基于3D體外培養模型的化學物質肝毒性預測研究進展

閆路，茍瀟，彭穎，高瑞澤，田明明，張效偉,3,*

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023 2. 流域環境生態工程研發中心，北京師范大學自然科學高等研究院，珠海 519087 3. 江蘇省生態環境保護化學品安全與健康風險研究重點實驗室，南京 210023

化學物質引起的人體肝臟疾病不容忽視。肝臟在保護機體免受有毒有害化學物質侵害方面發揮著重要作用，它能夠將親脂性物質轉化為更多的水溶性代謝物，并通過尿液有效地從體內排出[1]。然而，一些化學物質仍然會引起以炎癥、氧化應激和壞死為特征的肝臟損害[2]。據統計，超過50%以上的肝臟損害臨床案例是由于藥物引起的，并且研究發現，在過去的20年里，導致肝臟損害的化學物質還包括工業化學品、生物殺蟲劑、化妝品成分、食品添加劑和膳食補充劑等多類型化學物質[3]。如今，全球每年新增化學物質的數量超過1 000種[4]，這些化學物質在生產和使用過程中可能會產生環境污染，從而對生活在這樣環境中的人群的健康，特別是肝臟，產生不良的影響。為了保護人體健康免受某些環境化學物質的危害，利用肝毒性測試模型開展環境化學物質肝毒性預測和評估是識別健康危害的重要方面之一。

化學物質肝毒性測試方法包括傳統的動物模型(以嚙齒類為代表)和體外細胞模型。動物模型可以從組織以及個體水平上反映對環境化學物質暴露的生物效應，但是在面對大量待測環境化學物質的挑戰以及物種間差異問題時存在一定的局限性。2007年由美國國家研究委員會提出的“21世紀毒理學測試遠景與策略”強調未來毒性測試方法的重心將從整體動物的系統測試轉向基于毒性通路和毒性作用機制的體外測試，因此，以人源細胞系或者細胞成分為主的體外測試模型在評估環境化學物質的人體肝毒性方面發揮著越來越重要的作用[3]。經典的二維(2D)單層培養系統因為操作簡單而被廣泛用于化學物質高通量毒性測試，但是越來越多的研究發現在2D單層培養中，維持細胞生理表型所需的生化反應和細胞間的相互作用會隨著培養時間延長而逐漸消失，尤其是在肝細胞中發揮重要作用的各種代謝或轉運酶的表達量會降低[5]；并且在此培養模型下得到的環境化學物質毒性評估無法很好地反映生物體內長期重復劑量暴露下的真實毒性效應[6]。因此，為了提高基于體外預測模型的環境化學物質毒性預測準確性，建立能夠模擬體內環境的體外測試模型是非常重要的。

三維(3D)體外細胞培養模型在環境化學物質肝毒性測試方面，為更真實地反映環境化學物質誘發人體肝毒性效應及揭示致毒機制提供了新的測試平臺。3D體外細胞培養不同于傳統的2D單層貼壁細胞培養方式，細胞在表面黏附能力極低或含有細胞基質的支架中培養，并利用天然的細胞間相互作用來驅動3D結構的形成，這使得即使肝細胞在體外經歷長時間(例如28 d)培養，其功能也能得到較完整的保留，并且細胞也能以類似活體組織的微組織形態存在[7]。3D體外細胞培養起初是用于藥物毒性測試和篩選，隨著研究的深入，藥物肝毒性預測準確率不斷提高[8]。目前隨著社會對環境化學物質毒性的關注越來越密切，3D體外細胞培養模型在環境化學物質肝毒性預測方面的應用也在不斷增加[9]。但是，大部分現有的研究依然是從細胞毒性或者基因表達等細胞和分子層面評估環境化學物的肝毒性，如何充分發揮3D體外細胞培養模型的優勢，為環境化學物質肝毒性研究提供系統的毒性機制信息是未來研究的挑戰。與此同時，有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架很好地總結了驅動毒性發生的致毒機制，整合了從分子、細胞、器官乃至個體、種群水平的各個毒性事件[10]。毒性事件按發生的時間順序可以分為分子起始事件(molecular initiating event, MIE)，關鍵事件(key events, KEs)和有害結局(adverse outcomes, AOs)[10]。框架化的毒性機制為體外測試方法的應用提供了理論基礎[11]。創立于2014年的AOP-wiki數據庫(https://aopwiki.org/)目前(截至2021年8月31日)有22條與肝毒性相關的AOPs，涉及的肝毒性終點包括肝臟腫瘤、肝纖維化、脂肪肝、膽汁淤積以及肝細胞損傷。驅動肝毒性發生的致毒機制總結為3D體外肝細胞培養方法的建立以及測試應用提供了機制參考信息。本文綜述了目前常用3D體外細胞培養模型的制備方法，以及在環境化學物質(納米材料、持久性有機污染物和新型有機污染物等)肝毒性預測方面的應用，最后探討了3D肝細胞體外培養模型在AOP指導下開展肝毒性預測的研究現狀與應用前景，包括如何確定細胞培養體系和整合毒性測試信息、如何提高環境化學物質肝毒性預測的效率以及準確性等。

1 3D體外培養模型的制備方法(Methods of 3D in vitro culture models)

依據制備方法，3D肝細胞體外培養模型可以分為夾層培養法、靜態球形模型、生物反應器、器官芯片和3D生物打印(表1)。

1.1 夾層培養法

肝細胞夾層培養法被廣泛應用于化學物質通過膽汁淤積誘導的肝毒性研究中。它的培養方式是在2層細胞外基質之間培養肝細胞(圖1(a))。通常用到的細胞外基質是凝膠的膠原蛋白或Matrigel(一種細胞外基質的混合物，其中包含層連蛋白和多種生長因子)；細胞外基質的構成影響著細胞的排列和功能，夾層培養中的底層基質先于細胞放置于培養板中，故基質種類和成分的不同會影響底層基質的硬度以及粘連蛋白的數量從而影響后續接種細胞形態和多細胞排列；覆蓋層基質放入后，細胞會處于上下覆蓋的立體空間中，這樣的環境有利于維持細胞的活力，并能誘導細胞分化，影響膽汁的分泌和排泄行為[12, 17]。肝細胞在夾層培養中保存了肝細胞極性，以及膽管功能的形成。這種3D肝細胞培養系統可用于評估化學物質對肝膽運輸的影響以及化學物質引起由膽汁酸介導的肝臟毒性(膽汁淤積)[17]。Chatterjee等[18]利用夾層培養法分別構建了基于人源肝細胞和大鼠源肝細胞的化學物質膽汁淤積評估模型，通過比較不同模型下得到的化學物質膽汁淤積指數，該研究發現人源肝細胞模型中獲得的膽汁淤積指數與報道的臨床藥物膽汁淤積發生率相關。同時，另一則研究利用該培養方式對344個藥物的肝毒性進行測試，并實現了50%～60%的真陽性預測準確率[19]。然而，夾層培養法的主要局限性是在長期培養中存在滲漏、膽管損傷和膽汁淤積的現象，因此夾層培養法的培養條件還需要改善，以便增加體外模擬肝膽排泄過程所需的膽管系統的穩定性[20]。

1.2 靜態球形模型

球形模型是指那些使細胞聚集為細胞球狀體的細胞培養體系，其中懸滴培養法和微模法是2種比較常用的靜態球形模型，因為操作簡單而被廣泛應用于化學物質肝毒性評估以及機制研究中(圖1(b))。HepG2(人肝癌細胞)球狀體和HepaRG(末分化的人肝癌細胞)球狀體是2種在靜態球形模型下容易獲取的肝細胞球狀體。HepG2球狀體相比于常規的2D培養方式下的HepG2具有較好的糖原儲存和代謝能力，且白蛋白、尿素、異源物質轉錄因子、Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達量增多[13]。分化狀態下的HepaRG細胞的酶活性以及轉錄組表達情況與原代人肝細胞相似，它被認為是原代人源肝細胞的替代細胞系[21]。但是在2D單層培養下，HepaRG的部分細胞色素酶、Ⅱ相酶以及轉運蛋白表達量與原代人源細胞相比顯著下降[22]。HepaRG球狀體可培養長達4周且在培養過程中外源代謝能力一直保持著與原代人肝細胞相似的水平[23]。研究表明HepG2和HepaRG球狀體有著不同的應用場景，HepG2球狀體在識別化學物質引起的細胞毒性方面有著更高的敏感性，而HepaRG球狀體在分子水平識別特異毒性方面有著更好的能力[24-25]。

圖1 3D體外培養模型制備方法Fig. 1 Methods of 3D in vitro culture models

表1 3D體外培養模型的制備方法Table 1 Methods of 3D in vitro culture models

3D培養方法3D generation methods肝細胞類型Hepatocytes 培養時間Culture times高通量能力High-throughput支架Scaffold模型特點Comments參考文獻References3D生物打印3D Bioprinting原代肝細胞(人、大鼠、小鼠)、HepG2、Hep-aRG、干細胞、肝細胞與非實質細胞共培養Primary hepatocytes (hu-man/rat/mouse), HepG2, HepaRG, stem cells, co-culture with NPCs>2周>2 weeks☆合成聚合物Synthetic polymers按照預先設定的程序,生物材料能夠被精準放置,制備出復雜的生物結構Based on a predetermined proce-dure, biological materials can be precisely placed to generate com-plex biological structures[16]

肝非實質細胞在肝毒性產生過程中發揮著重要作用，因此由肝細胞和肝星狀細胞、Kupffer細胞、竇狀內皮細胞共同培養的多細胞球形模型提高了預測化學物質肝毒性的能力。其中，肝細胞與肝星狀細胞共培養比較常見，而組成相對復雜的肝細胞、肝星狀細胞與Kupffer細胞的三元共培養系統則可更全面、高效地評估化學物質引發肝纖維化的機制及能力[26]。Prestigiacomo等[27]利用GravityPLUSTMHanging Drop系統構建了一個由HepaRG、肝星狀細胞以及巨噬細胞混合培養的3D肝微組織模型，并證實該模型可以在體外再現導致肝臟纖維化的分子與細胞水平的關鍵生物事件，如肝細胞損傷、抗氧化反應、Kupffer細胞激活、肝星狀細胞激活以及細胞外基質沉積。盡管靜態球狀模型在高通量化學物質肝毒性預測方面有著較好的應用前景，但是目前的研究往往缺乏統一的測試基準來標準化測試結果，因此限制了其在大規模化學物質肝毒性預測方面的應用。

1.3 生物反應器

生物反應器因培養條件可控的特點為體外細胞培養提供了良好的生長環境，被用于化學物質肝毒性研究。生物反應器是一個通過灌注或者攪拌的方式使肝細胞培養系統處于一個流動狀態的裝置(圖1(c))，該裝置將血流動力學和剪切應力對肝臟功能的影響考慮到了模型制備中，目的是為了生成更貼近體內肝臟復雜形態的模型，特別是彌補了嚴重肝損傷時肝臟功能下降的不足[28]。流動的生物反應器可以提升模型的去毒能力同時保存生物合成和生物轉化的功能。最早報道的生物反應器是一個體積為800 mL的3D灌注多室中空纖維膜生物反應器[29]，它由3個獨立的毛細管系統組成，分別用于動靜脈介質灌注、氧氣供應和二氧化碳清除，當反應器中接種肝臟實質和非實質細胞后，這些細胞在培養過程中自我組裝成組織樣結構。之后，該裝置被縮小到2 mL的體積，使用的細胞量也減少至1.2×108個，適用于臨床藥物測試。在該裝置內，細胞色素酶P450可保持活性長達23 d，肝實質細胞和非實質細胞的生理結構也能被觀察到，管狀轉運體蛋白MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2)、P-gp (P-glycoprotein)和BCRP (breast cancer resistance protein)等外排型轉運蛋白分布特征也與人體肝臟組織中的分布特征相似。此外，研究發現HepaRG細胞和原代人肝細胞在生物反應器培養中表現出相似的細胞色素酶P450和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶活性[30]。生物反應器還可以密切監視整個反應介質中氧氣、乳酸含量以及任何可通過近紅外技術測量的參數；同樣的，細胞的狀態也可以通過觀察細胞內熒光蛋白的含量得到反映[31]。總的來說，生物反應器裝置在模擬肝臟的功能和表型方面表現優異，但實際使用過程中由于所需細胞量巨大而不適用于高通量的毒性測試。

1.4 器官芯片

器官芯片為研究化學物質肝毒性提供了一種復雜度更高、仿真效果更好的體外模擬人體肝臟器官的方式[32-33]。模型利用微流控技術將不同類型細胞在同一個系統的分隔室內共同培養，通過產生流體剪切力、機械應力和生化濃度梯度等理化刺激使細胞發生自組裝，從而在培養過程中表現出更加真實的生理學功能[33]。肝臟芯片技術為研究藥物代謝和化學物質毒性測試提供了一個更加接近于人體真實暴露環境的裝置，且肝臟芯片已逐漸被商業化使用[34]。例如，Organovo公司生產了一種由原代肝細胞和非血小板細胞組成的肝臟微組織芯片ExViveTM[35]。Rennert等[36]使用雙通道微流控技術創建了一個由多孔膜(模擬肝淋巴間隙)分隔的3D肝臟模型，該模型整合了由內皮細胞和組織巨噬細胞組成的血管層以及由肝星狀細胞與HepaRG細胞共同培養的肝臟層，增強了肝細胞的極性，并允許觀察肝膽功能。同時，器官芯片還可以通過連接腸道上皮細胞和肝臟細胞形成肝-腸多器官芯片，進一步增加器官芯片的復雜性[37](圖1(d))，這樣的模型可用于研究化學物質的代謝途徑以及在器官水平上評估化學物質的毒性效應。Choe等[15]開發了一種由腸道上皮細胞(Caco-2)和肝細胞(HepG2)2個單獨層組成的微流體腸道肝芯片，2種細胞的細胞色素酶P450代謝活性在該培養系統中顯著增強，且Caco-2細胞的吸附特性也因流動而改變，在評估藥物代謝特征方面比單一細胞培養更接近人體報告數據。總之，肝器官芯片提供了一個更加接近于人體肝臟器官的體外培養模型，有利于準確掌握化學物質引發肝毒性的致毒機制及毒代動力學過程，但是大部分的肝臟器官芯片測試還需要得到進一步的驗證，且芯片的高成本阻礙了其應用。

1.5 3D生物打印

3D生物打印利用編程技術可以實現對肝細胞以及細胞外基質的精準組裝，被逐漸應用于預測化學物質肝毒性以及毒性機制研究中。這項技術使用含有細胞的生物材料作為生物打印墨水，在預設的計算機程序下，逐層精確定位墨水的空間位置，從而打印出具有生物活性的立體細胞組織構架(圖1(e))。3D生物打印的方法策略包括3個方面：(1)仿生學，即對組織或器官的細胞和細胞外成分進行體外復制，復現結構的同時也要保證功能的實現；(2)自組裝，即利用胚胎作為生物組織復制的原材料，并通過操縱培養系統的參數來驅動3D生物打印組織中的胚胎生長；(3)微型組織、器官，即利用仿生學和自組裝策略的結合，將自我組裝的細胞集團，再次組裝成為功能性的宏觀組織[38]。目前3D生物打印主要有3種打印方式：激光輔助生物打印[39]、液滴噴射生物打印[40]和擠壓成型生物打印[41]。通過這些技術，3D生物打印最終能夠在體外構建出一個功能性的組織或器官，用于化學物質的毒性預測和篩選。在化學物質肝毒性篩選與預測方面，Ide等[8]利用3D Regenova?生物打印機生成了由原代人肝細胞和人肝星狀細胞組成的肝微組織，該微組織直徑大約1 mm，能夠持續培養25 d，且保持長期的細胞活力以及代謝與轉運相關基因的表達；與2D培養和球狀模型下的化學物質肝毒性評估結果相比，該模型通過檢測三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate, ATP)和白蛋白指標識別出了其他2類模型沒有識別到的肝毒性化學物質，具有更高的靈敏性。然而，3D生物打印仍然存在一些有待改進的地方，如細胞與生物相容性材料之間的兼容性差，打印速度低，打印后可能會由于培養環境的失控導致支架形狀發生改變。為了解決這些問題，新一代的3D生物打印方法也在不斷的發展中[16]，例如，一種四維(4D)生物打印新技術被提出，第四維指的是3D生物打印生成的構造在打印后隨著時間的推移繼續被控制發展[42]。

2 3D體外培養模型在環境化學物質肝毒性預測中的應用(Application of 3D in vitro culture models on hepatotoxicity prediction of environmental chemicals)

環境化學物質肝毒性評估按暴露時間主要分為短期暴露(12 h或24 h)產生的肝細胞毒性(例如50%受抑制濃度(IC50))，與長期暴露(數周或數月)引起的肝特有毒性(例如肝纖維化或脂肪肝)[43]。目前3D肝細胞體外測試模型在環境化學物質肝毒性尤其是慢性肝毒性評估方面的應用逐漸增加，表2羅列了3D體外培養模型在環境化學物質引發肝毒性的預測中的應用案例，包括納米材料、持久性有機污染物(四氯二苯并-對-二噁英(TCDD)、3,3’,4,4’,5-五氯聯苯(PCB126)等)和新型有機污染物等(全氟辛酸(PFOA)等)。

2.1 納米材料

3D肝細胞體外培養模型可有效控制納米材料的暴露方式，為研究納米材料在體外肝細胞功能穩定情況下的毒性效應提供測試平臺，且目前在納米材料肝毒性評估中應用較多的是球形模型和流動狀態的芯片模型。隨著納米材料在醫藥、個人護理品及電子產品等多個領域的大量應用[56]，納米材料存在廣泛的環境暴露與生物內暴露，嚴重威脅生態環境及人體健康安全[57]。盡管目前納米材料的環境健康風險研究已經取得了較多的進展，但是仍然存在許多亟待解決的問題和挑戰。其中，由于納米材料的毒性效應受多種因素(元素組成、尺寸和表面電荷等)的影響，傳統的化學藥品毒性測試方法不適用于納米材料毒性機制評估[58]，因此，需要發展針對納米材料環境健康風險評估的新方法或者替代測試策略。Li等[44]構建了一個用于評估納米材料肝毒性的微流控3D肝細胞芯片模型，該模型通過連續灌注的方式研究納米材料累積暴露的毒性。超順磁性氧化鐵納米粒子在該模型下表現出比標準的2D孔板暴露方式更強的肝毒性，可能的原因是較小尺寸的納米粒子在此模型下更有可能與肝細胞發生作用，影響白蛋白和尿素的合成路徑，最終引發更嚴重的肝損傷。Jiang等[45]利用大鼠肝細胞球狀體研究了硫化銅納米粒子的肝毒性及其機制，發現硫化銅納米粒子通過影響線粒體膜電位以及誘導細胞產生氧化應激從而引起肝毒性，同時還發現硫化銅納米粒子影響膽鹽輸出泵的轉錄和表達，對肝臟膽汁的轉運進行阻斷，但是具體的機理還有待進一步的研究。

表2 3D體外培養模型在化學物質肝毒性預測方面的應用案例Table 2 Application cases of 3D in vitro culture models for hepatoxicity prediction of environmental chemicals

不同的納米材料在3D肝細胞體外培養模型下的肝毒性效應與2D培養模型下的結果相比較，敏感性不同，但3D培養模型下的肝毒性效應更能真實地反映納米材料體內暴露的毒性。Elje等[46]對比了HepG2細胞在3D球形培養和2D培養下對納米二氧化鈦、納米銀以及納米氧化鋅的毒性響應，包括細胞毒性和基因毒性；發現弱毒性的納米二氧化鈦在2個模型下都沒有表現出毒性效應，強毒性的納米氧化鋅表現出相似的細胞毒性，但是納米銀對2D培養下的HepG2細胞具有更強的毒性，這些差異的來源可能是由于納米材料暴露方式的不同影響了其毒性效應。盡管納米材料的肝毒性在3D培養模型下與2D培養存在差異，但是3D培養模型下的肝毒性數據與體內測試結果有著更好的一致性[59]。因此，開發并使用能夠模擬體內暴露環境的3D培養模型進行納米材料的人體健康風險評估非常重要。

2.2 持久性有機污染物

3D肝細胞模型為研究持久性有機污染物(POPs)對人體肝臟的影響提供了一個接近于體內肝臟功能且能夠研究低濃度長期暴露毒性效應的測試平臺，這增加了利用體外模型的毒性數據預測POPs人體健康風險的可信度。二噁英(TCDD)和多氯聯苯(PCB126)是2種典型的持久性有機污染物，同時是芳香烴受體(AhR)的配體[60]，由于AhR受體的結構以及AhR信號通路響應在動物與人體之間具有差異，且AhR受體在TCDD、PCB126致毒過程中發揮著重要作用，因此TCDD、PCB126致毒機制及毒性效應存在物種差異[61]。在動物模型下，TCDD、PCB126與AhR受體結合，激活AhR信號通路，產生大量的細胞色素酶，長期暴露導致細胞氧化應激和炎癥反應增強，肝細胞以及周圍的肝非實質細胞的正常功能紊亂，導致脂肪肝、肝纖維化以及肝臟腫瘤的發生[62]。然而，Yan等[47]構建了一個由HepaRG、肝星狀細胞(HSCs)和巨噬細胞(THP-1)共培養的人肝微組織模型，該模型能有效用于識別化學物質所引發的肝纖維化，并且觀察到硫代乙酰胺(TAA)以及苯并芘(BaP)引起的肝纖維化。但在TCDD和PCB126脅迫下，并未觀察到肝纖維化，僅檢測到細胞色素酶等代謝相關信號的激活[27]。動物模型和人肝微組織模型測試結果的差異進一步預示著在評估POPs對人體肝臟危害時，需要考慮物種間的毒性差異。除了3D人肝微組織模型外，基于雞肝癌細胞(LMH)以及原代水牛肝細胞的3D球狀模型也分別用于評估PCB126和TCDD的毒性效應[48-49]。研究發現，PCB126在3D雞肝癌細胞模型下的細胞毒性IC50值高于2D培養模型，但是在評估7-乙氧基-異吩唑酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD)活性以及AhR相關基因表達方面，PCB126在3D模型下誘導更高的基因表達以及EROD活性，這表明了3D培養模型在評估分子水平變化時具有靈敏度高的特點。以原代水牛肝細胞構建的3D肝細胞培養模型通過檢測TCDD誘導的特有基因表達情況，并與已知的原代人肝細胞以及大鼠細胞測試結果做比較，發現該模型對TCDD的響應與原代人肝細胞模型更相似，這也說明了不同物種在響應TCDD毒性時存在物種差異，以及發展更接近于人體毒性響應模型的重要性[49]。總之，在評估化學物質對人體肝臟的影響時，建立與人體肝臟模型相關性高的3D體外細胞模型一方面可以在體外培養肝細胞的過程中保存肝細胞功能，另外一方面可以縮小毒性效應的物種差異，為環境化學物質的肝毒性評估提供接近于人體肝臟功能的測試平臺。

2.3 新型有機污染物

3D肝細胞培養模型為新型有機污染物全氟辛酸(perflurooctanoic acid, PFOA)和雙酚A (bisphenol A, BPA)的肝毒性機制研究提供了一個模擬體內暴露環境的平臺，縮小了體外和體內研究結果的差異，彌補了傳統2D細胞培養下肝細胞基因表達異常等不足。隨著PFOA替代品的出現，為了提高PFOA及其替代品的毒性測試通量以及增加體外測試數據的準確性，利用3D肝細胞模型進行這類物質的肝毒性研究是一個可行的選擇。在小鼠肝細胞(AML12)球形模型下，PFOA細胞毒性的IC50值比2D培養條件下的數值高，且氧化應激水平也具有同樣的趨勢，41.4 mg·L-1和82.8 mg·L-1PFOA暴露AML12球狀體28 d會導致細胞氧化應激、乳酸脫氫酶漏出率以及凋亡效應因子caspase3/7活性顯著增加；六氟環氧丙烷二聚酸(hexafluoropropylene oxide dimer acid, HFPO-DA)和全氟-3,5,7,9-四氧雜癸酸(perfluoro-3,5,7,9-tetraoxadecanoic acid, PFO4DA)這2個新興替代品也會引起細胞氧化應激以及細胞損傷，但比PFOA的肝毒性小[50]。

3D肝細胞體外培養模型在BPA肝毒性機制研究方面的應用提高了慢性BPA暴露肝毒性致毒機制的認識。HepG2球狀體經BPA染毒14 d后的轉錄組變化顯示，BPA影響與脂質代謝功能相關的生物過程，包括脂質生物合成、類固醇代謝過程和膽固醇調節過程，且這一結果與大鼠經BPA暴露90 d后的轉錄組變化情況相一致[51]，補充了2D HepG2模型未檢測到低濃度BPA暴露影響脂質代謝的不足[63]。另外，在基于人肝癌細胞Hep3B的微流控芯片模型中，BPA被證實在CYP2E1細胞色素酶存在的情況下毒性更強，而在乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶以及雌激素硫酸轉移酶存在的情況下毒性減弱，同時該系統用到的酶樣品體積僅為普通的96孔板的1/2 000，大大節約了該模型評估化學物質代謝毒性所需要的花費[9]。

2.4 其他環境化學物質

3D肝細胞模型可用于研究由農藥暴露引起的肝臟代謝紊亂的毒性機制。在傳統的2D細胞模型下，肝細胞的代謝能力會迅速減弱，這會影響農藥肝臟毒性的預測，以及機制的研究。Jellali等[52]利用大鼠原代細胞構建的器官芯片和多組織學測試方法的結合研究了滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT)、氯菊酯(permethrin, PMT)和它們混合物引起的肝臟損害，轉錄組和代謝組測試結果共同表明，53.1 mg·L-1DDT、58.7 mg·L-1PMT和DDT/PMT混合物通過干擾與PPARα信號傳導、脂質代謝和類固醇合成等相關基因而干擾脂肪酸、脂質以及葡萄糖的代謝，同時發現混合暴露會引起更加復雜的基因和代謝紊亂。

除了肝毒性之外，3D肝細胞模型也可以用于評估環境化學物質基因毒性，且比2D培養模型具有更好的靈敏性。Sharin等[53]對比了BaP在雞肝癌細胞2D培養和3D球形培養下誘導的cyp1a表達量以及引發的DNA損傷響應；在3D模型下，EROD活性在暴露8 h后即可檢測到且在暴露24 h達到最大值，比2D模型更早檢測到，同時與DNA損傷響應相關的基因也更早地在3D細胞模型下被檢測到，這說明了雞肝癌細胞LDH球狀體適用于評估需要CYP1A激活的化學物質的基因毒性。Mandon等[54]利用HepaRG細胞構建了一個用于評估化學物質基因毒性的肝細胞模型，該模型測試了11個基因毒性化學物質對HepaRG球狀體染毒24 h和48 h后DNA損傷情況，并且彗星實驗結果顯示8個基因毒性化學物質被檢測到具有損傷DNA的能力。盡管3D HepaRG球狀體在預測化學物質遺傳毒性方面是一個非常有潛力的模型，但是還需要進一步的實驗來驗證和提高該模型對化學物質致癌性的預測效果。

3 3D體外培養模型在肝毒性AOPs指導下的應用前景(Prospect of 3D in vitro culture models under the guide of hepatotoxicity AOPs)

3D體外培養模型不僅提高了環境化學物質關于肝細胞毒性數據的準確性，還為分析環境化學物質引發多種肝毒性有害結局(例如膽汁淤積、脂肪肝和肝纖維化)提供了復雜的體外細胞模型。肝毒性AOPs系統地描述了毒性發展過程，根據收錄在AOP-wiki數據庫中涉及到肝毒性的有害結局，肝毒性AOPs可以歸納為5種類型：肝臟腫瘤、肝纖維化、脂肪肝、膽汁淤積和肝細胞損傷。這些AOPs涉及到的生物信息有利于針對性地設置3D體外培養模型的檢測指標，指導3D體外培養模型從分子、細胞、組織和器官水平對環境化學物質肝毒性進行評估，實現提高模型預測準確性的目標[64]。

不同的肝毒性終點測試需求決定了3D體外培養模型的選擇。在預測環境化學物質對人體肝臟的影響時，選擇基于人源細胞系的培養模型能夠減少由物種差異帶來的毒性信息不一致的可能性；而利用動物源肝細胞培養模型獲得的化學物質毒性數據以及毒性機制信息同樣為生態及健康風險評估提供了重要的理論依據。另外一方面，針對化學物質引起的肝纖維化、脂肪肝等肝臟毒性研究，由于毒性產生過程中多種細胞系受到影響且細胞系之間存在密切的相互作用，因此在評估這種類型的肝毒性時，多細胞系共培養模型更加符合化學物質毒性引發的場景。此外，3D體外培養模型可以評估環境化學物質低濃度長期暴露引起的肝臟損傷以及細胞內發生的分子機制，并結合現有的肝毒性AOPs預測環境化學物質對人體的影響。

3D體外肝細胞培養模型聯合其他體外測試方法或者組學測試(轉錄組學、代謝組學、脂質組學與蛋白質組學)進一步提高了環境化學物質肝毒性預測的準確性[65]。導致肝臟毒性的過程會涉及到多種細胞參與，是一個機制比較復雜的過程。因此，目前單一模型或測試無法準確評估環境化學物質誘發肝損傷的風險。依據肝毒性機制構建一個包含多種或多級肝毒性測試方法的整合預測模型是毒性測試的發展方向[66]。這種整合預測方法由2個維度組成(圖2)，橫向反映的是環境化學物質引發的肝毒性AOPs，縱向是整合測試評估方法(integrated approaches to testing and assessment, IATA)。環境化學物質引起肝毒性分子啟動事件的發生是肝損傷的重要分子標志物之一，由于待測環境化學物質數量巨大，采用體外化學分析法(inchemico)或計算機模擬法(insilico)對分子啟動事件的進行評估可以提高預測的規模和速度。具有引發分子啟動事件潛力的那些環境化學物質將會進行第二級的肝毒性體外測試，主要是為了檢測環境化學物質在細胞或組織水平是否能夠引起肝毒性生物標志物的變化，這個過程涉及到的毒性機制更加復雜，因此3D體外肝細胞培養模型的應用為這一步的測試提供了更好的測試平臺。如果環境化學物質在第二級同樣被檢測出有肝毒性風險，則需要進行第三級人群流行病學的調查，進一步確認該環境化學物質的肝毒性。

綜上所述，3D體外肝細胞培養模型更好地模擬了真實肝臟的功能，并形成了以夾層培養法、球形模型、生物反應器、器官芯片和3D生物打印5種主要的3D細胞模型制備方法，其中球形模型在進行大量環境化學物質肝毒性預測方面應用時可以做到高通量，而生物器、器官芯片以及3D生物打印可以模擬更加復雜的體內肝臟環境。肝毒性AOPs總結了化學物質從(1)分子啟動事件(cyp2e1持續激活、AhR持續激活、PPARα激活等)，到(2)細胞、組織/器官水平上的分子響應關鍵事件(膽汁酸合成增加、脂質積累、炎癥反應、肝星狀細胞激活等)，再到(3)個體水平上可觀察到的肝損傷(肝臟腫瘤、肝纖維化和脂肪肝等)，為充分利用3D體外肝細胞培養模型進行環境化學物質肝毒性預測提供了理論依據。另外，3D肝細胞模型可以與多種檢測技術(如組學)結合，進一步提高對環境化學物質肝毒性預測的準確性。

圖2 有害結局路徑指導下的肝毒性整合測試評估方法注：AOP表示有害結局路徑；IATA表示整合測試評估方法；MIEs表示分子啟動事件。Fig. 2 Integrated testing assessment approaches for hepatotoxicity guided by the adverse outcome pathwayNote: AOP stands for adverse outcome pathway; IATA stands for integrated approaches to testing and assessment; MIEs stands for molecular initiating events.

通訊作者簡介：張效偉(1978—)，男，博士，教授，博士生導師，主要研究方向為生態毒理學和健康風險評估。