基于有害結局路徑的化學物質計算毒理學研究

茍瀟，于洋，林軍，閆路，彭穎,3，張效偉,*

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023 2. 生態環境部固體廢物與化學品管理技術中心，北京 100029 3. 流域環境生態工程研發中心，北京師范大學自然科學高等研究院，珠海 519087

毒性數據缺乏是化學物質風險管理面臨的一大挑戰[1]。化學物質的毒性測試方法正逐步由傳統的資源(時間、金錢、動物)消耗型的體內試驗(invivo)[2-3]，發展為資源低消耗的體外試驗(invitro)[4]。高通量篩選技術(high-throughput screening, HTS)以invitro為基礎，聯合計算機分析技術，可高效地一次性提供多個生物水平的機制數據[5-6]，為化學物質的毒性測試提供了一種新策略，也促進了預測毒理學發展。比如，由美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)組織的ToxCast項目已使用約1 000種體外生物測試方法對10 000余種化學物質的超過700種生物終點進行了測試[7-10]，這些數據量龐大的分子機制數據為高通量化學物質毒性預測提供了可能。

目前，數據驅動(data-driven)與機制驅動(mechanism-driven)是實現體外生物測試數據高通量毒性預測的主要策略[11]。數據驅動方法以定量構效關系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)和交叉參照(read-across)等為代表。傳統的QSAR與交叉參照都認為結構相似的化學物質具有相似的生物效應[12]，因此可基于已有的化學物質結構-效應關系預測結構明確但未經生物測試化學物質的生物活性[13-14]。Braga等[15]基于600余種化學物質已有的結構及皮膚致敏數據，開發通過QSAR的方法，預測化學物質誘導皮膚致敏的情況。Russo等[16]基于PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)內7 385個化學物質的分子結構、體外生物測試信息及大鼠經口急性毒性數據，采用交叉參照的方法建立了化學物質的大鼠經口急性毒性的預測方法。數據驅動為未經測試的化學物質毒性預測提供了解決方案，但主要局限于機制相對簡單的急性毒性終點，然而目前環境化學物質的致毒模式多為在低濃度下、通過多機制引發多類型的慢性毒性。

機制驅動的有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)可為化學物質毒性預測提供生物學通路機制證據[17-19]。AOP通過關鍵事件(key event, KE)將分子啟動事件(molecular initiating event, MIE)與個體水平的有害結局(adverse outcome, AO)聯系起來[20-21]。目前AOP知識庫(AOP knowledge base, AOP-KB; https://aopkb.oecd.org/index.html)已經整合了251條AOPs，包括185個MIEs，745個KEs，147個AOs(截至2019年8月2日)。《全球化學品統一分類和標簽制度》(Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals, GHS; https://www.ghs.org)歸納了國際管理要求的10類化學物質健康危害。根據AO毒性終點及作用的靶器官，按照“系統器官分類”(system organ class, SOC)標準[22]，可將147個AOs分為11種毒性類型，分別是致癌/遺傳毒性、生殖毒性、消化系統毒性、內分泌干擾、神經毒性、呼吸毒性、血液循環系統毒性、泌尿毒性、免疫毒性、急性致死及發育毒性，共覆蓋GHS的9類健康危害類型(90%，除“嚴重眼損傷/刺激”)。AOP知識庫不斷豐富和完善，為滿足環境管理需求的化學物質毒性預測提供了基礎和機遇。

AOP的發展主要是以定性AOP(qualitative AOP)及定量AOP(quantitative AOP, qAOP)2種形式進行。qAOP是基于已有的生物學知識，借助計算機模型，描述化學物質脅迫下可能發生的MIE、KE及AO之間的時間/劑量-效應關系[23]。相較于定性AOP，qAOP的發展目標是滿足真實暴露場景下化學物質毒性預測的需求[24]。其概念從提出至今已被廣泛應用于化學物質的風險管控中。Jaworska等[25]聯合ToxCast體外測試數據，預測124個化學物質與皮膚致敏生物事件(KE ID:824)的劑量-效應關系，并將這些化學物質的皮膚致敏危害度進行排序。Mellor等[26]聯合ChEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)數據庫，計算出以有潛力激活/抑制芳香烴受體(aryl-hydrocarbon receptor, AhR)等核受體為MIEs，最終誘導肝臟脂肪變性(KE ID:459)的化學物質的結構警示子。Phillips等[27]以ToxCast中具有抑制乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)(KE ID:12)體外生物測試活性的32個化學物質劑量-效應關系為基礎，結合QSAR，預測了1 029個化學物質通過抑制AChE(KE ID:12)誘導相關AOs的風險。由于qAOP的建立需要建立復雜的時間/劑量-效應模型，目前涵蓋的AOP及化學物質數量少。但是隨著高通量組學測試、器官芯片和人工智能等新技術的發展，未來qAOP有潛力應用于化學物質的高通量毒性預測。

基于定性AOP的化學物質毒性預測更為簡潔高效。定性AOP構建了化學物質脅迫下的關鍵事件級聯知識，描述了從MIE到AO的過程，可用于化學物質的危害識別[23]。如果化學物質誘導了一條AOP的MIE或KE，則相應AO有被引發的可能。定性AOP盡管未能考慮真實暴露場景下的時間及劑量因素，但目前已覆蓋了多種生物水平，為預測化學物質潛在的多種毒性終點提供了條件。Aguayo-Orozco等[28]結合ToxCast化學物質體外生物測試與AOP-KB，使用“細胞毒性爆發”(cytotoxicity burst, CTB)方法對4 960種化學物質的207條AOPs誘導情況進行了預測，并建立了首個化學物質的AOP誘導預測網站(http://saop.cpr.ku.dk/)。但是由于ToxCast體外生物測試數據生成背景及質量存在差異[29]，AOP-KB內AOP的發展成熟度不同(分為“正在發展中”和“列入經濟合作與發展組織(OECD)計劃中”兩階段)，有必要對其毒性預測準確性進行進一步評價。

本研究基于AOP，聯合ToxCast體外生物測試數據建立對化學物質毒性預測的方法，首先評估了具有體外生物測試數據的MIE/AOP情況，其次，選取101種典型環境化學物質，分析了其體外生物測試結果，最后進行毒性預測，并通過與PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)已報道的化學物質毒性比較，評價此次毒性預測的結果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 “化學物質-體外生物測試-MIE-AO”關聯建立

可通過檢測MIE來識別化學物質的AOP誘導情況[30]。首先，將AOP-KB內185個MIEs與ToxCast內10 000余種體外生物測試的生物效應進行比對，建立“MIE-體外生物測試”表。比對方法為根據ToxCast內對所有體外生物測試與AOP-KB內對MIE的生物靶點及效應的描述，當體外生物測試與MIE的生物靶點與效應均一致時，則認為二者比對成功。“MIE-體外生物測試”表中有48個MIEs能成功比對到共112種體外生物測試方法，這48個MIEs共可對應58種AOs，共覆蓋11種毒性類型。

將“MIE-體外生物測試”與ToxCast內化學物質體外生物測試比對，若化學物質與MIE的同一體外生物測試結果均為陽性，則認為該化學物質可引發該MIE，并誘導相關AO。若化學物質與MIE的同一體外生物測試結果都為陰性，則認為該化學物質不可引發該MIE，且無法誘導相應AO。

以全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)(CAS RN:1763-23-1)為例，PFOS具有“ATG_PPARα_TRANS_up”、ATG_PPARg_TRANS_up”和“ATG_ERα_TRANS_up”等179個體外生物測試陽性結果，其中有22個體外生物測試能比對到共37個MIEs，表明PFOS可潛在引發以激活過氧化物酶體增殖物激活受體α/g(peroxisome proliferators-activated receptorsα/g, PPARα/g)及雌激素受體(estrogen receptorα, ERα)等為生物效應的MIEs及其相應的AOs(圖1)，包括“肝細胞癌變作用增強”(KE ID:1171)、“血管肉瘤增多”(KE ID:1037)、“肥胖”(KE ID:1447)和“乳腺癌”(KE ID:1193)等40個AOs。

1.2 典型環境化學物質的選取

選取《中國現有化學物質名錄》[31]與AOP-KB(484個化學物質，截至2019年8月2日)均有收錄，且在“MIE-體外生物測試”表中具有陽性體外生物測試結果的化學物質，用于后續基于AOP的毒性預測。共選取了101個化學物質，其中包括32種工業用品，40種農藥，29種藥品及個人護理品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)。

圖1 建立“化學物質-體外生物測試-MIE-AO”關聯：以全氟辛烷磺酸(PFOS)為例注：AOP表示有害結局路徑；MIE表示分子啟動事件；KE表示關鍵事件；AO表示有害結局；AC50表示50%最大生物活性濃度。Fig. 1 Establish connection of “chemical-in vitro bioassay-MIE-AO”: Taking perfluorooctane sulfonate (PFOS) as an exampleNote: AOP stands for adverse outcome pathway; MIE stands for molecular initiating event; KE stands for key event; AO stands for adverse outcome; AC50 stands for concentration at 50% of the maximum activity.

1.3 化學物質毒性預測結果的評價方法

將PubChem內已報道的毒性作為化學物質真實可引發的毒性(毒性PubChem)，將基于AOP預測的化學物質毒性作為“毒性AOP”。“毒性PubChem”與“毒性AOP”的內涵均是不同的毒性類型(包含在11種毒性類型中)。通過“化學物質-體外生物測試-MIE-AO”預測化學物質潛在毒性，可能出現真陽性(毒性PubChem與毒性AOP均為“真”)、真陰性(毒性PubChem與毒性AOP均為“否”)、假陽性(毒性PubChem為“否”，毒性AOP為“真”)、假陰性(毒性PubChem為“真”，毒性AOP為“否”)，共4種情況(表1)。

本研究采用2種方式評價此次毒性預測結果的準確性。(1)基于Jaccard相似系數原理(Jaccard similarity, Js)，通過計算“毒性PubChem”與“毒性AOP”二者相似度(公式1)，綜合“真陽性”與“真陰性”結果評價整體毒性預測率。Js數值在0%～100%，數值越高，此次基于AOP的化學物質整體毒性預測結果越準確。(2)但是，由于部分化學物質現有的毒性及體外生物測試數據不全以及AOP-KB中部分AOPs發展不完善，會造成毒性預測的“真陰性”結果。為更準確評價AOP對化學物質真實可引發的毒性的預測效果，有必要對“真陽性”結果進行單獨分析。本研究用“真陽性率”(true positive rate, TPR)(公式2)評價AOP對化學物質真實毒性的預測效果，TPR數值范圍為0%～100%，數值越高表明AOP對化學物質已明確的可真實引發的毒性預測越準確。

表1 毒性預測的4種結果Table 1 Four results of predication toxicity

(1)

(2)

式中：毒性PubChem表示PubChem數據庫內化學物質的毒性結果，毒性AOP表示基于有害結局路徑AOP預測的化學物質毒性結果，陽性毒性AOP表示基于AOP預測結果為陽性的毒性類型，陽性毒性PubChem表示在PubChem數據庫內報道的化學物質毒性為陽性的毒性類型，Js表示Jaccard相似系數，TPR表示真陽性預測率。

3）現代職業教育制度的擴大實驗。2010年，江蘇省印發《職業教育創新發展實驗區建設方案》，提出“推動建立現代職業教育制度，增強職業教育吸引力和發展能力。”2012年，貴州省出臺九大舉措，大力發展職業教育，其中一項是“探索建立完善現代職業教育制度”，在體系建設上，要求從學歷層次上完善職業教育體系建設，職業教育不再局限在中高職層次，而要打通從中等職業教育、高等職業教育、本科職業教育的立交橋政策；同時深化考試和招生改革，在專業、學校、層次等幾個方面擴大對口升學、對口招生的規模，從而從根本上增強職業教育的吸引力。

以PFOS為例，PubChem的數據表明PFOS可誘導多種毒性[32-38]。基于AOP框架預測PFOS可潛在引發包括“肝細胞癌變”(KE ID:1171)等40個AOs(圖2)，共包含11種毒性類型。因此，基于AOP方法預測了PFOS可潛在引發11種毒性類型，共覆蓋了90%的GHS健康危害(除“嚴重眼損傷/刺激”)，Js值及TPR值均為100%。

2 結果(Results)

聯合體外生物測試，建立基于AOP的高通量化學物質毒性預測方法，并對預測結果進行評價。我們將該部分研究成果呈現在“應用AOP”(application AOP, aAOP)網站(http://112.124.17.107:8000/#/)。

圖2 基于AOP框架的毒性預測結果評價：以PFOS為例注：STOT為特異性靶器官毒性，包括一次接觸/重復接觸。Fig. 2 Assessment of toxicity prediction based on AOP framework: Taking PFOS as an exampleNote: STOT is specific target organ toxicity, including single exposure and repeated exposure.

2.1 具有體外生物測試數據的MIE/AOP的分析

AOP-KB內有48個MIEs具有體外生物測試數據(共112種)，共對應66條AOPs及58個AOs，覆蓋了11種毒性類型(圖3(a))及90%的GHS健康危害(圖3(b))。其中屬于致癌/遺傳毒性、生殖毒性、消化系統毒性及內分泌干擾的AOPs、MIEs及體外生物測試數據數量最多。其相關AOPs數量分別為25、16、16和10，MIEs數量分別為23、14、15和8，體外生物測試數據數量分別為68、72、33和37。而屬于免疫毒性及血液循環系統毒性的AOPs、MIEs及體外生物測試數據數量最少，其數量均未超過4。58個AOs覆蓋的9種GHS健康危害中，特異性靶器官毒性、致癌、生殖毒性的AOPs、MIEs及體外生物測試數據數量最多，其相關AOPs數量分別為49、25和16，相關MIEs數量分別為58、63和14，相關體外生物測試數據數量分別為97、68和72。而與皮膚腐蝕/刺激、呼吸/皮膚過敏的健康危害相關的AOPs、MIEs及體外生物測試數據數量最少，其相關數量均未超過3。

AOP-KB所包含的毒性種類豐富(11種毒性類型)、GHS健康危害覆蓋度高(90%)，不同的毒性類型相關的AOP、MIE及體外生物測試數據的數量不同，后期基于AOP-KB的化學物質毒性預測結果可能產生毒性類型分布不均衡。

圖3 具有體外生物測試數據的MIEs/AOPs的毒性分析注：(a)毒性類型，(b) GHS健康危害；特異性靶器官毒性包括“一次接觸”與“重復接觸”。Fig. 3 Toxicity analysis of MIEs/AOPs with in vitro bioassays dataNote: (a) Type of toxicity, (b) Health hazard of GHS; specific target organ toxicity includes “single exposure” and “repeated exposure”.

2.2 化學物質體外生物測試結果分析

101個化學物質共有1 092種體外生物測試結果(圖4(a))，超過80%的測試結果為陰性，僅有不到20%的測試結果為陽性。化學物質的1 092種體外生物測試共包含25種生物靶點類型(圖4(b))，覆蓋了多個生物過程。其中生物靶點為核受體、與DNA結合、激酶、細胞因子的體外生物測試方法總數量及有活性的數量最多，平均每個化學物質有146個關于核受體的體外生物測試，其中有14個陽性測試結果。生物靶點為裂合酶、雜蛋白類、酯酶及水解酶的陽性測試結果不足30個，而甲基轉移酶的體外生物測試結果均為陰性，表明化學物質通過甲基轉移酶、裂合酶、雜蛋白類、酯酶及水解酶誘導有害結局的可能性較小。這25個生物靶點類型覆蓋了從細胞水平的生長、分化到生物個體的生長發育和性別分化等多個生物過程，為基于AOP對這101個化學物質進行毒性預測提供了豐富的體外生物靶點測試數據。

2.3 化學物質的毒性分析

圖4 101個化學物質生物測試結果注：(a) 101個化學物質體外生物測試活性陽性結果與陰性結果；(b) 101個化學物質體外生物測試的靶點信息。Fig. 4 Results of in vitro bioassays of 101 chemicalsNote: (a) Positive and negative in vitro bioassays of 101 chemicals; (b) Biotargets of in vitro bioassays for 101 chemicals.

化學物質的11種毒性類型預測結果中，共有374個“真陽性”結果，291個“真陰性”結果，312個“假陽性”結果，134個“假陰性”結果。整體毒性預測率(Js值)與真陽性毒性預測率(TPR值)分別達到59.9%與73.6%。在11種毒性類型中，生殖毒性與發育毒性的Js值最高，均超過了70%(圖5(b))，而急性毒性的Js值最低，為35.6%(圖5(b))。致癌/遺傳毒性、生殖毒性及消化系統毒性的TPR值最高，均超過了70%(圖5(b))，神經毒性的TPR值最低，僅為1%(圖5(b))。134個“假陰性”結果與312個“假陽性”結果均覆蓋了11種毒性類型，內分泌干擾(23個)與泌尿毒性(22個)的“假陰性”結果最多，急性毒性(63個)與神經毒性(46個)的“假陽性”結果最多。

基于AOP，可對101種化學物質的11種毒性類型進行預測，不同的化學物質及毒性類型的整體毒性預測率(Js值)與真陽性預測率(TPR值)不同。造成這一差異的主要原因是：(1)化學物質之間的體外生物測試(陽性)數據數量存在差異；Js值與化學物質生物測試(陽性)數據數量呈正相關但不顯著(P>0.30,r=0.100，圖5(c))，TPR值與化學物質生物測試(陽性)數據數量呈顯著正相關(P<0.01,r=0.293，圖5(c))；(2)AOP-KB內描述不同毒性類型的AOPs、MIEs及相應體外生物測試數據數量不同；不同毒性類型的Js值與該類型毒性的AOPs數量(P>0.10,r=0.432，圖5(d))、MIEs數量(P>0.10,r=0.481，圖5(d))、體外生物測試數據數量(P>0.10,r=0.436，圖5(d))成正相關但不顯著；不同毒性類型的TPR值與該類型毒性的AOPs數量(P<0.02,r=0.685，圖5(d))、MIEs數量(P<0.01,r=0.734，圖5(d))、體外生物測試數據數量(P<0.01,r=0.752，圖5(d))呈顯著正相關。

圖5 101個化學物質的毒性預測結果與分析注：(a) 101種化學物質毒性預測結果；(b) 11種毒性類型的Js值及TPR值；(c) 化學物質的Js值、TPR值與其體外生物測試結果(陽性)相關性；(d) 11毒性類型的Js值、TPR值與其在AOP-KB中相關的MIEs、AOPs及體外生物測試結果(陽性)數量的相關性；A，急性毒性；B，生殖毒性；C，發育毒性；D，致癌/遺傳毒性；E，消化系統毒性；F，內分泌干擾；G，泌尿毒性；H，血液循環毒性；I，呼吸毒性；J，免疫毒性；K，神經毒性；Js是Jaccard相似系數，TPR是真陽性預測率。Fig. 5 Results and analysis of prediction of toxicity for 101 chemicalsNote: (a) Toxicity prediction results of 101 chemicals; (b) Js and TPR value of 11 toxicity types; (c) The correlation between Js/TPR value and counts of in vitro bioassays (positive) of 101 chemicals; (d) The correlation between Js/TPR and counts of MIEs, AOPs and in vitro bioassays (positive) in AOP knowledge base; A, Acute toxicity; B, Reproductive toxicity; C, Developmental toxicity; D, Carcinogenic/genotoxicity; E, Digestive system toxicity; F, Endocrine disruption; G, Urinary toxicity; H, Blood circulation toxicity; I, Respiratory toxicity; J, Immunotoxicity; K, Neurotoxicity; Js is Jaccard similarity, and TPR is true positive rate.

3 討論(Discussion)

本研究建立了基于AOP、聯合ToxCast體外生物測試數據的化學物質毒性預測方法，并對預測結果進行了評價。我們發現101個化學物質可潛在引發58種AOs，包含11種毒性類型，共覆蓋90%的GHS健康危害，此次整體毒性預測率(Js值)和真陽性毒性預測率(TPR值)分別達到59.9%和73.6%。

定性AOP實現了對所選化學物質的多種毒性終點的預測，而傳統數據驅動(如QSAR、交叉參照等)的方法往往局限于少數特定的毒性終點。本研究基于AOP的毒性預測方法的Js值最高可達84.2%，發育毒性、生殖毒性及消化系統毒性的Js值均超過70%。而此次預測結果的致癌/遺傳毒性的TPR值最高，為84.4%，生殖毒性及消化系統毒性的TPR值也超過了70%(圖5(b))。現有的基于數據驅動的對化學物質的毒性預測應用中，雖然實現了高通量預測，但單組模型往往只能針對特定毒性或毒作用模式進行預測。Mansouri等[39]使用QSAR的方法，建立化學物質的雄激素受體結合模型，預測化學物質的內分泌干擾效應，其預測準確率超過80%。Russo等[40]通過交叉參照，對600余種化學物質的大鼠經口急性毒性進行預測，真陽性預測率為76%。本研究結果表明相較于慢性毒性，急性毒性的TPR值較低，僅為30%。這是由于急性毒性可能是多個毒性效應累加共同作用的結果，而一般的慢性毒性都有可檢測的KEs。如Angrish等[41-43]通過多年研究發現β腎上腺素受體、PPARα/g等受體激活是引發非酒精性脂肪肝炎的KEs。這表明相較于短期高劑量暴露下引發的急性致死，機制驅動的AOP可更好地反映長期低劑量暴露引發的慢性毒性的致毒機制。針對不同的毒性類型，AOP預測的TPR值與化學物質的體外生物測試數據數量、AOP-KB內不同毒性類型的體外生物測試/MIE/AOP數量均呈顯著正相關(P<0.02，r>0.290)(圖5(d))。這是因為TPR反映的是AOP對化學物質真實可引發毒性的預測準確性，針對AOP-KB內體外生物測試/MIE/AOP越多的化合物毒性，預測結果越準確。這一結果也表明在AOP的化學物質毒性預測應用中，可通過豐富化學物質的體外生物測試靶點，增加化學物質體外生物測試數據數量，開發不同毒性類型的AOP及不同生物靶點的MIE來提高毒性預測的真陽性率。如，PubChem顯示101種化學物質中共有47種化學物質具有神經毒性，但AOP僅對其中的2種進行了識別(圖5(a))。在比較毒理基因組數據庫(Comparative Toxicogenomics Database, CTD; https://ctdbase.org/)中，與神經毒性相關性最強的排名前五的生物分子靶點為FOS原癌基因(Fosproto-oncogene,FOS)、B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma 2, BCL2)、白細胞介素(Interleukin 1β, IL1β)、AChE和淀粉樣前蛋白(amyloid precursor protein, APP)。在AOP-KB中，共有31條AOPs與神經毒性相關，主要通過與AChE和5-羥色胺(serotonin)作用來誘導神經毒性。但在ToxCast內，僅有化學物質的AChE及5-羥色胺的生物測試數據。為提高基于AOP的神經毒性真陽性預測率，可增測化學物質的FOS、BCL2和IL1β等生物靶點，并開發以這些生物靶點為KEs的測試方法。完善AOP-KB(開發不同毒性的MIE/KE/AO，增加MIE的體外生物測試)，擴充化學物質的體外生物測試靶點種類及數量，提高基于AOP的毒性預測率。

聯合體外生物測試、定性AOP可預測化學物質未被報道但有潛力引發的毒性，并提供可能的機制信息。101種化學物質被預測可能引發共134種未被報道的毒性效應，覆蓋了11種毒性類型(圖5(a))，其中消化系統毒性和泌尿系統毒性是2種目前未被報道但可被AOP預測的數量最多的毒性類型，均超過了20種。雖然，該結果可能是因為化學物質激活MIE后，其時間/劑量-效應不足以引發AO而產生“假陽性”現象，但是也反映了基于AOP可在早期低劑量暴露下預測化學物質的潛在毒性效應。例如，氟氯氰菊酯(CAS RN:68359-37-5)是全球使用最廣泛的農藥之一，具有消化系統毒性、內分泌干擾和神經毒性等[44-45]。尚無研究報道氟氯氰菊酯是否可對生物的血液循環系統產生致癌作用。基于AOP的化學物質毒性預測結果表明，氟氯氰菊酯的“NVS_NR_hPPARg”與“ATG_PPARg_TRANS_up”生物測試結果為陽性，氟氯氰菊酯可活化PPARg。這表明氟氯氰菊酯有通過引發“激活特異性核受體”(KE ID:1028)，誘導“PPARg活化引發血管肉瘤”(AOP ID:163)，最終引發有害結局“血管肉瘤的生成”(KE ID:1037)的可能。以上證據表明，氟氯氰菊酯具有誘導生物血管肉瘤生成的風險，其可能的致毒機制為通過激活PPARg、促進生長因子分泌及間充質細胞增殖。另一方面，考慮到真實暴露場景下，MIE被激活后，需要一定劑量脅迫及持續時間才可能引發AO。可結合qAOP，可進一步探討MIE與AO之間的時間/劑量-效應關系，解決基于AOP的化學物質毒性預測結果中的“假陽性”問題，提高毒性預測準確率。

基于AOP的化學物質計算毒理學方法可在未來提高我國化學物質環境風險評估的效率和水平。我國生態環境部在2019年發布的《化學物質環境風險評估技術方法框架性指南(試行)》提出在重點識別化學物質的致癌性、致突變性、生殖發育毒性、重復劑量毒性等慢性毒性以及致敏性等健康危害時可以使用計算毒理學數據[46]。本研究在預測致癌/遺傳毒性、生殖毒性方面的真陽性預測率均超過了70%。以生殖毒性為例，目前已有11個生殖毒性相關的MIEs具有高通量invitro測試方法。在未來，如果同時考慮MIE和對應的KE，并由此開展多靶點的invitro項目測試有助于提高基于AOP的化學物質毒性預測的準確率。

新型測試方法如組學方法的建立可大幅提高識別化學物質的分子靶標的能力。與單一生物靶點的invitro體外生物測試相比，高通量組學測試可反映化學物質脅迫下的所有生物響應[47]，目前以基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組為代表的組學方法已經在化學物質毒性研究中得到廣泛應用[48]。盡管ToxCast體外測試已經涵蓋了700余種測試靶點，但與生物體潛在作用靶點相比還比較有限。而且這些測試靶點大部分集中于生殖、內分泌和致癌性方面，這導致基于現有的體外生物測試數據的毒性預測結果具有一定的局限性。這也是本研究中針對神經毒性、呼吸毒性和血液循環系統毒性等的TPR值比較低的原因。后續可通過組學測試增加化學物質體外生物測試靶點，以提高聯合體外生物測試數據、基于AOP的化學物質的毒性預測準確性。

此外，基于AOP的計算毒理學策略可用于對化學物質的分層測試(tiered test)和風險評估。環境管理部門很早意識到動物毒性試驗在化學物質毒性評估上的局限性，動物試驗不僅成本高、耗時長，且高劑量暴露的動物測試與人體暴露相關性差。而單一的替代性方法，invitro或計算模型(insilico)往往僅強調特定的危害信息，不夠全面。因此綜合應用高通量測試、組學測試和計算模型等信息的策略對化學物質進行分層測試，即根據第一步測試的結果，決定下一步必須進行的測試。這極大地減少了動物的使用量，縮短了化學物質危害識別的時間，提高了化學物質風險評估的效率[49]。在未來，可將基于AOP的計算毒理學方法應用于設計化學物質的分層測試與風險評估策略。

綜上，本研究建立了基于AOP、聯合ToxCast體外測試數據的化學物質毒性預測方法，通過與PubChem內已報道的化學物質毒性比較，對毒性預測結果進行評價。結果表明，聯合體外生物測試，AOP框架有潛力實現化學物質的多類型毒性預測。我們建議可通過(1)聯合高通量組學測試等方法，增加化學物質體外測試的生物靶點種類及數量；(2)完善AOP-KB，開發不同毒性類型的AOP及不同生物靶點的MIE；(3)結合并開發qAOP，模擬真實暴露場景的時間/劑量-效應關系，減少預測的“假陰性”結果；(4)結合數據驅動(如QSAR、交叉參照、人工神經網絡等)，對未經生物測試的化學物質進行毒性預測，提高基于AOP的化學物質高通量毒性預測的適用范圍及預測結果準確性。

通訊作者簡介：張效偉(1978—)，男，博士，教授，博士生導師，主要研究方向為生態毒理學和健康風險評估。