及環境污染修復等。